Name: cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line
Uploaded: 2022-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line at JoVE.com

B.A-C ממומן על ידי מענקי משרד המדע והחדשנות הספרדי (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), על ידי הקהילה האוטונומית של מדריד (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057), ומענקי MICINN (PID2020-113270RA-I00). R. A-P ממומן על ידי הקהילה האוטונומית של מדריד (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. ממומן על ידי אגודת מקס פלנק, פרס חוקר מתקדם מטעם המועצה האירופית למחקר (מענק 743216), DFG CRC 1080: מנגנונים מולקולריים ותאיים של הומאוסטזיס עצבי, ו- DFG CRC 902: עקרונות מולקולריים של ויסות מבוסס RNA. אנו מודים ל- D.C Dieterich ו- P. Landgraf על הייעוץ הטכני שלהם ועל הסינתזה של שעון הקיץ-אלקין. אנו מודים ל- E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast, ולמתקן החיות של MPI לחקר המוח על תמיכתם המצוינת. אנו מודים לסנדרה גבלס על שיתוף קו העכבר Nex-Cre. אנו מודים לאנטוניו ג 'קרוג'יו על עזרתו בעריכה באנגלית. B.A-C. תכננו, ערכו ונותחו ניסויים. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E., ו- S. t. ד. ערך וניתח ניסויים. B.A-C ו-E.M.S. תכננו ניסויים, ופיקחו על הפרויקט, B.A-C כתבו את המאמר. כל המחברים ערכו את המאמר.

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו באישור משרדי הממשלה המקומיים בגרמניה (RP Darmstadt; פרוטוקולים: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) או ספרד (הוועדה לניסויים בבעלי חיים ב- UCM וייעוץ סביבתי של Comunidad de Madrid, מספר פרוטוקול: PROEX 005.0/21) והם תואמים לכללי אגודת מקס פלנק ולתקנות הספרדיות ופועלים לפי הנחיות האיחוד האירופי ...

<ol>
	<li>Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+synaptic+protein+turnover.">The regulation of synaptic protein turnover.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).</li><li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+protein+synthesis,+synaptic+plasticity,+and+memory.">Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory.</a> Cell. 127 (1), 49-58 (2006).</li><li>Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+dynamics+during+homeostatic+scaling+in+cultured+neurons.">Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons.</a> Elife. 9, 52939 (2020).</li><li>Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+in+mice+as+affected+by+intracerebral+puromycin.">Memory in mice as affected by intracerebral puromycin.</a> Science. 141 (3575), 57-59 (1963).</li><li>Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling,+detection+and+identification+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).</li><li>Alvarez-Castelao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).</li><li>Ngo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-selective+metabolic+labeling+of+proteins.">Cell-selective metabolic labeling of proteins.</a> Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).</li><li>Mahdavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+aminoacyl-tRNA+synthetase+for+cell-selective+analysis+of+mammalian+protein+synthesis.">Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).</li><li>Yuet, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+proteomic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).</li><li>Patel, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+labeling+and+label-free+mass+spectrometry-based+proteomics+approaches.">A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches.</a> Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).</li><li>Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazo+transfer.">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).</li><li>Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BONCAT:+Metabolic+labeling,+click+chemistry,+and+affinity+purification+of+newly+synthesized+proteomes.">BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, 199-215 (2015).</li><li>Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins+by+immunoblotting.">Analysis of proteins by immunoblotting.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).</li><li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAPome:+a+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data.">The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).</li><li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li><li>Goebbels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+targeting+of+principal+neurons+in+neocortex+and+hippocampus+of+NEX-Cre+mice.">Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice.</a> Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).</li><li>van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+thiol-yne+addition+improves+the+specificity+of+strain-promoted+azide-alkyne+cycloaddition.">Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).</li><li>O'Fagain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilization+of+proteins.">Lyophilization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 244, 309-321 (2004).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+trapping+(S-Trap)+is+compatible+with+typical+protein+extraction+buffers+and+detergents+for+bottom-up+proteomics.">Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).</li><li>tom Dieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+newly+synthesized+target+proteins+in+situ.">Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ.</a> Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).</li><li>McShane, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+protein+stability+reveals+age-dependent+degradation.">Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation.</a> Cell. 167 (3), 803-815 (2016).</li><li>Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+non-canonical+amino+acids+into+the+developing+murine+proteome.">Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome.</a> Scientific Reports. 6, 32377 (2016).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUnSET,+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis.">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioID:+A+screen+for+protein-protein+interactions.">BioID: A screen for protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).</li></ol>

ההיבטים הקריטיים של הפרוטוקול הם; הכללת בקרות שליליות, שיש מספיק שכפולים ביולוגיים, מסלול ניהול ANL, כמות ומשך, אלקילציה של הדגימות, ריכוז אלקין, וחיסול β-מרקפטואתנול בעת שימוש ב- DST-alkyne.
המפתח הוא לכלול דגימות בקרה שליליות הנובעות מבעלי חיים המסומנים ב-ANL ללא נהג Cre ולכן ללא ביט...

הומאוסטזיס של חלבון Aberrant נגרמת על ידי חוסר איזון בסינתזת חלבונים והשפלה. מספר מחלות קשורות לשינויים בהומאוסטזיס חלבונים. סימן ההיכר של מחלות מסוימות הוא נוכחות של אגרגטים במקומות תת-תאיים שונים ובאזורי מוח. הומאוסטזיס של חלבונים לא רק חשוב במחלות, אלא גם ממלא תפקיד מכריע בתפקוד תקין של איברים ותאים1. לדוגמה, סינתזת חלבונים נחוצה לצורות רבות של פלסטיות עצבית2,3, כפי שנקבע על ידי שימוש במעכבים כימיים החוסמים את סינתזת החלבון4. עם זאת, לא ברור באילו סוגי תאים הפרוטאום משתנה כדי לתמוך בלמידה ובזיכרון, וגם לא מובן אילו חלבונים ספציפיים בכל סוג תא מגבירים או יורדים בסינתזה או בהתפרקות שלהם. לפיכך, מחקר מקיף של הומאוסטזיס חלבונים דורש את היכולת להבדיל פרוטאומים המגיעים מסוגי תאים ספציפיים. ואכן, זיהוי פרוטאומים ספציפיים לסוג התא כדי לחקור תהליכים תאיים המתרחשים בסביבה רב-תאית היה מכשול חשוב בפרוטאומיקה. מסיבה זו, פיתחנו טכניקה המשתמשת בביטוי MetRS* בשילוב עם שיטות ביו-אורתוגונליות שהוכחה כדרך יעילה לזהות ולטהר פרוטאומים ספציפיים מסוג תא, ולמלא את הפער הזה 5,6,7.
הביטוי של MetRS* מוטנטי (MetRS L274G) מאפשר טעינה של ה-ANL האנלוגי הלא-קנוני מתיונין לתוך ה-tRNA 8,9 המתאים ושילובו לאחר מכן בחלבונים. כאשר ביטוי MetRS* מווסת על ידי מקדם ספציפי לסוג התא, חומצת האמינו הלא-קנונית תשולב בחלבונים באופן סלקטיבי של התא. ברגע ש-ANL משולב בחלבונים, הוא יכול לתפקד באופן סלקטיבי על ידי כימיה של קליקים ולאחר מכן על ידי הדמיה (FUNCAT) או על ידי Western Immunoblot (BONCAT). לחלופין, חלבונים יכולים להיות מטוהרים באופן סלקטיבי ומזוהים על ידי ספקטרומטריית מסה (MS). באמצעות טכנולוגיה זו, יצרנו קו עכבר המבטא את החלבון MetRS* תחת שליטה של רקומבינאז Cre. בהתחשב במספר ההולך וגדל של קווי Cre-mouse הזמינים, ניתן להשתמש במערכת MetRS* בכל תחום כדי לחקור כל סוג תא מכל רקמה שעבורה קיים קו Cre. תיוג חלבונים עם ANL אפשרי במבחנה או in vivo, ואינו משנה את התנהגות העכבר או את שלמות החלבון6. ניתן להתאים את זמן התיוג לשאלה המדעית של כל חוקר, לתייג חלבונים מסונתזים חדשים (זמני תיוג קצרים יותר) או פרוטאומים שלמים (זמני תיוג ארוכים יותר). השימוש בטכניקה זו מוגבל על ידי מספר התאים מהסוג שהחוקר מוכן ללמוד; מכאן שבידוד חלבונים מסוגי תאים עם מספרים נמוכים או קצבי חילוף חומרים נמוכים אינו אפשרי בשיטה זו. מטרת השיטה המוצגת היא לזהות חלבונים/פרוטאומים ספציפיים לסוג התא המסומנים in vivo. בפרוטוקול זה אנו מתארים כיצד לתייג פרוטאומים ספציפיים לתאים עם ANL בעכברים חיים ולטהר את החלבונים המסומנים. לאחר הטיהור, ניתן לזהות חלבונים על ידי פרוטוקולים שגרתיים של ספקטרומטריית מסה 5,10. הפחתת מורכבות הדגימה המושגת בשיטה זו על ידי טיהור סלקטיבי של חלבונים מאוכלוסיות תאים ספציפיות מאפשרת לנסיין לזהות שינויים עדינים בפרוטאומים, למשל, בתגובה לשינויים סביבתיים. טיהור החלבונים המסומנים יכול להיות מושג תוך ~ 10 ימים, לא כולל ניתוח הטרשת הנפוצה או תקופת התיוג. במאמר זה נתאר שתי שיטות למתן ANL ל-MetRS* המבטאות עכברים, כלומר (1) הוספת חומצת האמינו במי השתייה, ו-(2) החדרת ANL באמצעות זריקות תוך-צפקיות. ללא קשר לשיטה שנבחרה לניהול NAL, שלבי הבידוד והטיהור זהים (משלב 2 ואילך).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12% Acrylamide gels</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL-HCl</td>
			<td>IrishBotech</td>
			<td>HAA1625.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin alkyne</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>B10185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken antibody anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Toxic; use a lab coat and gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (I) bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>254185</td>
			<td>99.999% (wt/wt)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disulfide tag (DST)-alkyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Merk</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodo acetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti chicken 800</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 800CW</td>
			<td>Donkey anti-Chicken Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti rabit 680</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 680RD</td>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Mixer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4259</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutrAvidin beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>29200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>J62036.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X pH 7.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation described in reference number 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD SpinTrap G-25 columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>23225</td>
			<td>Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-biotin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE&#160; Running buffer MOPS</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>M00138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table automatic Vortexer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Mixmate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triazole ligand</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line

הבנת הומאוסטזיס של חלבונים in vivo היא המפתח לדעת כיצד התאים פועלים הן במצב פיזיולוגי והן במצב של מחלה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר תיוג in vivo וטיהור לאחר מכן של חלבונים מסונתזים חדשים באמצעות קו עכברים מהונדס כדי לכוון את תיוג החלבונים לאוכלוסיות תאיות ספציפיות. זהו קו אינדוקטיבי על ידי ביטוי Cre recombinase של L274G-מתיונין tRNA synthetase (MetRS*), המאפשר שילוב אזידונורלאוצין (ANL) לחלבונים, אשר אחרת לא יתרחש. באמצעות השיטה המתוארת כאן, ניתן לטהר פרוטאומים ספציפיים לסוג התא המסומנים in vivo ולזהות שינויים עדינים בתכולת החלבון עקב הפחתת מורכבות הדגימה.

בעקבות הפרוטוקול המתואר (המסוכם באיור 1), ANL ניתן לעכברים על ידי זריקות תוך-צפקיות יומיות (400 mM ANL 10 mL/kg, Nex-Cre::MetRS*) במשך 7 ימים, או באמצעות מי שתייה (0.7% מלטוז, 1% ANL, CamkII-Cre::MetRS*) במשך 21 יום. לאחר התיוג, אזורי המוח המתאימים נותחו, שכבו, הושאלו ונלחצו. תגובות הקליק נותחו על ...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line at JoVE.com

Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע תיוג חלבונים ספציפיים לסוג התא עם אזידונורלאוצין (ANL) באמצעות קו עכבר המבטא מוטציה L274G-מתיונין tRNA synthetase (MetRS*) ואת השלבים הדרושים לבידוד חלבונים ספציפיים לסוג התא המסומנים. אנו מתארים שני מסלולי מתן ANL אפשריים בעכברים חיים על ידי (1) מי שתייה ו-(2) זריקות תוך-צפקיות.

טיהור וזיהוי חלבונים ספציפיים מסוג תא מרקמות מורכבות באמצעות קו עכברים מוטנטי מתיונין tRNA Synthetase

Understanding protein homeostasis in vivo is key to knowing how the cells work in both physiological and disease conditions. The present protocol ...

פרוטוקול זה מאפשר לתייג חלבונים באופן ספציפי לסוג התא. זוהי הטכניקה הראשונה המציעה אפשרות כזו וזה יכול להיעשות in vitro או in vivo. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא כי חלבונים ספציפיים סוג התא מסומן ניתן לטהר לא מזוהה, או לדמיין באתרו על ידי immunofluorescent.כדי להתחיל להכין את הרקמה lysate על ידי הוספת חיץ ליזיס בנפח של 12 עד 15 פעמים את המשקל הרטוב של הרקמה ו triturate את הרקמה עד שהוא הומוגני. מחממים את ההומוגנט הזה במשך 15 דקות עד 75 מעלות צלזיוס כדי לנטרל את החלבון ואז עושים צנטריפוגה של הדגימה ומעבירים את הסופר-נטנט לצינור חדש. מדגם זה יכול להיות מאוחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, עבור אלקילציה לדלל את הדגימה ההומוגנית פעמיים עד שלוש במאגר מלח פוספט המכיל מעכב פרוטאז ללא EDTA. לאחר מכן מוסיפים יודואצטמיד טרי לריכוז סופי של 20 מילימולים. השאירו את הדגימה למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס בחושך.חזור על תוספת היודואצטמיד ושלבי הדגירה פעמיים. הכן את העמודה בהתאם להוראות היצרן על ידי מערבולת ראשונה של העמודות. לאחר מכן הסרת המכסה חותך את החלק התחתון וצנטריפוגה אותם.לאחר מכן, בצע חילופי חיץ על-ידי שיווי משקל תחילה של עמודות חילופי המאגר באמצעות מאגר חילופי הכימיה של הלחיצה ולאחר מכן החלפת כל הדגימות האלקיליות. כדי להעריך את שילוב azidonorleucine לקחת 40 microliters של הדגימה רמז ולהוסיף חיץ מלח פוספט לנפח הסופי של 120 microliters. לאחר מכן הגדר את תגובת הכימיה של הקליק על ידי מערבולת התגובה למשך 20 שניות.לאחר הוספת כל מגיב בסדר המצוין מהר ככל האפשר, לדגור את הדגימות בחושך בארבע מעלות צלזיוס לילה עם סיבוב רציף. למחרת צנטריפוגה את הדגימות במשך חמש דקות ב 17, 000 פעמים G לאחר צנטריפוגה גלולה מעט טורקיז יהיה גלוי. מעבירים את הסופרנטנט לצינור חדש ומאחסנים את הדגימה בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס.לטיהור חלבון מתויג. הכפיף את כל הדגימות להליך חילופי חיץ כפי שהוכח כדי לנקות שאריות של אלקין חופשי באמצעות חיץ מחייב neutravidin כמאגר שיווי המשקל. לאחר מכן לשטוף את חרוזי neutravidin קיבולת גבוהה שלוש פעמים על ידי ערבוב החרוזים עם מאגר הכריכה.צנטריפוגה התערובת, להשליך את supernatant ולחזור על זה שלוש פעמים. לאחר מכן הכינו סלורית אחד לאחד על ידי הוספת אותו נפח של חרוזים יבשים של נויטרווידין וחיץ קשירה של נויטרווידין. מניחים בצד 20 עד 40 מיקרוליטרים מכל דגימה כליזט מטוהר מראש ומאחסנים אותה במינוס 20 מעלות צלזיוס.לאחר מדידת ריכוז החלבון של הדגימה מערבבים מיליגרם אחד של חלבון עם 40 מיקרוליטר של חרוזים. דגירה של התערובת במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב רציף המאפשר לחלבונים המסומנים להיקשר לחרוזים. ביום המחרת לאסוף את supernatant על ידי צנטריפוגה.מניחים 20 עד 40 מיקרוליטר אליקוט של הסופרנטנט בצד לניתוח מאוחר יותר ומקפיאים את השאר במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף את החרוזים שלוש פעמים על ידי הוספת חיץ נויטרווידין צונן אחד. שקיעת החרוזים והשלכת הסופר-נטנט.לאחר מכן מוסיפים את אותו חיץ ומדגרים את החרוזים במשך 10 דקות תחת סיבוב רציף בארבע מעלות צלזיוס לפני השלכת הסופרנטנט. חוזרים על הכביסה עם מאגרי שטיפת נויטרווידין שניים ושלושה, ומחממים את החלבונים שנלחצו על ידי דגירה של החרוזים במשך 30 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עם נפח של מאגר אלוטיון נויטרווידין, המתאים לנפח אחד של החרוזים היבשים המשמשים. במהלך ההדחה, שמרו על החרוזים במתלים בקצב של 1000 סיבובים לדקה בשייקר בלוק תרמי חמקמק פעמיים ושלבו את שני האלוטות.תגובות הקליק נותחו על ידי דף SDS וכתם חיסוני מערבי. תמונות מייצגות של הניסויים מוצגות למתן אזידונורלאוצין על ידי הזרקה תוך פריטוניאלית ולמתן אזידונורלאוצין באמצעות מי שתייה. ניסוי נוסף מספק דוגמה לקביעת ריכוז האלקין האופטימלי של ביוטין דיסולפיד.בדוגמה זו, שינוי הקיפול בין הדגימה המסומנת לבין הבקרה הוא הגבוה ביותר בריכוז אלקיין של 14 מיקרומולר. דוגמה לתוצאת ספקטרומטריית מסות עם העשרה ברורה בדגימה המסומנת באזידונורלאוצין בהשוואה לבקרה מוצגת כאן. הבדל זה כבר נראה בכתם החלבון הכולל.מלבד שינויים בעוצמת הפפטידים ישנם גם חלבונים ייחודיים שנמצאים בשתי הדגימות. זהו פרוטוקול מורכב מבחינה טכנית ויש לעקוב אחריו בזהירות באמצעות אלקילציה נכונה של בקרות שליליות, תקינה (לא ברורה) וניקוי הולם של ארכיון ללא קליקים. הצעדים המרכזיים שלנו בפרוטוקול זה, חלבונים מטוהרים יכולים להיות מזוהים על ידי ספקטרומטריית מסה אם מעניין את החוקרים לחקור חלבונים או לטעון אותם לג'ל לחקר חלבונים בעלי עניין על ידי כתם מערבי.היכולת של שיטה זו לתייג חלבונים ממקור תאי מסוים יש הרבה יישומים כגון מתח של חלבונים או מחקר של סינתזת חלבונים במבחנה או in vivo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

הכנת Synaptoneurosomes מ - עכבר Cortex באמצעות צבע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

בידוד LacZ-להביע תאים פנימית עכבר רקמות האוזן באמצעות זרימת cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

בידוד וכימות של טוקסין עצבי ממטריצות מורכבות באמצעות מטריקס מבחני BoTest

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

ביטוי גנים מסוג התא ספציפי באמצעות סלולארי קרינה המופעל מיון לבדיקת רקמות במוח החולדה

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Purification of Mouse Brain Vessels

טיהור של כלי מוח עכבר

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

עירור החיצוני של הנוירונים באמצעות שדות חשמליים ומגנטיים ב אחד&quot; ותרבויות דו ממדים

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

בידוד Immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

לכימות ההתפלגות הטרוגנית של חלבון סינפטיים במוח העכבר בעזרת Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

טיהור של Prominin-1+ בתאי גזע מתוך עכבר המוח פוסט לידתיים

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...