Name: cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line
Uploaded: 2022-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line at JoVE.com

B.A-C è finanziato dal Ministero spagnolo della Scienza e dell'Innovazione (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), dalla Comunità autonoma di Madrid (Atracción de Talento-2019T1 / BMD-14057) e dalle sovvenzioni MICINN (PID2020-113270RA-I00). R. A-P è finanziato dalla Comunità autonoma di Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. è finanziato dalla Max Planck Society, un premio Advanced Investigator del Consiglio europeo della ricerca (grant 743216), DFG CRC 1080: Molecular and Cellular Mechanisms of Neural Homeostasis, e DFG CRC 902: Molecular Principles of RNA-based Regulation. Ringraziamo D.C Dieterich e P. Landgraf per la loro consulenza tecnica e la sintesi del DST-Alchine. Ringraziamo E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast e la struttura animale dell'MPI for Brain Research per il loro eccellente supporto. Ringraziamo Sandra Goebbels per aver condiviso la linea di mouse Nex-Cre. Ringraziamo Antonio G. Carroggio per il suo aiuto con l'editing in inglese. B.A-C. progettato, condotto e analizzato esperimenti. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. e S. t. D. ha condotto e analizzato esperimenti. B.A-C e E.M.S. progettarono esperimenti e supervisionarono il progetto, B.A-C scrisse il documento. Tutti gli autori hanno curato l'articolo.

Tutti gli esperimenti con gli animali sono stati eseguiti con il permesso degli uffici governativi locali in Germania (RP Darmstadt; protocolli: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) o Spagna (Comitato di esperimenti sugli animali presso l'UCM e consulenza ambientale della Comunidad de Madrid, numero di protocollo: PROEX 005.0/21) e sono conformi alle regole della Max Planck Society e ai regolamenti spagnoli e seguono le linee guida dell'UE per il benessere degli animali.
1. ...

<ol>
	<li>Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+synaptic+protein+turnover.">The regulation of synaptic protein turnover.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).</li><li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+protein+synthesis,+synaptic+plasticity,+and+memory.">Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory.</a> Cell. 127 (1), 49-58 (2006).</li><li>Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+dynamics+during+homeostatic+scaling+in+cultured+neurons.">Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons.</a> Elife. 9, 52939 (2020).</li><li>Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+in+mice+as+affected+by+intracerebral+puromycin.">Memory in mice as affected by intracerebral puromycin.</a> Science. 141 (3575), 57-59 (1963).</li><li>Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling,+detection+and+identification+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).</li><li>Alvarez-Castelao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).</li><li>Ngo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-selective+metabolic+labeling+of+proteins.">Cell-selective metabolic labeling of proteins.</a> Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).</li><li>Mahdavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+aminoacyl-tRNA+synthetase+for+cell-selective+analysis+of+mammalian+protein+synthesis.">Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).</li><li>Yuet, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+proteomic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).</li><li>Patel, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+labeling+and+label-free+mass+spectrometry-based+proteomics+approaches.">A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches.</a> Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).</li><li>Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins+by+immunoblotting.">Analysis of proteins by immunoblotting.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).</li><li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAPome:+a+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data.">The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).</li><li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li><li>Goebbels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+targeting+of+principal+neurons+in+neocortex+and+hippocampus+of+NEX-Cre+mice.">Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice.</a> Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).</li><li>van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+thiol-yne+addition+improves+the+specificity+of+strain-promoted+azide-alkyne+cycloaddition.">Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).</li><li>O'Fagain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilization+of+proteins.">Lyophilization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 244, 309-321 (2004).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+trapping+(S-Trap)+is+compatible+with+typical+protein+extraction+buffers+and+detergents+for+bottom-up+proteomics.">Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).</li><li>tom Dieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+newly+synthesized+target+proteins+in+situ.">Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ.</a> Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).</li><li>McShane, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+protein+stability+reveals+age-dependent+degradation.">Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation.</a> Cell. 167 (3), 803-815 (2016).</li><li>Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+non-canonical+amino+acids+into+the+developing+murine+proteome.">Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome.</a> Scientific Reports. 6, 32377 (2016).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUnSET,+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis.">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioID:+A+screen+for+protein-protein+interactions.">BioID: A screen for protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).</li></ol>

Gli aspetti critici del protocollo sono; l'inclusione di controlli negativi, avere abbastanza repliche biologiche, via di somministrazione di ANL, quantità e durata, alchilazione dei campioni, concentrazione di alchine ed eliminazione del β-mercaptoetanolo quando si utilizza DST-alchini.
È fondamentale includere campioni di controllo negativi provenienti da animali marcati con ANL senza driver Cre e quindi senza espressione MetRS*. Questi campioni devono essere sottoposti a ogni fase descri...

L'omeostasi delle proteine aberranti è causata da uno squilibrio nella sintesi e nella degradazione delle proteine. Diverse malattie sono correlate ad alterazioni nell'omeostasi proteica. Il segno distintivo di alcune malattie è la presenza di aggregati in diverse posizioni subcellulari e aree cerebrali. L'omeostasi proteica non è importante solo nella malattia, ma svolge anche un ruolo cruciale nella normale funzione degli organi e delle cellule1. Ad esempio, la sintesi proteica è necessaria per molte forme di plasticità neuronale2,3, come determinato dall'uso di inibitori chimici che bloccano la sintesi proteica4. Tuttavia, non è chiaro in quali tipi cellulari il proteoma sia alterato per supportare l'apprendimento e la memoria, né si capisce quali proteine specifiche in ciascun tipo di cellula aumentano o diminuiscono nella loro sintesi o degradazione. Pertanto, uno studio completo dell'omeostasi proteica richiede la capacità di differenziare i proteomi provenienti da specifici tipi di cellule. In effetti, l'identificazione di proteomi specifici del tipo di cellula per studiare i processi cellulari che si verificano in un ambiente multicellulare è stato un ostacolo importante nella proteomica. Per questo motivo, abbiamo sviluppato una tecnica che utilizza l'espressione di MetRS* combinata con metodi bio-ortogonali che si è dimostrata un modo efficace per identificare e purificare proteomi specifici del tipo cellulare, colmando questa lacuna 5,6,7.
L'espressione di un mutante MetRS* (MetRS L274G) permette il caricamento dell'analogo non canonico della metionina ANL nel corrispondente tRNA 8,9 e la sua successiva incorporazione nelle proteine. Quando l'espressione di MetRS* è regolata da un promotore specifico del tipo di cellula, l'amminoacido non canonico sarà incorporato nelle proteine in modo selettivo cellulare. Una volta che l'ANL è incorporato nelle proteine, può essere funzionalizzato selettivamente mediante click-chemistry e successivamente visualizzato mediante imaging (FUNCAT) o Western Immunoblot (BONCAT). In alternativa, le proteine possono essere purificate selettivamente e identificate mediante spettrometria di massa (MS). Utilizzando questa tecnologia, abbiamo creato una linea di topi che esprime la proteina MetRS* sotto il controllo della Cre ricombinasi. Considerando il crescente numero di linee Cre-mouse disponibili, il sistema MetRS* può essere utilizzato in qualsiasi campo per studiare qualsiasi tipo di cellula da qualsiasi tessuto per il quale esiste una linea Cre esistente. La marcatura delle proteine con ANL è possibile in vitro o in vivo e non altera il comportamento del topo o l'integrità delle proteine6. Il periodo di marcatura può essere adattato alla domanda scientifica di ciascun ricercatore, etichettando proteine di nuova sintesi (tempi di etichettatura più brevi) o interi proteomi (tempi di etichettatura più lunghi). L'uso di questa tecnica è limitato dal numero di cellule del tipo che il ricercatore è disposto a studiare; Quindi l'isolamento delle proteine da tipi cellulari con basso numero o bassi tassi metabolici non è possibile con questo metodo. L'obiettivo del metodo presentato è quello di identificare proteine/proteomi specifici del tipo di cellula marcati in vivo. In questo protocollo, descriviamo come etichettare i proteomi specifici del tipo di cellula con ANL nei topi vivi e purificare le proteine marcate. Dopo la purificazione, le proteine possono essere identificate mediante protocolli di spettrometria di massa di routine 5,10. La riduzione della complessità del campione ottenuta in questo metodo mediante la purificazione selettiva di proteine da specifiche popolazioni cellulari consente allo sperimentatore di rilevare sottili cambiamenti nei proteomi, ad esempio, in risposta a cambiamenti ambientali. La purificazione delle proteine marcate può essere ottenuta in ~ 10 giorni, esclusa l'analisi della SM o il periodo di etichettatura. Qui, descriviamo due metodi per la somministrazione di ANL ai topi che esprimono MetRS*, vale a dire (1) aggiunta dell'amminoacido nell'acqua potabile e (2) introduzione di ANL mediante iniezioni intraperitoneali. Indipendentemente dal metodo scelto per la somministrazione di ANL, le fasi di isolamento e purificazione sono le stesse (dalla fase 2 in poi).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12% Acrylamide gels</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL-HCl</td>
			<td>IrishBotech</td>
			<td>HAA1625.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin alkyne</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>B10185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken antibody anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Toxic; use a lab coat and gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (I) bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>254185</td>
			<td>99.999% (wt/wt)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disulfide tag (DST)-alkyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Merk</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodo acetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti chicken 800</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 800CW</td>
			<td>Donkey anti-Chicken Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti rabit 680</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 680RD</td>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Mixer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4259</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutrAvidin beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>29200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>J62036.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X pH 7.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation described in reference number 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD SpinTrap G-25 columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>23225</td>
			<td>Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-biotin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE&#160; Running buffer MOPS</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>M00138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table automatic Vortexer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Mixmate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triazole ligand</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line

Comprendere l'omeostasi proteica in vivo è la chiave per sapere come funzionano le cellule sia in condizioni fisiologiche che di malattia. Il presente protocollo descrive la marcatura in vivo e la successiva purificazione di proteine di nuova sintesi utilizzando una linea di topi ingegnerizzata per indirizzare l'etichettatura delle proteine a specifiche popolazioni cellulari. È una linea inducibile dall'espressione di Cre ricombinasi della L274G-Metionina tRNA sintetasi (MetRS*), che consente l'incorporazione dell'azidonorleucina (ANL) nelle proteine, che altrimenti non si verificherebbe. Utilizzando il metodo qui descritto, è possibile purificare proteomi specifici del tipo di cellula marcati in vivo e rilevare sottili cambiamenti nel contenuto proteico dovuti alla riduzione della complessità del campione.

Seguendo il protocollo descritto (riassunto nella Figura 1), l'ANL è stato somministrato ai topi mediante iniezioni intraperitoneali giornaliere (400 mM ANL 10 mL/kg, Nex-Cre::MetRS*) per 7 giorni, o tramite acqua potabile (0,7% Maltosio, 1% ANL, CamkII-Cre::MetRS*) per 21 giorni. Dopo l'etichettatura, le aree cerebrali corrispondenti sono state sezionate, lisate, alchilate e cliccate. Le reazioni di clic sono state analizzate da SDS-PAGE e Western Immunoblot. Le i...

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Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line

Questo protocollo descrive come eseguire la marcatura proteica specifica del tipo di cellula con azidonorleucina (ANL) utilizzando una linea murina che esprime una sintetasi tRNA mutante L274G-Metionina (MetRS*) e i passaggi necessari per l'isolamento delle proteine marcate specifiche del tipo di cellula. Descriviamo due possibili vie di somministrazione di ANL in topi vivi mediante (1) acqua potabile e (2) iniezioni intraperitoneali.

Purificazione e identificazione di proteine specifiche per tipo cellulare da tessuti complessi utilizzando una linea murina di topo di metionina tRNA sintetasi mutante

Understanding protein homeostasis in vivo is key to knowing how the cells work in both physiological and disease conditions. The present protocol ...

Questo protocollo consente di marcare le proteine in modo specifico per un tipo di cellula. Questa è la prima tecnica che offre tale possibilità e può essere eseguita in vitro o in vivo. Il vantaggio principale della tecnica è che le proteine specifiche del tipo di cellula marcate possono essere purificate non identificate o visualizzate in situ mediante immunofluorescente.Per iniziare preparare il lisato tissutale aggiungendo tampone di lisi ad un volume da 12 a 15 volte il peso umido del tessuto e triturare il tessuto fino a quando non è omogeneizzato. Riscaldare questo omogenato per 15 minuti a 75 gradi Celsius per denaturare la proteina, quindi centrifugare il campione e trasferire il surnatante in una nuova provetta. Questo campione può essere memorizzato a meno 80 gradi Celsius.Successivamente, per l'alchilazione, diluire il campione omogeneizzato due o tre volte in tampone salino fosfato contenente un inibitore della proteasi privo di EDTA. Quindi aggiungere iodoacetamide appena preparato a una concentrazione finale di 20 millimoli. Lasciare il campione per una o due ore a 20 gradi Celsius al buio.Ripetere l'aggiunta di iodoacetamide e le fasi di incubazione due volte. Preparare la colonna secondo le istruzioni del produttore facendo prima vortice le colonne. Quindi rimuovendo il coperchio tagliando la parte inferiore e centrifugandoli.Quindi, eseguire uno scambio di buffer bilanciando prima le colonne di scambio del buffer utilizzando il buffer di scambio della chimica dei clic e quindi scambiando tutti i campioni alchilati. Per valutare l'incorporazione di azidonorleucina prendere 40 microlitri del campione alluso e aggiungere tampone salino fosfato ad un volume finale di 120 microlitri. Quindi impostare la reazione chimica del clic facendo vortice la reazione per 20 secondi.Dopo aver aggiunto ciascun reagente nell'ordine indicato il più velocemente possibile, incubare i campioni al buio a quattro gradi Celsius durante la notte con rotazione continua. Il giorno seguente centrifugare i campioni per cinque minuti a 17.000 volte G dopo la centrifugazione sarà visibile un pellet leggermente turchese. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e conservare il campione a meno 80 gradi Celsius.Per la purificazione delle proteine marcate. Sottoporre tutti i campioni ad una procedura di scambio tampone come dimostrato per pulire gli avanzi di alchine libero usando tampone legante la neutravidina come tampone di equilibrio. Quindi lavare le sfere ad alta capacità di neutravidina tre volte mescolando le perle con il tampone legante.Centrifugare la miscela, scartare il surnatante e ripetere questa operazione tre volte. Quindi preparare un impasto one-to-one aggiungendo lo stesso volume di sfere secche di neutravidina e tampone legante la neutravidina. Mettere da parte da 20 a 40 microlitri di ciascun campione come lisato prepurificato e conservarlo a meno 20 gradi Celsius.Dopo aver misurato la concentrazione proteica del campione, mescolare un milligrammo di proteine con 40 microlitri di liquame di perline. Incubare la miscela durante la notte a quattro gradi Celsius con rotazione continua che consente alle proteine marcate di legarsi alle perle. Il giorno seguente raccogliere il surnatante mediante centrifugazione.Mettere da parte un'aliquota da 20 a 40 microlitri del surnatante per un'analisi successiva e congelare il resto a meno 80 gradi Celsius. Quindi, lavare le perle tre volte aggiungendo il tampone di lavaggio per neutravidina raffreddato. Sedimentare le perle e scartare il surnatante.Quindi aggiungere lo stesso tampone e incubare le perle per 10 minuti sotto rotazione continua a quattro gradi Celsius prima di scartare il surnatante. Ripetere il lavaggio con tamponi di lavaggio della neutravidina due e tre ed eluire le proteine cliccate incubando le perle per 30 minuti a 20 gradi Celsius con un volume di tampone di eluizione della neutravidina, corrispondente a un volume delle sfere secche utilizzate. Durante l'eluizione, mantenere le perle in sospensione a 1000 giri al minuto in uno shaker termoblocco eludere due volte e unire entrambe le eluizioni.Le reazioni di clic sono state analizzate dalla pagina SDS e dall'immunoblot occidentale. Immagini rappresentative degli esperimenti sono mostrate per la somministrazione di azidonorleucina mediante iniezione intraperitoneale e per la somministrazione di azidonorleucina tramite acqua potabile. Un ulteriore esperimento fornisce un esempio per la determinazione della concentrazione ottimale di alchine disolfuro biotina.In questo esempio, la variazione di piega tra il campione marcato e il controllo è più alta a 14 concentrazioni di alchine micromolari. Un esempio di risultato della spettrometria di massa con un chiaro arricchimento nel campione marcato con azidonorleucina rispetto al controllo è mostrato qui. Questa differenza era già visibile nella colorazione proteica totale.Oltre ai cambiamenti nell'intensità dei peptidi, ci sono anche proteine uniche trovate in entrambi i campioni. Si tratta di un protocollo tecnicamente complesso ed è un passaggio che deve essere seguito attentamente utilizzando opportuni controlli negativi alchilazione, corretta (indistinta) e adeguata pulizia dell'archivio non click. I nostri passaggi chiave in questo protocollo, le proteine purificate possono essere identificate mediante spettrometria di massa se l'interesse dei ricercatori è studiare le proteine o caricarlo in un gel per studiare le proteine di interesse per western blot.La capacità di questo metodo di marcare le proteine da una specifica origine cellulare ha molte applicazioni come la tensione delle proteine o lo studio della sintesi proteica in vitro o in vivo.

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