Name: cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line
Uploaded: 2022-04-13T14:00:00
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BAC는 스페인 과학 혁신부(Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), 마드리드 자치 커뮤니티(Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) 및 MICINN(PID2020-113270RA-I00) 보조금의 지원을 받습니다. R. A-P는 마드리드 자치 공동체 (Atracción de Talento-2019T1 / BMD-14057)의 자금 지원을 받고 있습니다. E.M.S.는 막스 플랑크 협회, 유럽 연구위원회 (보조금 743216), DFG CRC 1080 : 신경 항상성의 분자 및 세포 메커니즘 및 DFG CRC 902 : RNA 기반 조절의 분자 원리. D.C Dieterich와 P. Landgraf의 기술적 조언과 DST-Alkyne의 합성에 감사드립니다. E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast 및 MPI for Brain Research의 동물 시설에 감사드립니다. Nex-Cre 마우스 라인을 공유해 주신 Sandra Goebbels에게 감사드립니다. 영어 편집에 도움을 주신 Antonio G. Carroggio에게 감사드립니다. 학사 실험을 설계, 수행 및 분석했습니다. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. 및 S. T. D. 실험을 수행하고 분석했습니다. BAC와 E.M.S.는 실험을 설계하고 프로젝트를 감독했으며 BAC는 논문을 썼습니다. 모든 저자가 논문을 편집했습니다.

모든 동물 실험은 독일(RP 다름슈타트, 프로토콜: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) 또는 스페인(UCM 동물 실험 위원회 및 마드리드 코무니다드 환경 상담, 프로토콜 번호: PROEX 005.0/21)의 허가를 받아 수행되었으며 막스 플랑크 협회 규칙 및 스페인 규정을 준수하고 동물 복지에 대한 EU 지침을 따릅니다.
1. ANL 을 이용한 생체 내 대사 표지
<ol><li>음료수:<ol><li...

<ol>
	<li>Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+synaptic+protein+turnover.">The regulation of synaptic protein turnover.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).</li><li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+protein+synthesis,+synaptic+plasticity,+and+memory.">Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory.</a> Cell. 127 (1), 49-58 (2006).</li><li>Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+dynamics+during+homeostatic+scaling+in+cultured+neurons.">Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons.</a> Elife. 9, 52939 (2020).</li><li>Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+in+mice+as+affected+by+intracerebral+puromycin.">Memory in mice as affected by intracerebral puromycin.</a> Science. 141 (3575), 57-59 (1963).</li><li>Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling,+detection+and+identification+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).</li><li>Alvarez-Castelao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).</li><li>Ngo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-selective+metabolic+labeling+of+proteins.">Cell-selective metabolic labeling of proteins.</a> Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).</li><li>Mahdavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+aminoacyl-tRNA+synthetase+for+cell-selective+analysis+of+mammalian+protein+synthesis.">Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).</li><li>Yuet, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+proteomic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).</li><li>Patel, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+labeling+and+label-free+mass+spectrometry-based+proteomics+approaches.">A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches.</a> Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).</li><li>Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazo+transfer.">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).</li><li>Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BONCAT:+Metabolic+labeling,+click+chemistry,+and+affinity+purification+of+newly+synthesized+proteomes.">BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, 199-215 (2015).</li><li>Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins+by+immunoblotting.">Analysis of proteins by immunoblotting.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).</li><li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAPome:+a+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data.">The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).</li><li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li><li>Goebbels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+targeting+of+principal+neurons+in+neocortex+and+hippocampus+of+NEX-Cre+mice.">Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice.</a> Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).</li><li>van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+thiol-yne+addition+improves+the+specificity+of+strain-promoted+azide-alkyne+cycloaddition.">Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).</li><li>O'Fagain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilization+of+proteins.">Lyophilization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 244, 309-321 (2004).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+trapping+(S-Trap)+is+compatible+with+typical+protein+extraction+buffers+and+detergents+for+bottom-up+proteomics.">Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).</li><li>tom Dieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+newly+synthesized+target+proteins+in+situ.">Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ.</a> Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).</li><li>McShane, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+protein+stability+reveals+age-dependent+degradation.">Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation.</a> Cell. 167 (3), 803-815 (2016).</li><li>Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+non-canonical+amino+acids+into+the+developing+murine+proteome.">Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome.</a> Scientific Reports. 6, 32377 (2016).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUnSET,+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis.">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioID:+A+screen+for+protein-protein+interactions.">BioID: A screen for protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).</li></ol>

프로토콜의 중요한 측면은 다음과 같습니다. DST- 알킨을 사용할 때 충분한 생물학적 복제, ANL 투여 경로, 양 및 기간, 샘플의 알킬화, 알킨 농도 및 β- 메르 캅토 에탄올 제거를 갖는 음성 대조군의 포함.
Cre 드라이버가 없는 ANL 표지 동물에서 진행된 음성 대조군 샘플을 포함하는 것이 중요하므로 MetRS* 발현이 없습니다. 이러한 샘플은 ANL 표지 Cre 유도 MetRS* 마우스의 샘플과 병?...

비정상적인 단백질 항상성은 단백질 합성 및 분해의 불균형으로 인해 발생합니다. 여러 질병은 단백질 항상성의 변화와 관련이 있습니다. 일부 질병의 특징은 다른 세포 하 위치와 뇌 영역에 응집체가 존재한다는 것입니다. 단백질 항상성은 질병에서 중요할 뿐만 아니라 정상 장기 및세포 기능에도 중요한 역할을 합니다1. 예를 들어, 단백질 합성은 단백질 합성을 차단하는 화학적 억제제의 사용에 의해 결정되는 바와 같이 많은 형태의 신경 가소성 2,3에 필요합니다4. 그러나 학습과 기억을 지원하기 위해 프로테옴이 어떤 세포 유형에서 변경되는지, 각 세포 유형의 특정 단백질이 합성 또는 분해에서 증가 또는 감소하는지 명확하지 않습니다. 따라서 단백질 항상성에 대한 포괄적 인 연구는 특정 세포 유형에서 오는 단백질체를 구별 할 수있는 능력을 필요로합니다. 실제로, 다세포 환경에서 발생하는 세포 과정을 연구하기 위한 세포 유형 특이적 단백질체의 식별은 단백질체학에서 중요한 장애물이었습니다. 이러한 이유로 당사는 세포 유형 특이적 단백질체를 식별하고 정제하는 효과적인 방법으로 입증된 생체 직교 방법과 결합된 MetRS* 발현을 사용하여 이 격차를 메우는 기술을 개발했습니다 5,6,7.
돌연변이 MetRS*(MetRS L274G)의 발현은 비-정준 메티오닌 유사체 ANL을 상응하는 tRNA 8,9 내로 로딩하고 이후 단백질에 혼입시킬 수 있게 한다. MetRS* 발현이 세포 유형 특이적 프로모터에 의해 조절되는 경우, 비표준 아미노산은 세포 선택적인 방식으로 단백질에 통합됩니다. 일단 ANL이 단백질에 통합되면, 클릭 화학에 의해 선택적으로 기능화 될 수 있으며, 이어서 이미징 (FUNCAT) 또는 웨스턴 면역 블롯 (BONCAT)에 의해 시각화 될 수있다. 대안적으로, 단백질은 선택적으로 정제되고 질량 분석법 (MS)에 의해 확인 될 수있다. 이 기술을 사용하여 Cre 재조합 효소의 제어하에 MetRS* 단백질을 발현하는 마우스 라인을 만들었습니다. 사용 가능한 Cre-mouse 라인의 수가 증가함에 따라 MetRS* 시스템은 모든 분야에서 기존 Cre-라인이 있는 모든 조직의 모든 세포 유형을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. ANL을 사용한 단백질 표지는 시험관 내 또는 생체 내에서 가능하며 마우스 행동 또는 단백질 무결성을 변경하지 않습니다6. 라벨링 기간은 각 연구자의 과학적 질문에 맞게 조정할 수 있으며, 새로 합성 된 단백질 (라벨링 시간 단축) 또는 전체 프로테옴 (라벨링 시간 단축)을 라벨링합니다. 이 기술의 사용은 연구자가 연구하고자하는 유형의 세포 수에 의해 제한됩니다. 따라서 이 방법으로는 숫자가 적거나 대사율이 낮은 세포 유형에서 단백질을 분리할 수 없습니다. 제시된 방법의 목표는 생체 내에서 표지된 세포 유형 특이적 단백질/프로테옴을 식별하는 것입니다. 이 프로토콜에서는 살아있는 마우스에서 ANL로 세포 유형 특이적 단백질체를 표지하고 표지된 단백질을 정제하는 방법을 설명합니다. 정제 후, 단백질은 일상적인 질량 분석 프로토콜 5,10에 의해 확인될 수 있다. 특정 세포 집단에서 단백질을 선택적으로 정제하여 이 방법에서 달성한 샘플 복잡성의 감소는 실험자가 예를 들어 환경 변화에 대한 반응으로 프로테옴의 미묘한 변화를 감지할 수 있도록 합니다. 표지된 단백질의 정제는 MS 분석 또는 표지 기간을 포함하지 않고 ~10일 내에 달성할 수 있습니다. 여기에서는 MetRS* 발현 마우스에 ANL을 투여하는 두 가지 방법, 즉 (1) 음용수에 아미노산을 첨가하는 방법과 (2) 복강 주사로 ANL을 도입하는 방법에 대해 설명합니다. ANL 투여를 위해 선택된 방법에 관계없이, 단리 및 정제 단계는 동일하다(단계 2부터).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12% Acrylamide gels</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL-HCl</td>
			<td>IrishBotech</td>
			<td>HAA1625.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin alkyne</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>B10185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken antibody anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Toxic; use a lab coat and gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (I) bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>254185</td>
			<td>99.999% (wt/wt)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disulfide tag (DST)-alkyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Merk</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodo acetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti chicken 800</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 800CW</td>
			<td>Donkey anti-Chicken Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti rabit 680</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 680RD</td>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Mixer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4259</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutrAvidin beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>29200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>J62036.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X pH 7.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation described in reference number 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD SpinTrap G-25 columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>23225</td>
			<td>Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-biotin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE&#160; Running buffer MOPS</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>M00138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table automatic Vortexer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Mixmate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triazole ligand</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line

생체 내에서 단백질 항상성을 이해하는 것은 세포가 생리적 및 질병 조건 모두에서 어떻게 작동하는지 아는 데 중요합니다. 본 프로토콜은 단백질 표지를 특정 세포 집단으로 향하게 하기 위해 조작된 마우스 라인을 사용하여 새로 합성된 단백질의 생체내 표지 및 후속 정제를 설명합니다. L274G-메티오닌 tRNA 신테타제(MetRS*)의 Cre 재조합 효소 발현에 의한 유도성 라인으로, 그렇지 않으면 발생하지 않는 단백질에 아지도노르류신(ANL) 통합을 가능하게 합니다. 여기에 설명된 방법을 사용하여 생체 내에서 표지된 세포 유형 특이적 단백질체를 정제하고 샘플 복잡성 감소로 인한 단백질 함량의 미묘한 변화를 감지할 수 있습니다.

설명된 프로토콜(그림 1에 요약됨)에 따라 ANL을 7일 동안 매일 복강주사(400mM ANL 10mL/kg, Nex-Cre::MetRS*) 또는 음용수(0.7% 말토오스, 1% ANL, CamkII-Cre::MetRS*)를 통해 마우스에 투여했습니다. 표지 후, 상응하는 뇌 영역을 해부하고, 용해시키고, 알킬화하고, 클릭시켰다. 클릭 반응은 SDS-PAGE 및 웨스턴 이뮤노블롯으로 분석하였다. 실험의 대표 이미지는 IP 주입에 의?...

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Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line

이 프로토콜은 돌연변이 L274G-메티오닌 tRNA 신테타제(MetRS*)를 발현하는 마우스 라인을 사용하여 아지도노르류신(ANL)으로 세포 유형 특이적 단백질 표지를 수행하는 방법과 표지된 세포 유형 특이적 단백질 분리에 필요한 단계를 설명합니다. 살아있는 마우스에서 (1) 식수와 (2) 복강 주사로 두 가지 가능한 ANL 투여 경로를 설명합니다.

돌연변이 메티오닌 tRNA 신테타제 마우스 라인을 사용한 복합 조직으로부터의 세포형 특이적 단백질 정제 및 식별

Understanding protein homeostasis in vivo is key to knowing how the cells work in both physiological and disease conditions. The present protocol ...

이 프로토콜은 세포 유형 특이적 방식으로 단백질을 표지하는 것을 가능하게 합니다. 이것은 그러한 가능성을 제공하는 첫 번째 기술이며 시험관 내 또는 생체 내에서 수행 할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 표지된 세포 유형 특이적 단백질을 미확인 정제하거나 면역형광체에 의해 현장에서 시각화할 수 있다는 것입니다.조직 용해물을 준비하기 시작하여, 조직의 습윤 중량의 12 내지 15배의 부피로 용해 완충액을 첨가하고, 조직이 균질화될 때까지 분쇄한다. 이 균질액을 섭씨 75도까지 15분 동안 가열하여 단백질을 변성시킨 다음 샘플을 원심분리하고 상청액을 새 튜브로 옮깁니다. 이 샘플은 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있습니다.다음으로, 알킬화를 위해 균질화된 샘플을 EDTA가 없는 프로테아제 억제제를 함유하는 포스페이트 식염수 완충액에서 2 내지 3회 희석한다. 그런 다음 새로 준비된 요오도 아세트 아미드를 최종 농도 20 밀리몰에 첨가하십시오. 어둠 속에서 섭씨 20도에서 1-2 시간 동안 샘플을 그대로 두십시오.요오도아세트아미드 첨가 및 인큐베이션 단계를 2회 반복한다. 먼저 기둥을 소용돌이하여 제조업체의 지침에 따라 기둥을 준비합니다. 그런 다음 뚜껑을 제거하고 바닥 부분을 자르고 원심 분리하십시오.다음으로, 먼저 클릭 화학 교환 버퍼를 사용하여 버퍼 교환 컬럼을 평형화한 다음 모든 알킬화된 샘플을 교환하여 버퍼 교환을 수행합니다. 아지도노르류신 혼입을 평가하기 위해 40 마이크로리터의 언급된 샘플을 취하고, 120 마이크로리터의 최종 부피에 인산염 식염수 완충액을 첨가한다. 그런 다음 20초 동안 반응을 볼텍싱하여 클릭 화학 반응을 설정합니다.가능한 한 빨리 표시된 순서대로 각 시약을 첨가 한 후 샘플을 섭씨 4 도의 어두운 곳에서 밤새 연속 회전하여 배양합니다. 다음날 샘플을 17, 000배 G에서 5분간 원심분리하면 약간 청록색 펠릿이 보일 것이다. 상청액을 새 튜브로 옮기고 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.표지된 단백질 정제용. 모든 샘플을 평형 완충액으로서 뉴트라비딘 결합 완충액을 사용하여 유리 알킨의 잔여물을 세척하기 위해 입증된 바와 같이 완충액 교환 절차를 거친다. 그 후 뉴트라비딘 비드를 결합 완충액과 혼합하여 3회 고용량 비드를 세척한다.혼합물을 원심 분리하고 상청액을 버리고 이것을 3 번 반복하십시오. 이어서 동일한 부피의 뉴트라비딘 건조 비드와 뉴트라비딘 결합 완충액을 첨가하여 일대일 슬러리를 제조한다. 각 샘플 20-40 마이크로 리터를 사전 정제 된 용해물로 따로 보관하고 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.시료의 단백질 농도를 측정한 후 단백질 1 밀리그램과 40 마이크로리터의 비드 슬러리를 혼합하였다. 혼합물을 섭씨 4도에서 밤새 배양하고 표지된 단백질이 비드에 결합할 수 있도록 연속 회전합니다. 다음날 원심분리에 의해 상청액을 수집한다.나중에 분석을 위해 상청액의 20-40 마이크로리터 분취량을 따로 보관하고 나머지는 섭씨 영하 80도에서 동결시킵니다. 다음으로, 차가운 뉴트라비딘 세척 완충액 1개를 첨가하여 비드를 3회 세척한다. 비드를 침전시키고 상청액을 버린다.이어서, 동일한 완충액을 첨가하고, 상청액을 버리기 전에 섭씨 4도에서 연속 회전 하에 10분 동안 비드를 인큐베이션한다. 뉴트라비딘 세척 완충액 2 및 3으로 세척을 반복하고, 사용된 건조 비드의 1 부피에 해당하는 부피의 뉴트라비딘 용출 완충액과 함께 섭씨 20도에서 30분 동안 비드를 인큐베이션하여 클릭된 단백질을 용리시킨다. 용리 동안, 비드를 열 블록 쉐이커에서 분당 1000 회전으로 현탁액으로 유지하여 2회 회피하고 두 용리체를 합친다.클릭 반응은 SDS 페이지 및 웨스턴 면역 블롯으로 분석하였다. 실험의 대표 이미지는 복강 내 주사에 의한 아지도노르류신 투여 및 음용수를 통한 아지도노르류신 투여에 대해 도시된다. 추가 실험은 최적의 이황화물 비오틴 절단성 알킨 농도의 결정을 위한 예를 제공합니다.이 예에서, 표지된 샘플과 대조군 사이의 폴드 변화는 14 마이크로몰 알킨 농도에서 가장 높다. 대조군과 비교하여 표지된 아지도노류신 샘플에서 명확한 농축을 갖는 질량 분석 결과의 예가 여기에 나와 있다. 이 차이는 이미 전체 단백질 염색에서 볼 수 있었습니다.펩타이드 강도의 변화 외에도 두 샘플 모두에서 발견되는 독특한 단백질이 있습니다. 이것은 기술적으로 복잡한 프로토콜이며 적절한 음성 제어 알킬화, 적절한(불명료한) 및 비 클릭 아카이브의 적절한 청소를 사용하여 주의 깊게 따라야 하는 단계입니다. 이 프로토콜의 주요 단계인 정제된 단백질은 연구자가 단백질을 연구하는 것이라면 질량분석법으로 식별하거나 웨스턴 블롯으로 관심 단백질을 연구하기 위해 젤에 로드할 수 있습니다.특정 세포 기원의 단백질을 표지하는 이 방법의 능력은 단백질의 장력 또는 시험관 내 또는 생체 내 단백질 합성 연구와 같은 많은 응용 분야를 가지고 있습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

불연속 Percoll - 자당 밀도 구배를 사용하여 마우스를 접속에서 Synaptoneurosomes의 준비

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

연구

신경과학

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

분리 LacZ를 표현 유동세포계측법를 사용하여 마우스 내이 (内耳) 조직의 세포를

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

표현 이온 채널 연구에 대한 특정 감각 신경 세포 인구의 식별

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

BoTest 매트릭스 분석 실험을 사용하여 복잡한 매트릭스에서 분리 및 보툴리눔 신경 독소의 정량화

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

쥐 뇌 조직 검사 정렬 형광 활성 셀을 사용하여 셀 타입 별 유전자 발현

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Purification of Mouse Brain Vessels

마우스 뇌 혈관의 정화

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

전기 단일 및 두 개 차원 문화에 자기장을 사용하여 신경 세포의 외부인가 전압

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

마우스 기본 Oligodendrocytes의 신속 하 고 구체적인 Immunomagnetic 절연

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

면역 형광 검사를 사용 하 여 마우스 뇌의 시 냅 스 단백질의 다른 유형의 분포를 측정

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

출생 후 마우스 소뇌에서 프로미닌-1+ 줄기 세포의 정화

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...