Name: cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line
Uploaded: 2022-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line at JoVE.com

BAC er finansiert av det spanske departementet for vitenskap og innovasjon (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), av den autonome regionen Madrid (Atracción de Talento-2019T1 / BMD-14057), og MICINN (PID2020-113270RA-I00) tilskudd. R. A-P er finansiert av Autonomous Community of Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). EMS er finansiert av Max Planck Society, en Advanced Investigator-pris fra European Research Council (grant 743216), DFG CRC 1080: Molecular and Cellular Mechanisms of Neural Homeostase, og DFG CRC 902: Molecular Principles of RNA-based Regulation. Vi takker D.C Dieterich og P. Landgraf for deres tekniske råd og syntesen av DST-Alkyne. Vi takker E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast og dyreanlegget til MPI for hjerneforskning for deres utmerkede støtte. Vi takker Sandra Goebbels for å dele Nex-Cre muselinje. Vi takker Antonio G. Carroggio for hans hjelp med engelsk redigering. B.A.C. designet, gjennomført og analysert eksperimenter. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E., og S. t. D. gjennomførte og analyserte eksperimenter. B.A-C og E.M.S. designet eksperimenter, og overvåket prosjektet, B.A-C skrev papiret. Alle forfatterne redigerte artikkelen.

Alle eksperimenter med dyr ble utført med tillatelse fra de lokale regjeringskontorene i Tyskland (RP Darmstadt; protokoller: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) eller Spania (Komité for dyreforsøk ved UCM og miljørådgivning i Comunidad de Madrid, protokollnummer: PROEX 005.0/21) og er i samsvar med Max Planck Society-reglene og spanske forskrifter og følger EUs retningslinjer for dyrevelferd.
1. In vivo metabolsk merking med ANL
<ol><li>Drikkevann:<...

<ol>
	<li>Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+synaptic+protein+turnover.">The regulation of synaptic protein turnover.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).</li><li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+protein+synthesis,+synaptic+plasticity,+and+memory.">Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory.</a> Cell. 127 (1), 49-58 (2006).</li><li>Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+dynamics+during+homeostatic+scaling+in+cultured+neurons.">Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons.</a> Elife. 9, 52939 (2020).</li><li>Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+in+mice+as+affected+by+intracerebral+puromycin.">Memory in mice as affected by intracerebral puromycin.</a> Science. 141 (3575), 57-59 (1963).</li><li>Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling,+detection+and+identification+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).</li><li>Alvarez-Castelao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).</li><li>Ngo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-selective+metabolic+labeling+of+proteins.">Cell-selective metabolic labeling of proteins.</a> Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).</li><li>Mahdavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+aminoacyl-tRNA+synthetase+for+cell-selective+analysis+of+mammalian+protein+synthesis.">Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).</li><li>Yuet, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+proteomic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).</li><li>Patel, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+labeling+and+label-free+mass+spectrometry-based+proteomics+approaches.">A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches.</a> Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).</li><li>Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazo+transfer.">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).</li><li>Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BONCAT:+Metabolic+labeling,+click+chemistry,+and+affinity+purification+of+newly+synthesized+proteomes.">BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, 199-215 (2015).</li><li>Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins+by+immunoblotting.">Analysis of proteins by immunoblotting.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).</li><li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAPome:+a+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data.">The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).</li><li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li><li>Goebbels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+targeting+of+principal+neurons+in+neocortex+and+hippocampus+of+NEX-Cre+mice.">Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice.</a> Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).</li><li>van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+thiol-yne+addition+improves+the+specificity+of+strain-promoted+azide-alkyne+cycloaddition.">Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).</li><li>O'Fagain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilization+of+proteins.">Lyophilization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 244, 309-321 (2004).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+trapping+(S-Trap)+is+compatible+with+typical+protein+extraction+buffers+and+detergents+for+bottom-up+proteomics.">Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).</li><li>tom Dieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+newly+synthesized+target+proteins+in+situ.">Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ.</a> Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).</li><li>McShane, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+protein+stability+reveals+age-dependent+degradation.">Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation.</a> Cell. 167 (3), 803-815 (2016).</li><li>Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+non-canonical+amino+acids+into+the+developing+murine+proteome.">Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome.</a> Scientific Reports. 6, 32377 (2016).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUnSET,+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis.">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioID:+A+screen+for+protein-protein+interactions.">BioID: A screen for protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).</li></ol>

De kritiske aspektene ved protokollen er; inkludering av negative kontroller, å ha nok biologiske replikasjoner, ANL-administrasjonsvei, mengde og varighet, alkylering av prøvene, alkynkonsentrasjon og eliminering av β-merkaptoetanol ved bruk av DST-alkyn.
Det er viktig å inkludere negative kontrollprøver som går fra ANL-merkede dyr uten Cre-driver og derfor ikke noe MetRS*-uttrykk. Disse prøvene må utsettes for hvert trinn som er beskrevet i protokollen parallelt med prøvene fra ANL-...

Avvikende proteinhomeostase er forårsaket av ubalanse i proteinsyntese og nedbrytning. Flere sykdommer er relatert til endringer i proteinhomeostase. Kjennetegnet for noen sykdommer er tilstedeværelsen av aggregater i forskjellige subcellulære steder og hjerneområder. Proteinhomeostase er ikke bare viktig ved sykdom, men spiller også en avgjørende rolle i normal organ- ogcellefunksjon1. For eksempel er proteinsyntese nødvendig for mange former for neuronal plastisitet2,3, som bestemt ved bruk av kjemiske hemmere som blokkerer proteinsyntese4. Det er imidlertid ikke klart i hvilke celletyper proteomet endres for å støtte læring og minne, og det forstås heller ikke hvilke spesifikke proteiner i hver celletype som øker eller reduserer syntesen eller nedbrytningen. Dermed krever en omfattende studie av proteinhomeostase evnen til å skille proteomer som kommer fra bestemte celletyper. Faktisk har identifiseringen av celletypespesifikke proteomer for å studere cellulære prosesser som forekommer i et flercellet miljø vært et viktig hinder i proteomikk. Av denne grunn utviklet vi en teknikk ved hjelp av MetRS*-uttrykk kombinert med bioortogonale metoder som har vist seg å være en effektiv måte å identifisere og rense celletypespesifikke proteomer på, og fylle dette gapet 5,6,7.
Uttrykket av en mutant MetRS * (MetRS L274G) tillater lasting av den ikke-kanoniske metioninanalogen ANL i det tilsvarende tRNA 8,9 og dets påfølgende innlemmelse i proteiner. Når MetRS*-ekspresjon reguleres av en celletypespesifikk promotor, vil den ikke-kanoniske aminosyren bli inkorporert i proteinene på en celleselektiv måte. Når ANL er innlemmet i proteinene, kan det selektivt funksjonaliseres ved klikkkjemi og deretter enten visualiseres ved avbildning (FUNCAT) eller ved Western Immunoblot (BONCAT). Alternativt kan proteiner selektivt renses og identifiseres ved massespektrometri (MS). Ved hjelp av denne teknologien skapte vi en muselinje som uttrykker MetRS*-proteinet under kontroll av Cre-rekombinasen. Med tanke på det økende antallet tilgjengelige Cre-mouse-linjer, kan MetRS*-systemet brukes i alle felt for å studere alle celletyper fra alle vev der det finnes en eksisterende Cre-line. Proteinmerking med ANL er mulig in vitro eller in vivo, og endrer ikke museatferd eller proteinintegritet6. Merkingstiden kan tilpasses det vitenskapelige spørsmålet til hver forsker, merking av nylig syntetiserte proteiner (kortere merkingstider) eller hele proteomer (lengre merkingstider). Bruken av denne teknikken er begrenset av antall celler av typen som forskeren er villig til å studere; Derfor er proteinisolering fra celletyper med lavt antall eller lave metabolske hastigheter ikke mulig ved denne metoden. Målet med den presenterte metoden er å identifisere celletypespesifikke proteiner/proteomer merket in vivo. I denne protokollen beskriver vi hvordan man merker celletypespesifikke proteomer med ANL i levende mus og renser de merkede proteinene. Etter rensing kan proteiner identifiseres ved rutinemessige massespektrometriprotokoller 5,10. Reduksjonen av prøvekompleksitet oppnådd i denne metoden ved selektiv rensing av proteiner fra spesifikke cellulære populasjoner gjør det mulig for eksperimentøren å oppdage subtile endringer i proteomer, for eksempel som svar på miljøendringer. Rensing av de merkede proteinene kan oppnås på ~ 10 dager, ikke inkludert MS-analysen eller merkingsperioden. Her beskriver vi to metoder for ANL-administrasjon til MetRS* som uttrykker mus, nemlig (1) tilsetning av aminosyren i drikkevannet, og (2) innføring av ANL ved intraperitoneale injeksjoner. Uansett hvilken metode som er valgt for ANL-administrasjon, er isolasjons- og rensetrinnene de samme (fra trinn 2 og videre).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12% Acrylamide gels</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL-HCl</td>
			<td>IrishBotech</td>
			<td>HAA1625.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin alkyne</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>B10185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken antibody anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Toxic; use a lab coat and gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (I) bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>254185</td>
			<td>99.999% (wt/wt)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disulfide tag (DST)-alkyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Merk</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodo acetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti chicken 800</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 800CW</td>
			<td>Donkey anti-Chicken Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti rabit 680</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 680RD</td>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Mixer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4259</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutrAvidin beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>29200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>J62036.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X pH 7.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation described in reference number 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD SpinTrap G-25 columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>23225</td>
			<td>Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-biotin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE&#160; Running buffer MOPS</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>M00138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table automatic Vortexer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Mixmate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triazole ligand</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line

Å forstå proteinhomeostase in vivo er nøkkelen til å vite hvordan cellene fungerer i både fysiologiske og sykdomstilstander. Denne protokollen beskriver in vivo-merking og påfølgende rensing av nylig syntetiserte proteiner ved hjelp av en konstruert muselinje for å lede proteinmerking til spesifikke cellulære populasjoner. Det er en induserbar linje ved Cre rekombinase ekspresjon av L274G-metionin tRNA syntetase (MetRS *), slik at azidonorleucin (ANL) inkorporering til proteiner, som ellers ikke vil forekomme. Ved hjelp av metoden beskrevet her, er det mulig å rense celletypespesifikke proteomer merket in vivo og oppdage subtile endringer i proteininnhold på grunn av reduksjon av prøvekompleksitet.

Etter den beskrevne protokollen (oppsummert i figur 1) ble ANL administrert til mus enten ved daglige intraperitoneale injeksjoner (400 mM ANL 10 ml/kg, Nex-Cre::MetRS*) i 7 dager, eller via drikkevann (0,7 % maltose, 1 % ANL, CamkII-Cre::MetRS*) i 21 dager. Etter merking ble de tilsvarende hjerneområdene dissekert, lysert, alkylert og klikket. Klikkreaksjoner ble analysert av SDS-PAGE og Western Immunoblot. Representative bilder av forsøkene er vist i figur <str...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line at JoVE.com

Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line

Denne protokollen beskriver hvordan man utfører celletypespesifikk proteinmerking med azidonorleucin (ANL) ved hjelp av en muselinje som uttrykker en mutant L274G-metionin tRNA-syntetase (MetRS *) og de nødvendige trinnene for merket celletype-spesifikke proteiner isolasjon. Vi skisserer to mulige anl-administrasjonsveier hos levende mus ved (1) drikkevann og (2) intraperitoneale injeksjoner.

Celletypespesifikk proteinrensing og identifikasjon fra komplekse vev ved bruk av en mutant metionin tRNA-syntetasemuselinje

Understanding protein homeostasis in vivo is key to knowing how the cells work in both physiological and disease conditions. The present protocol ...

Denne protokollen gjør det mulig å merke proteiner på en celletypespesifikk måte. Dette er den første teknikken som gir en slik mulighet, og det kan gjøres in vitro eller in vivo. Den største fordelen med teknikken er at de merkede celletypespesifikke proteinene kan renses uidentifisert eller visualiseres in situ ved immunfluorescerende.For å begynne å forberede vevslysatet ved å tilsette lysisbuffer i et volum på 12 til 15 ganger vevets våte vekt og triturere vevet til det er homogenisert. Varm dette homogenatet i 15 minutter til 75 grader Celsius for å denaturere proteinet, sentrifuger deretter prøven og overfør supernatanten til et nytt rør. Denne prøven kan lagres ved minus 80 grader Celsius.Deretter, for alkylering, fortynn den homogeniserte prøven to til tre ganger i fosfatsaltbuffer som inneholder en EDTA-fri proteasehemmer. Tilsett deretter nytilberedt iodoacetamid til en endelig konsentrasjon på 20 millimol. La prøven stå i en til to timer ved 20 grader Celsius i mørket.Gjenta iodoacetamidtilsetningen og inkubasjonstrinnene to ganger. Forbered kolonnen i henhold til produsentens instruksjoner ved først å virvle kolonnene. Fjern deretter lokket som kutter bunndelen og sentrifugerer dem.Deretter utfører du en bufferutveksling ved først å balansere bufferutvekslingskolonnene ved hjelp av klikkkjemiutvekslingsbufferen og deretter utveksle alle alkylerte prøver. For å evaluere azidonorleucin-inkorporeringen, ta 40 mikroliter av den henviste prøven og tilsett fosfatsaltbuffer til et endelig volum på 120 mikroliter. Sett deretter opp klikkkjemireaksjonen ved å virvle reaksjonen i 20 sekunder.Etter å ha tilsatt hvert reagens i den angitte rekkefølgen så raskt som mulig, inkuberer prøvene i mørket ved fire grader Celsius over natten med kontinuerlig rotasjon. Neste dag sentrifugerer prøvene i fem minutter ved 17.000 ganger G etter sentrifugering vil en litt turkis pellet være synlig. Overfør supernatanten til et nytt rør og oppbevar prøven ved minus 80 grader Celsius.For merket proteinrensing. Utsett alle prøvene for en bufferutvekslingsprosedyre som vist for å rense rester av fri alkyn ved bruk av neutravidinbindende buffer som likevektsbuffer. Vask deretter neutravidin-perlene med høy kapasitet tre ganger ved å blande perlene med bindingsbufferen.Sentrifuge blandingen, kast supernatanten og gjenta dette tre ganger. Lag deretter en en-til-en-oppslemming ved å tilsette samme volum av neutravidin tørre perler og neutravidinbindende buffer. Sett av 20 til 40 mikroliter av hver prøve som forhåndsrenset lysat og oppbevar den ved minus 20 grader Celsius.Etter å ha målt proteinkonsentrasjonen av prøven, bland ett milligram protein med 40 mikroliter av perleoppslemmingen. Inkuber blandingen over natten ved fire grader Celsius med kontinuerlig rotasjon som gjør det mulig for de merkede proteinene å binde seg til perlene. På neste dag samler supernatanten ved sentrifugering.Sett en 20 til 40 mikroliter aliquot av supernatanten til side for senere analyse og frys resten ved minus 80 grader Celsius. Deretter vasker du perlene tre ganger ved å legge til kjølt neutravidinvaskebuffer en. Sedimentering av perlene og kasting av supernatanten.Tilsett deretter den samme bufferen og inkuber perlene i 10 minutter under kontinuerlig rotasjon ved fire grader Celsius før du kaster supernatanten. Gjenta vasken med neutravidinvaskebuffere to og tre, og eluer de klikkede proteinene ved å inkubere perlene i 30 minutter ved 20 grader Celsius med et volum nøytravidin elueringsbuffer, tilsvarende ett volum av de tørre perlene som brukes. Under eluering, opprettholde perlene i suspensjon ved 1000 omdreininger per minutt i en termoblokk shaker unnvike to ganger og kombinere begge elutes.Klikkreaksjoner ble analysert av SDS-side og Western immuno blot. Representative bilder av forsøkene er vist for azidonorleucinadministrasjon ved intra peritoneal injeksjon og for azidonorleucinadministrasjon via drikkevann. Et ytterligere eksperiment gir et eksempel for bestemmelse av den optimale disulfidbiotinspaltbare alkynkonsentrasjonen.I dette eksemplet er foldeendringen mellom den merkede prøven og kontrollen høyest ved 14 mikromolær alkynkonsentrasjon. Et eksempel på et massespektrometriresultat med en klar anrikning i azidonorleucinmerket prøve sammenlignet med kontrollen er vist her. Denne forskjellen var allerede synlig i den totale proteinflekken.Foruten endringer i peptidintensitet er det også unike proteiner som finnes i begge prøvene. Dette er en teknisk kompleks protokoll, og det er et skritt må følges nøye ved hjelp av riktig negative kontroller alkylering, riktig (utydelig) og tilstrekkelig rengjøring av ikke klikk arkivet. Våre viktigste trinn i denne protokollen, rensede proteiner, kan enten identifiseres ved massespektrometri hvis forskernes interesse er å studere proteiner eller laste det inn i en gel for å studere proteiner av interesse av vestlig blot.Evnen til denne metoden til å merke proteiner fra en bestemt cellulær opprinnelse har mange anvendelser som spenningen av proteiner eller studiet av proteinsyntese in vitro eller in vivo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolere LacZ-uttrykke Celler fra Mouse Inner Ear Vev bruker flowcytometrisystemer

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

Identifisering av spesifikke Sensory Neuron populasjoner for Study of Uttrykt ionekanalar

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Isolering og kvantifisering av Botulinum Neurotoxin fra komplekse matriser med bruk av BoTest Matrix Analyser

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Bruke fluorescensaktivert Cell Sorting å undersøke Cell-Type-Specific genuttrykk i Rat hjernevev

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Rensing av musehjerne Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

Ekstern Eksitasjon av nerveceller ved hjelp av elektriske og magnetiske felt i en-og to-dimensjonale kulturer

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Rask og spesifikk Immunomagnetic isolasjon av musen primære Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Kvantifisere heterogene distribusjon av et Synaptic Protein i musen hjernen ved hjelp av Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Rensing av Prominin-1+ stamceller fra postnatal mus cerebellum

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...