Name: cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line
Uploaded: 2022-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line at JoVE.com

O B.A-C é financiado pelo Ministério da Ciência e Inovação espanhol (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), pela Comunidade Autónoma de Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) e pelas subvenções MICINN (PID2020-113270RA-I00). A R. A-P é financiada pela Comunidade Autónoma de Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). O E.M.S. é financiado pela Max Planck Society, um prêmio de Investigador Avançado do Conselho Europeu de Pesquisa (subvenção 743216), DFG CRC 1080: Molecular and Cellular Mechanisms of Neural Homeostasis e DFG CRC 902: Molecular Principles of RNA-based Regulation. Agradecemos a D.C Dieterich e P. Landgraf por seu conselho técnico e pela síntese do DST-Alkyne. Agradecemos a E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast e à instalação de animais do MPI for Brain Research por seu excelente apoio. Agradecemos a Sandra Goebbels por compartilhar a linha de mouse Nex-Cre. Agradecemos a Antonio G. Carroggio por sua ajuda com a edição em inglês. B.A-C. projetou, conduziu e analisou experimentos. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. e S. t. D. realizou e analisou experimentos. B.A-C e E.M.S. projetaram experimentos e supervisionaram o projeto, B.A-C escreveu o artigo. Todos os autores editaram o artigo.

Todos os experimentos com animais foram realizados com permissão dos escritórios do governo local na Alemanha (RP Darmstadt; protocolos: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) ou Espanha (Comitê de Experimentos em Animais da UCM e Aconselhamento Ambiental da Comunidade de Madri, número de protocolo: PROEX 005.0/21) e estão em conformidade com as regras da Sociedade Max Planck e regulamentos espanhóis e seguem as diretrizes da UE para o bem-estar animal.
1. Marcação</em...

<ol>
	<li>Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+synaptic+protein+turnover.">The regulation of synaptic protein turnover.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).</li><li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+protein+synthesis,+synaptic+plasticity,+and+memory.">Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory.</a> Cell. 127 (1), 49-58 (2006).</li><li>Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+dynamics+during+homeostatic+scaling+in+cultured+neurons.">Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons.</a> Elife. 9, 52939 (2020).</li><li>Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+in+mice+as+affected+by+intracerebral+puromycin.">Memory in mice as affected by intracerebral puromycin.</a> Science. 141 (3575), 57-59 (1963).</li><li>Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling,+detection+and+identification+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).</li><li>Alvarez-Castelao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).</li><li>Ngo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-selective+metabolic+labeling+of+proteins.">Cell-selective metabolic labeling of proteins.</a> Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).</li><li>Mahdavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+aminoacyl-tRNA+synthetase+for+cell-selective+analysis+of+mammalian+protein+synthesis.">Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).</li><li>Yuet, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+proteomic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).</li><li>Patel, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+labeling+and+label-free+mass+spectrometry-based+proteomics+approaches.">A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches.</a> Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).</li><li>Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazo+transfer.">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).</li><li>Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BONCAT:+Metabolic+labeling,+click+chemistry,+and+affinity+purification+of+newly+synthesized+proteomes.">BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, 199-215 (2015).</li><li>Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins+by+immunoblotting.">Analysis of proteins by immunoblotting.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).</li><li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAPome:+a+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data.">The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).</li><li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li><li>Goebbels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+targeting+of+principal+neurons+in+neocortex+and+hippocampus+of+NEX-Cre+mice.">Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice.</a> Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).</li><li>van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+thiol-yne+addition+improves+the+specificity+of+strain-promoted+azide-alkyne+cycloaddition.">Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).</li><li>O'Fagain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilization+of+proteins.">Lyophilization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 244, 309-321 (2004).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+trapping+(S-Trap)+is+compatible+with+typical+protein+extraction+buffers+and+detergents+for+bottom-up+proteomics.">Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).</li><li>tom Dieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+newly+synthesized+target+proteins+in+situ.">Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ.</a> Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).</li><li>McShane, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+protein+stability+reveals+age-dependent+degradation.">Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation.</a> Cell. 167 (3), 803-815 (2016).</li><li>Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+non-canonical+amino+acids+into+the+developing+murine+proteome.">Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome.</a> Scientific Reports. 6, 32377 (2016).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUnSET,+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis.">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioID:+A+screen+for+protein-protein+interactions.">BioID: A screen for protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).</li></ol>

Os aspectos críticos do protocolo são; a inclusão de controles negativos, com replicações biológicas suficientes, via de administração de ANL, quantidade e duração, alquilação das amostras, concentração de alquinos e eliminação de β-mercaptoetanol ao usar o DST-alquino.
É fundamental incluir amostras de controle negativas provenientes de animais marcados com ANL sem condutor Cre e, portanto, sem expressão MetRS*. Essas amostras devem ser submetidas a todas as etapas descrita...

A homeostase proteica aberrante é causada por um desequilíbrio na síntese e degradação de proteínas. Diversas doenças estão relacionadas a alterações na homeostase proteica. A marca registrada de algumas doenças é a presença de agregados em diferentes locais subcelulares e áreas cerebrais. A homeostase proteica não é apenas importante na doença, mas também desempenha um papel crucial na função normal dos órgãos e células1. Por exemplo, a síntese proteica é necessária para muitas formas de plasticidade neuronal2,3, conforme determinado pelo uso de inibidores químicos que bloqueiam a síntese proteica4. No entanto, não está claro em quais tipos de células o proteoma é alterado para apoiar a aprendizagem e a memória, nem se entende quais proteínas específicas em cada tipo de célula aumentam ou diminuem sua síntese ou degradação. Assim, um estudo abrangente da homeostase de proteínas requer a capacidade de diferenciar proteomas provenientes de tipos específicos de células. De fato, a identificação de proteomas específicos do tipo celular para estudar processos celulares que ocorrem em um ambiente multicelular tem sido um obstáculo importante na proteômica. Por esse motivo, desenvolvemos uma técnica utilizando a expressão de MetRS* combinada com métodos bioortogonais que tem se mostrado uma forma eficaz de identificar e purificar proteomas específicos do tipo celular, preenchendo essa lacuna 5,6,7.
A expressão de um MetRS* mutante (MetRS L274G) permite a carga do ANL análogo à metionina não canônico no RNAt 8,9 correspondente e sua subsequente incorporação em proteínas. Quando a expressão de MetRS* é regulada por um promotor específico do tipo celular, o aminoácido não canônico será incorporado às proteínas de maneira seletiva celular. Uma vez que o ANL é incorporado nas proteínas, ele pode ser seletivamente funcionalizado por click-chemistry e, posteriormente, visualizado por imagem (FUNCAT) ou por Western Immunoblot (BONCAT). Alternativamente, as proteínas podem ser seletivamente purificadas e identificadas por espectrometria de massa (EM). Usando essa tecnologia, criamos uma linha de camundongo expressando a proteína MetRS* sob o controle da Cre recombinase. Considerando o crescente número de linhas de camundongos Cre disponíveis, o sistema MetRS* pode ser usado em qualquer campo para estudar qualquer tipo de célula de qualquer tecido para o qual exista uma linha Cre existente. A marcação de proteínas com ANL é possível in vitro ou in vivo, e não altera o comportamento do camundongo ou a integridade da proteína6. O período de tempo de rotulagem pode ser adaptado à questão científica de cada pesquisador, marcando proteínas recém-sintetizadas (tempos de rotulagem mais curtos) ou proteomas inteiros (tempos de rotulagem mais longos). O uso dessa técnica é limitado pelo número de células do tipo que o pesquisador está disposto a estudar; portanto, o isolamento proteico de tipos de células com baixo número ou baixas taxas metabólicas não é possível por este método. O objetivo do método apresentado é identificar proteínas/proteomas específicos do tipo celular marcados in vivo. Neste protocolo, descrevemos como rotular proteomas específicos do tipo celular com ANL em camundongos vivos e purificar as proteínas marcadas. Após a purificação, as proteínas podem ser identificadas por protocolos de espectrometria de massas de rotina 5,10. A redução da complexidade da amostra alcançada neste método pela purificação seletiva de proteínas de populações celulares específicas permite ao experimentador detectar mudanças sutis nos proteomas, por exemplo, em resposta a mudanças ambientais. A purificação das proteínas marcadas pode ser alcançada em ~10 dias, não incluindo a análise de EM ou o período de rotulagem. Aqui, descrevemos dois métodos para a administração de ANL em camundongos que expressam MetRS*, a saber: (1) adição do aminoácido na água potável e (2) introdução de ANL por injeções intraperitoneais. Independentemente do método escolhido para a administração de ANL, as etapas de isolamento e purificação são as mesmas (a partir da etapa 2).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12% Acrylamide gels</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL-HCl</td>
			<td>IrishBotech</td>
			<td>HAA1625.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin alkyne</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>B10185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken antibody anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Toxic; use a lab coat and gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (I) bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>254185</td>
			<td>99.999% (wt/wt)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disulfide tag (DST)-alkyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Merk</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodo acetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti chicken 800</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 800CW</td>
			<td>Donkey anti-Chicken Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti rabit 680</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 680RD</td>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Mixer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4259</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutrAvidin beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>29200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>J62036.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X pH 7.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation described in reference number 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD SpinTrap G-25 columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>23225</td>
			<td>Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-biotin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE&#160; Running buffer MOPS</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>M00138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table automatic Vortexer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Mixmate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triazole ligand</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line

Compreender a homeostase proteica in vivo é fundamental para saber como as células funcionam em condições fisiológicas e de doença. O presente protocolo descreve a marcação in vivo e a subsequente purificação de proteínas recém-sintetizadas usando uma linha de camundongos modificados para direcionar a marcação de proteínas para populações celulares específicas. É uma linhagem induzível pela expressão da Cre recombinase da L274G-Metionina tRNA sintetase (MetRS*), possibilitando a incorporação de azidonorleucina (ANL) às proteínas, o que de outra forma não ocorrerá. Usando o método descrito aqui, é possível purificar proteomas específicos do tipo celular marcados in vivo e detectar mudanças sutis no teor de proteína devido à redução da complexidade da amostra.

Seguindo o protocolo descrito (resumido na Figura 1), a ANL foi administrada a camundongos por injeções intraperitoneais diárias (400 mM de ANL 10 mL/kg, Nex-Cre::MetRS*) por 7 dias, ou via água potável (0,7% de Maltose, 1% de ANL, CamkII-Cre::MetRS*) por 21 dias. Após a rotulagem, as áreas cerebrais correspondentes foram dissecadas, lisadas, alquiladas e clicadas. As reações de cliques foram analisadas por SDS-PAGE e Western Immunoblot. Imagens representat...

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Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line

Este protocolo descreve como realizar a marcação de proteína específica do tipo celular com azidonorleucina (ANL) usando uma linha de camundongo expressando uma L274G-Metionina tRNA sintetase mutante (MetRS*) e as etapas necessárias para o isolamento de proteínas específicas do tipo celular marcadas. Delineamos duas possíveis vias de administração de ANL em camundongos vivos por (1) água potável e (2) injeções intraperitoneais.

Purificação e identificação de proteínas específicas do tipo celular de tecidos complexos usando uma linha de camundongo mutante de metionina tRNA sintetase

Understanding protein homeostasis in vivo is key to knowing how the cells work in both physiological and disease conditions. The present protocol ...

Este protocolo torna possível rotular proteínas de uma maneira específica do tipo celular. Esta é a primeira técnica que oferece tal possibilidade e pode ser feita in vitro ou in vivo. A principal vantagem da técnica é que as proteínas específicas do tipo celular marcadas podem ser purificadas não identificadas ou visualizadas in situ por imunofluorescência.Para começar a preparar o lisado de tecido, adicionando tampão de lise a um volume de 12 a 15 vezes o peso úmido do tecido e triturar o tecido até que ele seja homogeneizado. Aqueça este homogeneizado por 15 minutos a 75 graus Celsius para desnaturar a proteína, em seguida, centrifugar a amostra e transferir o sobrenadante para um novo tubo. Esta amostra pode ser armazenada a menos 80 graus Celsius.Em seguida, para alquilação, diluir a amostra homogeneizada duas a três vezes em tampão salino fosfato contendo um inibidor de protease livre de EDTA. Em seguida, adicione a iodoacetamida recém-preparada a uma concentração final de 20 milimoles. Deixe a amostra por uma a duas horas a 20 graus Celsius no escuro.Repita as etapas de adição e incubação de iodoacetamida duas vezes. Prepare a coluna de acordo com as instruções do fabricante, primeiro vórtice as colunas. Em seguida, retire a tampa cortando a parte inferior e centrifugando-a.Em seguida, execute uma troca de buffer primeiro equilibrando as colunas de troca de buffer usando o buffer de troca química de clique e, em seguida, trocando todas as amostras alquiladas. Para avaliar a incorporação de azidonorleucina pegue 40 microlitros da amostra aludida e adicione tampão salino fosfato a um volume final de 120 microlitros. Em seguida, configure a reação química do clique vortexing a reação por 20 segundos.Depois de adicionar cada reagente na ordem indicada o mais rápido possível, incubar as amostras no escuro a quatro graus Celsius durante a noite com rotação contínua. No dia seguinte, centrifugar as amostras por cinco minutos a 17.000 vezes G após a centrifugação, um pellet ligeiramente turquesa será visível. Transfira o sobrenadante para um novo tubo e armazene a amostra a menos 80 graus Celsius.Para purificação de proteína marcada. Submeter todas as amostras a um procedimento de troca de tampão, conforme demonstrado para limpar as sobras de alquino livre usando o tampão de ligação de neutravidina como tampão de equilíbrio. Em seguida, lave as contas de alta capacidade de neutravitina três vezes, misturando as contas com o tampão de ligação.Centrifugar a mistura, descartar o sobrenadante e repeti-lo três vezes. Em seguida, prepare uma pasta um-para-um, adicionando o mesmo volume de contas secas de neutravidina e tampão de ligação de neutravidina. Reserve 20 a 40 microlitros de cada amostra como lisado pré-purificado e armazene-o a menos 20 graus Celsius.Após a medição da concentração de proteína da amostra, misture um miligrama de proteína com 40 microlitros da pasta de miçangas. Incubar a mistura durante a noite a quatro graus Celsius com rotação contínua, permitindo que as proteínas marcadas se liguem às contas. No dia seguinte, recolher o sobrenadante por centrifugação.Separe uma alíquota de 20 a 40 microlitros do sobrenadante para análise posterior e congele o restante a menos 80 graus Celsius. Em seguida, lave as contas três vezes adicionando um tampão de lavagem de neutravidina refrigerado. Sedimentar as contas e descartar o sobrenadante.Em seguida, adicione o mesmo tampão e incube as contas por 10 minutos sob rotação contínua a quatro graus Celsius antes de descartar o sobrenadante. Repetir a lavagem com tampões de lavagem de neutravidina dois e três e eluir as proteínas clicadas incubando as contas por 30 minutos a 20 graus Celsius com um volume de tampão de eluição de neutravidina, correspondente a um volume das contas secas utilizadas. Durante a eluição, mantenha as contas em suspensão a 1000 rotações por minuto em um agitador de bloco térmico iludir duas vezes e combinar ambas as eluidas.As reações de cliques foram analisadas por SDS page e Western immuno blot. Imagens representativas dos experimentos são mostradas para a administração de azidonorleucina por injeção intraperitoneal e para a administração de azidonorleucina via água potável. Um outro experimento fornece um exemplo para a determinação da concentração ideal de alcina clivável de biotina dissulfureto.Neste exemplo, a mudança de dobra entre a amostra rotulada e o controle é maior na concentração de alquino micromolar 14. Um exemplo de um resultado de espectrometria de massa com um claro enriquecimento na amostra marcada com azidonorleucina em comparação com o controle é mostrado aqui. Essa diferença já era visível na coloração proteica total.Além das mudanças na intensidade do peptídeo, há também proteínas únicas encontradas em ambas as amostras. Este é um protocolo tecnicamente complexo e é um passo que deve ser cuidadosamente seguido usando alquilação de controles negativos adequados, limpeza adequada (indistinta) e adequada do arquivo não clicado. Nossos principais passos neste protocolo, as proteínas purificadas podem ser identificadas por espectrometria de massa se o interesse dos pesquisadores é estudar proteínas ou carregá-las em um gel para estudar proteínas de interesse por western blot.A capacidade deste método de marcar proteínas de uma origem celular específica tem muitas aplicações, como a tensão de proteínas ou o estudo da síntese proteica in vitro ou in vivo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Preparação de Synaptoneurosomes de rato Cortex usando um gradiente de densidade Percoll descontínuo Sacarose-

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Neurociência

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolando-LacZ expressar Células de tecidos de camundongos Inner Ear usando Citometria de Fluxo

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Isolamento e Quantificação da neurotoxina botulínica a partir de matrizes complexas usando os BoTest Matrix Ensaios

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Usando fluorescência celular ativado Classificando a Examine-Cell-tipo específico Expressão Gênica em Tissue cérebro de um rato

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Purificação de embarcações do cérebro do rato

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

Excitação externa de Neurônios Usando Campos Elétricos e Magnéticos em One e culturas bidimensionais

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Isolamento de Fima rápida e específica de oligodendrócitos primário de Mouse

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Quantificar a distribuição heterogênea de uma proteína sináptica no cérebro do rato utilizando imunofluorescência

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purificação de Prominin-1+ Células-tronco do Rato Pós-Natal Cerebellum

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...