Name: cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line
Uploaded: 2022-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line at JoVE.com

B.A-C финансируется Министерством науки и инноваций Испании (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), автономным сообществом Мадрида (Atracción de Talento-2019T1 /BMD-14057) и грантами MICINN (PID2020-113270RA-I00). R. A-P финансируется Автономным сообществом Мадрида (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. финансируется Обществом Макса Планка, премией Advanced Investigator от Европейского исследовательского совета (грант 743216), DFG CRC 1080: Молекулярные и клеточные механизмы нейронного гомеостаза и DFG CRC 902: Молекулярные принципы регуляции на основе РНК. Мы благодарим Д.К. Дитериха и. Ландграфа за их технические рекомендации и синтез DST-Alkyne. Мы благодарим E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast и лабораторию для животных MPI for Brain Research за их отличную поддержку. Мы благодарим Сандру Геббельс за то, что она поделилась линейкой мышей Nex-Cre. Мы благодарим Антонио Г. Карроджо за помощь в редактировании английского языка. Б.А-К. разрабатывал, проводил и анализировал эксперименты. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C.E. и S. t. Д. проводил и анализировал эксперименты. B.A-C и E.M.S. разрабатывали эксперименты и руководили проектом, B.A-C написал статью. Все авторы редактировали статью.

Все эксперименты с животными проводились с разрешения местных органов власти в Германии (RP Darmstadt; протоколы: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) или Испании (Комитет по экспериментам на животных в UCM и Экологическом консультировании Comunidad de Madrid, номер протокола: PROEX 005.0/21) и соответствуют правилам Об...

<ol>
	<li>Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+synaptic+protein+turnover.">The regulation of synaptic protein turnover.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).</li><li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+protein+synthesis,+synaptic+plasticity,+and+memory.">Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory.</a> Cell. 127 (1), 49-58 (2006).</li><li>Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+dynamics+during+homeostatic+scaling+in+cultured+neurons.">Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons.</a> Elife. 9, 52939 (2020).</li><li>Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+in+mice+as+affected+by+intracerebral+puromycin.">Memory in mice as affected by intracerebral puromycin.</a> Science. 141 (3575), 57-59 (1963).</li><li>Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling,+detection+and+identification+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).</li><li>Alvarez-Castelao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).</li><li>Ngo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-selective+metabolic+labeling+of+proteins.">Cell-selective metabolic labeling of proteins.</a> Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).</li><li>Mahdavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+aminoacyl-tRNA+synthetase+for+cell-selective+analysis+of+mammalian+protein+synthesis.">Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).</li><li>Yuet, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+proteomic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).</li><li>Patel, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+labeling+and+label-free+mass+spectrometry-based+proteomics+approaches.">A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches.</a> Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).</li><li>Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazo+transfer.">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).</li><li>Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BONCAT:+Metabolic+labeling,+click+chemistry,+and+affinity+purification+of+newly+synthesized+proteomes.">BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, 199-215 (2015).</li><li>Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins+by+immunoblotting.">Analysis of proteins by immunoblotting.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).</li><li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAPome:+a+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data.">The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).</li><li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li><li>Goebbels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+targeting+of+principal+neurons+in+neocortex+and+hippocampus+of+NEX-Cre+mice.">Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice.</a> Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).</li><li>van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+thiol-yne+addition+improves+the+specificity+of+strain-promoted+azide-alkyne+cycloaddition.">Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).</li><li>O'Fagain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilization+of+proteins.">Lyophilization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 244, 309-321 (2004).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+trapping+(S-Trap)+is+compatible+with+typical+protein+extraction+buffers+and+detergents+for+bottom-up+proteomics.">Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).</li><li>tom Dieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+newly+synthesized+target+proteins+in+situ.">Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ.</a> Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).</li><li>McShane, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+protein+stability+reveals+age-dependent+degradation.">Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation.</a> Cell. 167 (3), 803-815 (2016).</li><li>Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+non-canonical+amino+acids+into+the+developing+murine+proteome.">Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome.</a> Scientific Reports. 6, 32377 (2016).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUnSET,+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis.">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioID:+A+screen+for+protein-protein+interactions.">BioID: A screen for protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).</li></ol>

Важнейшими аспектами протокола являются: включение отрицательных контрольных групп, имеющих достаточное количество биологических реплик, путь введения ANL, количество и продолжительность, алкилирование образцов, концентрацию алкина и элиминацию β-меркаптоэтанола при использовании DS...

Аберрантный белковый гомеостаз вызван дисбалансом в синтезе и деградации белка. Некоторые заболевания связаны с изменениями в белковом гомеостазе. Отличительной чертой некоторых заболеваний является наличие агрегатов в разных субклеточных местах и областях мозга. Белковый гомеостаз не только важен при заболевании, но и играет решающую роль в нормальной функции органов и клеток1. Например, синтез белка необходим для многих форм нейрональной пластичности 2,3, что определяется применением химических ингибиторов, блокирующих синтез белка4. Однако неясно, в каких типах клеток протеом изменяется для поддержки обучения и памяти, и непонятно, какие специфические белки в каждом типе клеток увеличивают или уменьшают их синтез или деградацию. Таким образом, всестороннее изучение белкового гомеостаза требует способности дифференцировать протеомы, поступающие от определенных типов клеток. Действительно, идентификация специфических для клеточного типа протеомов для изучения клеточных процессов, происходящих в многоклеточной среде, была важным препятствием в протеомике. По этой причине мы разработали методику с использованием экспрессии MetRS* в сочетании с биоортогональными методами, которая оказалась эффективным способом выявления и очистки специфических протеомов клеточного типа, заполнив этот пробел 5,6,7.
Экспрессия мутантного MetRS* (MetRS L274G) позволяет загружать неканонический аналог метионина ANL в соответствующую тРНК 8,9 и его последующее включение в белки. Когда экспрессия MetRS* регулируется клеточным промотором, неканоническая аминокислота будет включена в белки клеточным селективным образом. Как только ANL включается в белки, он может быть избирательно функционализирован с помощью химии кликов и впоследствии либо визуализирован с помощью визуализации (FUNCAT), либо с помощью Западного иммуноблота (BONCAT). Альтернативно, белки могут быть селективно очищены и идентифицированы с помощью масс-спектрометрии (МС). Используя эту технологию, мы создали линию мыши, экспрессирующую белок MetRS* под контролем рекомбиназы Cre. Учитывая растущее число доступных линий Cre-mouse, система MetRS* может быть использована в любой области для изучения любого типа клеток из любой ткани, для которой существует существующая Cre-line. Маркировка белка ANL возможна in vitro или in vivo и не изменяет поведение мыши или целостность белка6. Промежуток времени маркировки может быть адаптирован к научному вопросу каждого исследователя, маркируя вновь синтезированные белки (более короткое время маркировки) или целые протеомы (более длительное время маркировки). Использование этой методики ограничено количеством клеток того типа, которые исследователь желает изучить; следовательно, выделение белка из типов клеток с низким количеством или низкой скоростью метаболизма невозможно с помощью этого метода. Целью представленного способа является идентификация специфических для клеток белков/протеомов, меченных in vivo. В этом протоколе мы описываем, как маркировать специфические для клеток протеомы ANL у живых мышей и очищать меченые белки. После очистки белки могут быть идентифицированы с помощью обычных протоколов масс-спектрометрии 5,10. Снижение сложности образца, достигаемое этим методом путем селективной очистки белков из конкретных клеточных популяций, позволяет экспериментатору обнаруживать тонкие изменения в протеомах, например, в ответ на изменения окружающей среды. Очистка меченых белков может быть достигнута за ~ 10 дней, не включая анализ РС или период маркировки. Здесь мы описываем два способа введения ANL мышам, экспрессирующим MetRS*, а именно: (1) добавление аминокислоты в питьевую воду и (2) введение ANL путем внутрибрюшинных инъекций. Независимо от метода, выбранного для введения ANL, этапы выделения и очистки одинаковы (начиная с шага 2).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12% Acrylamide gels</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL-HCl</td>
			<td>IrishBotech</td>
			<td>HAA1625.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin alkyne</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>B10185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken antibody anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Toxic; use a lab coat and gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (I) bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>254185</td>
			<td>99.999% (wt/wt)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disulfide tag (DST)-alkyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Merk</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodo acetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti chicken 800</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 800CW</td>
			<td>Donkey anti-Chicken Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti rabit 680</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 680RD</td>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Mixer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4259</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutrAvidin beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>29200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>J62036.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X pH 7.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation described in reference number 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD SpinTrap G-25 columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>23225</td>
			<td>Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-biotin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE&#160; Running buffer MOPS</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>M00138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table automatic Vortexer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Mixmate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triazole ligand</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line

Понимание белкового гомеостаза in vivo является ключом к пониманию того, как клетки работают как в физиологических, так и в болезненных условиях. Настоящий протокол описывает маркировку in vivo и последующую очистку вновь синтезированных белков с использованием инженерной мышиной линии для направления маркировки белка в конкретные клеточные популяции. Это индуцируемая линия cre рекомбиназы экспрессии L274G-метионин тРНК-синтетазы (MetRS*), обеспечивающая включение азидонорлейцина (ANL) в белки, что в противном случае не произойдет. Используя метод, описанный здесь, можно очистить специфические для клеток протеомы, помеченные in vivo , и обнаружить тонкие изменения в содержании белка из-за снижения сложности образца.

Следуя описанному протоколу (обобщенному на рисунке 1), ANL вводили мышам либо путем ежедневных внутрибрюшинных инъекций (400 мМ ANL 10 мл/кг, Nex-Cre::MetRS*) в течение 7 дней, либо через питьевую воду (0,7% мальтозы, 1% ANL, CamkII-Cre::MetRS*) в течение 21 дня. После маркировки соответ?...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line at JoVE.com

Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line

Этот протокол описывает, как выполнять маркировку белка клеточного типа с помощью азидонорлейцина (ANL) с использованием мышиной линии, экспрессирующей мутантную L274G-метионин-тРНК-синтетазу (MetRS*), и необходимые шаги для выделения меченых белков клеточного типа. Мы описываем два возможных пути введения ANL у живых мышей путем (1) питьевой воды и (2) внутрибрюшинных инъекций.

Очистка и идентификация специфических белков клеточного типа из сложных тканей с использованием мышиной линии мутантной метиониновой тРНК-синтетазы

Understanding protein homeostasis in vivo is key to knowing how the cells work in both physiological and disease conditions. The present protocol ...

Этот протокол позволяет маркировать белки специфическим для типа клеток способом. Это первая техника, которая предлагает такую возможность, и это можно сделать in vitro или in vivo. Основным преимуществом методики является то, что меченые белки типа клеток могут быть очищены неидентифицированными или визуализированными in situ иммунофлуоресцентными.Начать подготовку тканевого лизата можно с добавления буфера лизиса в объеме от 12 до 15 раз больше влажного веса ткани и тритурировать ткань до тех пор, пока она не гомогенизируется. Нагрейте этот гомогенат в течение 15 минут до 75 градусов цельсия, чтобы денатурировать белок, затем центрифугировать образец и перенести супернатант в новую трубку. Этот образец можно хранить при минус 80 градусах Цельсия.Далее для алкилирования разводят гомогенизированный образец два-три раза в фосфатном солевом буфере, содержащем ингибитор протеазы без ЭДТА. Затем добавляют свежеприготовленный йодоацетамид до конечной концентрации 20 миллимолей. Оставьте образец на один-два часа при температуре 20 градусов Цельсия в темноте.Повторите этапы добавления и инкубации йодоацетамида дважды. Подготовьте колонну в соответствии с инструкциями производителя, сначала вихрев колонны. Затем снимая крышку, разрезаем нижнюю часть и центрифугируем их.Затем выполните буферный обмен, сначала уравновешивая столбцы буферного обмена с помощью буфера обмена химией щелчка, а затем обмениваясь всеми алкилированными образцами. Для оценки включения азидонорлейцина берут 40 микролитров упомянутого образца и добавляют фосфатный солевой буфер к конечному объему 120 микролитров. Затем настройте химическую реакцию щелчка, вихрев реакцию в течение 20 секунд.После добавления каждого реагента в указанном порядке как можно быстрее, инкубируйте образцы в темноте при четырех градусах Цельсия в течение ночи с непрерывным вращением. На следующий день центрифугируйте образцы в течение пяти минут при 17 000 G после центрифугирования будет видна слегка бирюзовая гранула. Перенесите супернатант в новую пробирку и храните образец при минус 80 градусах Цельсия.Для маркировки белковой очистки. Подвергните все образцы процедуре буферного обмена, как показано для очистки остатков свободного алкина с использованием буфера связывания нейтравидина в качестве буфера равновесия. Затем трижды промыть бусины нейтравидина большой емкости, смешав бусины с буфером связывания.Центрифугируйте смесь, выбросьте супернатант и повторите это три раза. Затем приготовьте суспензию один к одному, добавив тот же объем нейтравидиновых сухих шариков и буфер связывания нейтравидина. Отложите от 20 до 40 микролитров каждого образца в качестве предварительно очищенного лизата и храните его при минус 20 градусах Цельсия.После измерения концентрации белка в образце смешайте один миллиграмм белка с 40 микролитрами шариковой суспензии. Инкубируйте смесь в течение ночи при четырех градусах Цельсия с непрерывным вращением, позволяя меченым белкам связываться с шариками. На следующий день собирают супернатант методом центрифугирования.Отложите от 20 до 40 микролитров аликвоты супернатанта в сторону для последующего анализа и заморозьте остальные при минус 80 градусах Цельсия. Затем трижды вымойте бусины, добавив охлажденный нейтравидин, промывочный буфер один. Осаждение бусин и выброс супернатанта.Затем добавьте тот же буфер и высиживайте шарики в течение 10 минут при непрерывном вращении при четырех градусах Цельсия, прежде чем выбросить супернатант. Повторите промывку нейтравидином, промывая буферами два и три, и элюируйте щелкающие белки, насиживая бусины в течение 30 минут при 20 градусах Цельсия с объемом буфера элюирования нейтравидина, соответствующего одному объему используемых сухих шариков. Во время элюирования выдерживайте бусины в суспензии со скоростью 1000 оборотов в минуту в термоблок шейкере дважды ускользают и соединяйте оба элюта.Реакции кликов были проанализированы с помощью SDS page и западного иммуноблота. Репрезентативные изображения экспериментов показаны для введения азидонорлейцина путем внутриперитонеальной инъекции и для введения азидонорлейцина через питьевую воду. Дальнейший эксперимент дает пример для определения оптимальной концентрации расщепляемого алкина дисульфида биотина.В этом примере изменение складки между меченым образцом и контролем является самым высоким при концентрации 14 микромолярного алкина. Здесь показан пример результата масс-спектрометрии с четким обогащением в образце, меченом азидонорлейцином, по сравнению с контролем. Эта разница уже была видна в общем белковом пятне.Помимо изменений интенсивности пептидов, в обоих образцах также обнаружены уникальные белки. Это технически сложный протокол, и этот шаг должен тщательно соблюдаться с использованием надлежащих отрицательных элементов управления алкилированием, правильной (неразборчиво) и адекватной очистки архива без щелчка. Наши ключевые шаги в этом протоколе, очищенные белки могут быть либо идентифицированы масс-спектрометрией, если исследователи заинтересованы в изучении белков, либо загрузить их в гель для изучения белков, представляющих интерес с помощью вестерн-блоттинга.Способность этого метода маркировать белки определенного клеточного происхождения имеет множество применений, таких как натяжение белков или изучение синтеза белка in vitro или in vivo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Подготовка Synaptoneurosomes от мыши Cortex использовании разрывных Перколла-Сахароза градиента плотности

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Изоляция LacZ экспрессирующие клетки из тканей мышей Внутреннее ухо использованием проточной цитометрии

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

Определение конкретных сенсорных нейронов населения для изучения выразил ионных каналов

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Выделение и количественная оценка ботулинического нейротоксина Из комплексных матриц с использованием BoTest Matrix Анализы

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Очистка сосудов головного мозга мыши

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

Внешнее возбуждение Нейроны Использование электрических и магнитных полей в одно- и двумерных культур

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Быстрые и конкретные иммуномагнитная изоляция первичной Олигодендроциты мыши

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Количественная оценка гетерогенных распределение синаптических белков в мозг мыши, с помощью иммунофлюоресценции

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Очистка Проминина-1- Стволовые клетки от постнатального мышиного церебеллума

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...