Name: cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line
Uploaded: 2022-04-13T14:00:00
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B.A-C está financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), por la Comunidad de Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) y las ayudas MICINN (PID2020-113270RA-I00). R. A-P está financiado por la Comunidad de Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. está financiado por la Sociedad Max Planck, un premio Advanced Investigator del Consejo Europeo de Investigación (subvención 743216), DFG CRC 1080: Mecanismos moleculares y celulares de la homeostasis neuronal, y DFG CRC 902: Principios moleculares de la regulación basada en ARN. Agradecemos a D.C Dieterich y P. Landgraf por su asesoramiento técnico y la síntesis del DST-Alkyne. Agradecemos a E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast y a la instalación animal del MPI for Brain Research por su excelente apoyo. Agradecemos a Sandra Goebbels por compartir la línea de ratones Nex-Cre. Agradecemos a Antonio G. Carroggio por su ayuda con la edición en inglés. B.A-C. Diseñé, conduje y analicé experimentos. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. y S. t. D. realizó y analizó experimentos. B.A-C y E.M.S. diseñaron experimentos, y supervisaron el proyecto, B.A-C escribió el artículo. Todos los autores editaron el artículo.

Todos los experimentos con animales se realizaron con permiso de las oficinas gubernamentales locales en Alemania (RP Darmstadt; protocolos: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) o España (Comité de Experimentación Animal de la UCM y Consejería Ambiental de la Comunidad de Madrid, número de protocolo: PROEX 005.0/21) y cumplen con las normas de la Sociedad Max Planck y la normativa española y siguen las directrices de la UE para el bienestar animal.
1. Etiquetado metab?...

<ol>
	<li>Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+synaptic+protein+turnover.">The regulation of synaptic protein turnover.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).</li><li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+protein+synthesis,+synaptic+plasticity,+and+memory.">Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory.</a> Cell. 127 (1), 49-58 (2006).</li><li>Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+dynamics+during+homeostatic+scaling+in+cultured+neurons.">Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons.</a> Elife. 9, 52939 (2020).</li><li>Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+in+mice+as+affected+by+intracerebral+puromycin.">Memory in mice as affected by intracerebral puromycin.</a> Science. 141 (3575), 57-59 (1963).</li><li>Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling,+detection+and+identification+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).</li><li>Alvarez-Castelao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).</li><li>Ngo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-selective+metabolic+labeling+of+proteins.">Cell-selective metabolic labeling of proteins.</a> Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).</li><li>Mahdavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+aminoacyl-tRNA+synthetase+for+cell-selective+analysis+of+mammalian+protein+synthesis.">Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).</li><li>Yuet, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+proteomic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).</li><li>Patel, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+labeling+and+label-free+mass+spectrometry-based+proteomics+approaches.">A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches.</a> Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).</li><li>Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazo+transfer.">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).</li><li>Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BONCAT:+Metabolic+labeling,+click+chemistry,+and+affinity+purification+of+newly+synthesized+proteomes.">BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, 199-215 (2015).</li><li>Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins+by+immunoblotting.">Analysis of proteins by immunoblotting.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).</li><li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAPome:+a+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data.">The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).</li><li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li><li>Goebbels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+targeting+of+principal+neurons+in+neocortex+and+hippocampus+of+NEX-Cre+mice.">Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice.</a> Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).</li><li>van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+thiol-yne+addition+improves+the+specificity+of+strain-promoted+azide-alkyne+cycloaddition.">Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).</li><li>O'Fagain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilization+of+proteins.">Lyophilization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 244, 309-321 (2004).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+trapping+(S-Trap)+is+compatible+with+typical+protein+extraction+buffers+and+detergents+for+bottom-up+proteomics.">Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).</li><li>tom Dieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+newly+synthesized+target+proteins+in+situ.">Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ.</a> Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).</li><li>McShane, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+protein+stability+reveals+age-dependent+degradation.">Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation.</a> Cell. 167 (3), 803-815 (2016).</li><li>Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+non-canonical+amino+acids+into+the+developing+murine+proteome.">Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome.</a> Scientific Reports. 6, 32377 (2016).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUnSET,+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis.">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioID:+A+screen+for+protein-protein+interactions.">BioID: A screen for protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).</li></ol>

Los aspectos críticos del protocolo son; la inclusión de controles negativos, tener suficientes réplicas biológicas, la vía de administración de ANL, la cantidad y la duración, la alquilación de las muestras, la concentración de alquinos y la eliminación de β-mercaptoetanol cuando se usa DST-alquino.
Es clave incluir muestras de control negativo procedentes de animales marcados con ANL sin conductor Cre y, por lo tanto, sin expresión de MetRS*. Estas muestras deben someterse a todo...

La homeostasis aberrante de proteínas es causada por un desequilibrio en la síntesis y degradación de proteínas. Varias enfermedades están relacionadas con alteraciones en la homeostasis de proteínas. El sello distintivo de algunas enfermedades es la presencia de agregados en diferentes ubicaciones subcelulares y áreas cerebrales. La homeostasis proteica no sólo es importante en la enfermedad, sino que también desempeña un papel crucial en la función normal de los órganos y las células1. Por ejemplo, la síntesis de proteínas es necesaria para muchas formas de plasticidad neuronal2,3, determinada por el uso de inhibidores químicos que bloquean la síntesis de proteínas4. Sin embargo, no está claro en qué tipos de células se altera el proteoma para apoyar el aprendizaje y la memoria, ni se entiende qué proteínas específicas en cada tipo de célula aumentan o disminuyen en su síntesis o degradación. Por lo tanto, un estudio exhaustivo de la homeostasis de proteínas requiere la capacidad de diferenciar proteomas provenientes de tipos celulares específicos. De hecho, la identificación de proteomas específicos de tipo celular para estudiar los procesos celulares que ocurren en un entorno multicelular ha sido un obstáculo importante en proteómica. Por esta razón, desarrollamos una técnica que utiliza la expresión de MetRS* combinada con métodos bio-ortogonales que ha demostrado ser una forma efectiva de identificar y purificar proteomas específicos de tipo celular, llenando este vacío 5,6,7.
La expresión de un mutante MetRS* (MetRS L274G) permite la carga del anl analfa de metionina no canónico en el ARNt 8,9 correspondiente y su posterior incorporación a proteínas. Cuando la expresión de MetRS* está regulada por un promotor específico de tipo celular, el aminoácido no canónico se incorporará a las proteínas de manera selectiva de la célula. Una vez que se incorpora ANL en las proteínas, puede ser funcionalizada selectivamente por química de clics y posteriormente visualizada por imágenes (FUNCAT) o por Western Immunoblot (BONCAT). Alternativamente, las proteínas pueden purificarse selectivamente e identificarse mediante espectrometría de masas (EM). Usando esta tecnología, creamos una línea de ratón que expresa la proteína MetRS* bajo el control de la recombinasa Cre. Teniendo en cuenta el creciente número de líneas de ratón Cre disponibles, el sistema MetRS* se puede utilizar en cualquier campo para estudiar cualquier tipo de célula de cualquier tejido para el que exista una línea Cre. El marcaje de proteínas con ANL es posible in vitro o in vivo, y no altera el comportamiento del ratón ni la integridad de las proteínas6. El período de tiempo de etiquetado se puede adaptar a la pregunta científica de cada investigador, etiquetando proteínas recién sintetizadas (tiempos de etiquetado más cortos) o proteomas completos (tiempos de etiquetado más largos). El uso de esta técnica está limitado por el número de células del tipo que el investigador está dispuesto a estudiar; Por lo tanto, el aislamiento de proteínas de tipos celulares con números bajos o bajas tasas metabólicas no es posible por este método. El objetivo del método presentado es identificar proteínas/proteomas específicos del tipo celular marcados in vivo. En este protocolo, describimos cómo etiquetar proteomas específicos de tipo celular con ANL en ratones vivos y purificar las proteínas marcadas. Después de la purificación, las proteínas pueden ser identificadas por protocolos de espectrometría de masas de rutina 5,10. La reducción de la complejidad de la muestra lograda en este método mediante la purificación selectiva de proteínas de poblaciones celulares específicas permite al experimentador detectar cambios sutiles en los proteomas, por ejemplo, en respuesta a cambios ambientales. La purificación de las proteínas marcadas se puede lograr en ~ 10 días, sin incluir el análisis de MS o el período de etiquetado. Aquí, describimos dos métodos para la administración de ANL a ratones que expresan MetRS*, a saber, (1) agregar el aminoácido en el agua potable y (2) introducir ANL mediante inyecciones intraperitoneales. Independientemente del método elegido para la administración de ANL, los pasos de aislamiento y purificación son los mismos (a partir del paso 2).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12% Acrylamide gels</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL-HCl</td>
			<td>IrishBotech</td>
			<td>HAA1625.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin alkyne</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>B10185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken antibody anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Toxic; use a lab coat and gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (I) bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>254185</td>
			<td>99.999% (wt/wt)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disulfide tag (DST)-alkyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Merk</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodo acetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti chicken 800</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 800CW</td>
			<td>Donkey anti-Chicken Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti rabit 680</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 680RD</td>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Mixer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4259</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutrAvidin beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>29200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>J62036.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X pH 7.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation described in reference number 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD SpinTrap G-25 columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>23225</td>
			<td>Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-biotin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE&#160; Running buffer MOPS</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>M00138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table automatic Vortexer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Mixmate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triazole ligand</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line

Comprender la homeostasis de proteínas in vivo es clave para saber cómo funcionan las células tanto en condiciones fisiológicas como de enfermedad. El presente protocolo describe el etiquetado in vivo y la posterior purificación de proteínas recién sintetizadas utilizando una línea de ratón diseñada para dirigir el etiquetado de proteínas a poblaciones celulares específicas. Es una línea inducible por la expresión de Cre recombinasa de L274G-Metionina ARNt sintetasa (MetRS*), lo que permite la incorporación de azidonorleucina (ANL) a las proteínas, que de otro modo no ocurrirá. Utilizando el método descrito aquí, es posible purificar proteomas específicos de tipo celular marcados in vivo y detectar cambios sutiles en el contenido de proteínas debido a la reducción de la complejidad de la muestra.

Siguiendo el protocolo descrito (resumido en la Figura 1), se administró ANL a ratones mediante inyecciones intraperitoneales diarias (400 mM ANL 10 mL/kg, Nex-Cre::MetRS*) durante 7 días, o a través de agua potable (0,7% maltosa, 1% ANL, CamkII-Cre::MetRS*) durante 21 días. Después del etiquetado, las áreas cerebrales correspondientes fueron diseccionadas, lisadas, alquiladas y clicadas. Las reacciones de clic fueron analizadas por SDS-PAGE y Western Immunob...

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Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line

Este protocolo describe cómo realizar el marcado de proteínas específicas del tipo celular con azidonorleucina (ANL) utilizando una línea de ratón que expresa una sintetasa de ARNt de L274G-Metionina mutante (MetRS*) y los pasos necesarios para el aislamiento de proteínas específicas de tipo celular marcadas. Describimos dos posibles vías de administración de ANL en ratones vivos mediante (1) agua potable y (2) inyecciones intraperitoneales.

Purificación e identificación de proteínas específicas de tipo celular a partir de tejidos complejos utilizando una línea de ratón de ARNt sintetasa de metionina mutante

Understanding protein homeostasis in vivo is key to knowing how the cells work in both physiological and disease conditions. The present protocol ...

Este protocolo permite etiquetar proteínas de una manera específica para el tipo de célula. Esta es la primera técnica que ofrece tal posibilidad y se puede hacer in vitro o in vivo. La principal ventaja de la técnica es que las proteínas específicas del tipo celular marcado pueden purificarse sin identificar o visualizarse in situ mediante inmunofluorescentes.Para comenzar a preparar el lisado tisular añadiendo tampón de lisis a un volumen de 12 a 15 veces el peso húmedo del tejido y triturar el tejido hasta homogeneizarlo. Caliente este homogeneizado durante 15 minutos a 75 grados centígrados para desnaturalizar la proteína, luego centrifugar la muestra y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Esta muestra se puede almacenar a menos 80 grados centígrados.A continuación, para la alquilación, diluya la muestra homogeneizada de dos a tres veces en tampón salino fosfato que contenga un inhibidor de la proteasa libre de EDTA. Luego agregue yodoacetamida recién preparada a una concentración final de 20 milimoles. Deje la muestra durante una o dos horas a 20 grados centígrados en la oscuridad.Repita los pasos de adición e incubación de yodoacetamida dos veces. Prepare la columna según las instrucciones del fabricante primero haciendo vórtice de las columnas. Luego retirando la tapa cortando la parte inferior y centrifugandolas.A continuación, realice un intercambio de búfer equilibrando primero las columnas de intercambio de búfer utilizando el búfer de intercambio de química de clic y, a continuación, intercambiando todas las muestras alquiladas. Para evaluar la incorporación de azidonorleucina tomar 40 microlitros de la muestra aludida y añadir tampón salino fosfato a un volumen final de 120 microlitros. Luego configure la reacción química de clic haciendo vórtice la reacción durante 20 segundos.Después de agregar cada reactivo en el orden indicado lo más rápido posible, incubar las muestras en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante la noche con rotación continua. Al día siguiente, centrifugar las muestras durante cinco minutos a 17, 000 veces G después de la centrifugación se verá un pellet ligeramente turquesa. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y almacene la muestra a menos 80 grados centígrados.Para purificación de proteínas etiquetadas. Someter todas las muestras a un procedimiento de intercambio de tampón como se demuestra para limpiar las sobras de alquino libre utilizando el tampón de unión de neutravidina como tampón de equilibrio. Luego lave las perlas de neutravidina de alta capacidad tres veces mezclando las perlas con el tampón de unión.Centrifuga la mezcla, desecha el sobrenadante y repite esto tres veces. Luego prepare una suspensión uno a uno agregando el mismo volumen de perlas secas de neutravidina y tampón de unión de neutravidina. Guarde de 20 a 40 microlitros de cada muestra como lisado prepurificado y guárdelo a menos 20 grados centígrados.Después de medir la concentración de proteína de la muestra, mezcle un miligramo de proteína con 40 microlitros de la suspensión de perlas. Incubar la mezcla durante la noche a cuatro grados centígrados con rotación continua que permite que las proteínas marcadas se unan a las perlas. Al día siguiente recoger el sobrenadante por centrifugación.Coloque una alícuota de 20 a 40 microlitros del sobrenadante a un lado para su posterior análisis y congele el resto a menos 80 grados centígrados. A continuación, lave las perlas tres veces agregando un tampón de lavado de neutravidina enfriado. Sedimentar las cuentas y desechar el sobrenadante.Luego agregue el mismo tampón e incube las perlas durante 10 minutos bajo rotación continua a cuatro grados centígrados antes de desechar el sobrenadante. Repita el lavado con los amortiguadores de lavado de neutravidina dos y tres, y eluya las proteínas clicadas incubando las perlas durante 30 minutos a 20 grados centígrados con un volumen de tampón de elución de neutravidina, correspondiente a un volumen de las perlas secas utilizadas. Durante la elución, mantenga las perlas en suspensión a 1000 revoluciones por minuto en un agitador de bloque térmico eludir dos veces y combine ambos eluidos.Las reacciones de clic se analizaron mediante la página SDS y Western immuno blot. Se muestran imágenes representativas de los experimentos para la administración de azidonorleucina por inyección intraperitoneal y para la administración de azidonorleucina a través del agua potable. Otro experimento proporciona un ejemplo para la determinación de la concentración óptima de alquino escindible de biotina disulfuro.En este ejemplo, el cambio de pliegue entre la muestra marcada y el control es más alto a 14 Concentración de alquino micromolar. Aquí se muestra un ejemplo de un resultado de espectrometría de masas con un enriquecimiento claro en la muestra marcada con azidonorleucina en comparación con el control. Esta diferencia ya era visible en la tinción de proteína total.Además de los cambios en la intensidad del péptido, también hay proteínas únicas que se encuentran en ambas muestras. Este es un protocolo técnicamente complejo y es un paso que debe seguirse cuidadosamente utilizando la alquilación de controles negativos adecuados, la limpieza adecuada (indistinta) y adecuada del archivo sin clic. Nuestros pasos clave en este protocolo, las proteínas purificadas pueden identificarse mediante espectrometría de masas si el interés de los investigadores es estudiar proteínas o cargarlas en un gel para estudiar proteínas de interés por Western blot.La capacidad de este método para marcar proteínas de un origen celular específico tiene muchas aplicaciones como la tensión de proteínas o el estudio de la síntesis de proteínas in vitro o in vivo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Preparación de Synaptoneurosomes de ratón con una corteza discontinua de Percoll-sacarosa gradiente de densidad

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Investigación

Neurociencias

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Aislar las células que expresan LacZ de tejidos de ratón del oído interno mediante citometría de flujo

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

El aislamiento y la cuantificación de la neurotoxina botulínica A partir de matrices complejas utilizando el BoTest Matrix Ensayos

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Utilizando fluorescencia clasificación de células activadas para examinar Cell-tipo-específica la expresión génica en el tejido de cerebro de rata

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Purification of Mouse Brain Vessels

La purificación de los buques de cerebro de ratón

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

La excitación externa de neuronas usando campos eléctricos y magnéticos en culturas de una y dos dimensiones

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Aislamiento Inmunomagnética rápida y específica de los oligodendrocitos primarios de ratón

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Cuantificar la distribución heterogénea de una proteína sináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purificación de Prominin-1+ Células Madre del Cerebelo de Ratón Postnatal

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...