Name: cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line
Uploaded: 2022-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line at JoVE.com

B.A-C finansieras av det spanska ministeriet för vetenskap och innovation (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), av den autonoma regionen Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) och MICINN (PID2020-113270RA-I00) bidrag. R. A-P finansieras av den autonoma regionen Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. finansieras av Max Planck Society, ett Advanced Investigator-pris från European Research Council (grant 743216), DFG CRC 1080: Molecular and Cellular Mechanisms of Neural Homeostasis och DFG CRC 902: Molecular Principles of RNA-based Regulation. Vi tackar D.C Dieterich och P. Landgraf för deras tekniska råd och syntesen av DST-Alkyne. Vi tackar E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast och djuranläggningen för MPI for Brain Research för deras utmärkta stöd. Vi tackar Sandra Goebbels för att hon delade Nex-Cre-muslinjen. Vi tackar Antonio G. Carroggio för hans hjälp med engelsk redigering. B.A-C. designade, genomförde och analyserade experiment. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. och S. t. D. genomförde och analyserade experiment. B.A-C och E.M.S. designade experiment och övervakade projektet, B.A-C skrev tidningen. Alla författare redigerade tidningen.

Alla djurförsök utfördes med tillstånd från de lokala regeringskontoren i Tyskland (RP Darmstadt; protokoll: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) eller Spanien (kommittén för djurförsök vid UCM och miljörådgivning i Comunidad de Madrid, protokollnummer: PROEX 005.0/21) och följer Max Planck Societys regler och spanska förordningar och följer EU:s riktlinjer för djurskydd.
1. In vivo metabolisk märkning med ANL
<ol><li>Dricksvatten:<ol><li>L?...

<ol>
	<li>Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+synaptic+protein+turnover.">The regulation of synaptic protein turnover.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).</li><li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+protein+synthesis,+synaptic+plasticity,+and+memory.">Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory.</a> Cell. 127 (1), 49-58 (2006).</li><li>Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+dynamics+during+homeostatic+scaling+in+cultured+neurons.">Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons.</a> Elife. 9, 52939 (2020).</li><li>Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+in+mice+as+affected+by+intracerebral+puromycin.">Memory in mice as affected by intracerebral puromycin.</a> Science. 141 (3575), 57-59 (1963).</li><li>Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling,+detection+and+identification+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).</li><li>Alvarez-Castelao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).</li><li>Ngo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-selective+metabolic+labeling+of+proteins.">Cell-selective metabolic labeling of proteins.</a> Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).</li><li>Mahdavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+aminoacyl-tRNA+synthetase+for+cell-selective+analysis+of+mammalian+protein+synthesis.">Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).</li><li>Yuet, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+proteomic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).</li><li>Patel, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+labeling+and+label-free+mass+spectrometry-based+proteomics+approaches.">A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches.</a> Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).</li><li>Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazo+transfer.">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).</li><li>Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BONCAT:+Metabolic+labeling,+click+chemistry,+and+affinity+purification+of+newly+synthesized+proteomes.">BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, 199-215 (2015).</li><li>Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins+by+immunoblotting.">Analysis of proteins by immunoblotting.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).</li><li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAPome:+a+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data.">The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).</li><li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li><li>Goebbels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+targeting+of+principal+neurons+in+neocortex+and+hippocampus+of+NEX-Cre+mice.">Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice.</a> Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).</li><li>van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+thiol-yne+addition+improves+the+specificity+of+strain-promoted+azide-alkyne+cycloaddition.">Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).</li><li>O'Fagain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilization+of+proteins.">Lyophilization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 244, 309-321 (2004).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+trapping+(S-Trap)+is+compatible+with+typical+protein+extraction+buffers+and+detergents+for+bottom-up+proteomics.">Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).</li><li>tom Dieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+newly+synthesized+target+proteins+in+situ.">Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ.</a> Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).</li><li>McShane, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+protein+stability+reveals+age-dependent+degradation.">Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation.</a> Cell. 167 (3), 803-815 (2016).</li><li>Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+non-canonical+amino+acids+into+the+developing+murine+proteome.">Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome.</a> Scientific Reports. 6, 32377 (2016).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUnSET,+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis.">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioID:+A+screen+for+protein-protein+interactions.">BioID: A screen for protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).</li></ol>

De kritiska aspekterna av protokollet är; Införande av negativa kontroller, med tillräckligt med biologiska replikat, administreringsväg för ANL, mängd och varaktighet, alkylering av proverna, alkynkoncentration och eliminering av β-merkaptoetanol vid användning av DST-alkyn.
Det är viktigt att inkludera negativa kontrollprover från ANL-märkta djur utan Cre-drivrutin och därför inget MetRS*-uttryck. Dessa prover måste utsättas för varje steg som beskrivs i protokollet parallell...

Avvikande proteinhomeostas orsakas av en obalans i proteinsyntes och nedbrytning. Flera sjukdomar är relaterade till förändringar i proteinhomeostas. Kännetecknet för vissa sjukdomar är närvaron av aggregat i olika subcellulära platser och hjärnområden. Proteinhomeostas är inte bara viktigt vid sjukdom utan spelar också en avgörande roll i normal organ- och cellulär funktion1. Till exempel är proteinsyntes nödvändig för många former av neuronal plasticitet2,3, vilket bestäms av användningen av kemiska hämmare som blockerar proteinsyntes4. Det är emellertid varken klart i vilka celltyper proteomet förändras för att stödja inlärning och minne, och det är inte heller förstått vilka specifika proteiner i varje celltyp som ökar eller minskar deras syntes eller nedbrytning. Således kräver en omfattande studie av proteinhomeostas förmågan att differentiera proteomer som kommer från specifika celltyper. Faktum är att identifieringen av celltypspecifika proteomer för att studera cellulära processer som förekommer i en flercellig miljö har varit ett viktigt hinder i proteomik. Av denna anledning utvecklade vi en teknik med MetRS*-uttryck i kombination med bio-ortogonala metoder som har visat sig vara ett effektivt sätt att identifiera och rena cellspecifika proteomer och fylla detta gap 5,6,7.
Uttrycket av en mutant MetRS* (MetRS L274G) möjliggör laddning av den icke-kanoniska metioninanalogen ANL i motsvarande tRNA 8,9 och dess efterföljande införlivande i proteiner. När MetRS*-uttryck regleras av en celltypspecifik promotor kommer den icke-kanoniska aminosyran att införlivas i proteinerna på ett cellselektivt sätt. När ANL har införlivats i proteinerna kan det selektivt funktionaliseras genom klickkemi och därefter antingen visualiseras genom avbildning (FUNCAT) eller genom Western Immunoblot (BONCAT). Alternativt kan proteiner selektivt renas och identifieras med masspektrometri (MS). Med hjälp av denna teknik skapade vi en muslinje som uttrycker MetRS*-proteinet under kontroll av Cre-rekombinaset. Med tanke på det ökande antalet tillgängliga Cre-mouse-linjer kan MetRS*-systemet användas inom vilket område som helst för att studera vilken celltyp som helst från vilken vävnad som helst för vilken det finns en befintlig Cre-line. Proteinmärkning med ANL är möjlig in vitro eller in vivo och förändrar inte musens beteende eller proteinintegritet6. Märkningstidsspann kan anpassas till den vetenskapliga frågan för varje forskare, märkning av nyligen syntetiserade proteiner (kortare märkningstider) eller hela proteomer (längre märkningstider). Användningen av denna teknik begränsas av antalet celler av den typ som forskaren är villig att studera; därför är proteinisolering från celltyper med lågt antal eller låga metaboliska hastigheter inte möjlig med denna metod. Målet med den presenterade metoden är att identifiera celltypsspecifika proteiner/proteomer märkta in vivo. I detta protokoll beskriver vi hur man märker celltypspecifika proteom med ANL i levande möss och renar de märkta proteinerna. Efter rening kan proteiner identifieras med hjälp av rutinmässiga masspektrometriprotokoll 5,10. Minskningen av provkomplexiteten som uppnås i denna metod genom selektiv rening av proteiner från specifika cellulära populationer gör det möjligt för experimentet att detektera subtila förändringar i proteomer, till exempel som svar på miljöförändringar. Rening av de märkta proteinerna kan uppnås på ~ 10 dagar, exklusive MS-analysen eller märkningsperioden. Här beskriver vi två metoder för ANL-administrering till MetRS*-uttryckande möss, nämligen (1) tillsats av aminosyran i dricksvattnet och (2) införande av ANL genom intraperitoneala injektioner. Oavsett vilken metod som valts för administrering av ANL är isolerings- och reningsstegen desamma (från steg 2 och framåt).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12% Acrylamide gels</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL-HCl</td>
			<td>IrishBotech</td>
			<td>HAA1625.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin alkyne</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>B10185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken antibody anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Toxic; use a lab coat and gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (I) bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>254185</td>
			<td>99.999% (wt/wt)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disulfide tag (DST)-alkyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Merk</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodo acetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti chicken 800</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 800CW</td>
			<td>Donkey anti-Chicken Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti rabit 680</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 680RD</td>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Mixer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4259</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutrAvidin beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>29200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>J62036.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X pH 7.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation described in reference number 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD SpinTrap G-25 columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>23225</td>
			<td>Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-biotin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE&#160; Running buffer MOPS</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>M00138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table automatic Vortexer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Mixmate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triazole ligand</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line

Att förstå proteinhomeostas in vivo är nyckeln till att veta hur cellerna fungerar i både fysiologiska och sjukdomstillstånd. Detta protokoll beskriver in vivo-märkning och efterföljande rening av nyligen syntetiserade proteiner med hjälp av en konstruerad muslinje för att rikta proteinmärkning till specifika cellulära populationer. Det är en inducerbar linje genom Cre-rekombinasuttryck av L274G-metionintRNA-syntetas (MetRS*), vilket möjliggör azidonorleucin (ANL) införlivande till proteinerna, vilket annars inte kommer att inträffa. Med hjälp av den metod som beskrivs här är det möjligt att rena celltypspecifika proteomer märkta in vivo och detektera subtila förändringar i proteininnehållet på grund av provkomplexitetsreduktion.

Efter det beskrivna protokollet (sammanfattat i figur 1) administrerades ANL till möss antingen genom dagliga intraperitoneala injektioner (400 mM ANL 10 ml/kg, Nex-Cre::MetRS*) i 7 dagar, eller via dricksvatten (0,7 % maltos, 1 % ANL, CamkII-Cre::MetRS*) i 21 dagar. Efter märkning dissekerades motsvarande hjärnområden, lyserades, alkylerades och klickades. Klickreaktioner analyserades av SDS-PAGE och Western Immunoblot. Representativa bilder av experimenten vi...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line at JoVE.com

Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line

Detta protokoll beskriver hur man utför celltypspecifik proteinmärkning med azidonorleucin (ANL) med hjälp av en muslinje som uttrycker ett mutant L274G-metionin-tRNA-syntetas (MetRS*) och de nödvändiga stegen för märkt celltypspecifik proteinisolering. Vi beskriver två möjliga ANL-administreringsvägar i levande möss med (1) dricksvatten och (2) intraperitoneala injektioner.

Celltypspecifik proteinrening och identifiering från komplexa vävnader med hjälp av en mutant metionin tRNA-syntetasmuslinje

Understanding protein homeostasis in vivo is key to knowing how the cells work in both physiological and disease conditions. The present protocol ...

Detta protokoll gör det möjligt att märka proteiner på ett celltypspecifikt sätt. Detta är den första tekniken som erbjuder en sådan möjlighet och det kan göras in vitro eller in vivo. Den största fördelen med tekniken är att de märkta celltypsspecifika proteinerna kan renas oidentifierade eller visualiseras in situ av immunofluorescerande.För att börja förbereda vävnadslysatet genom att tillsätta lysbuffert vid en volym av 12 till 15 gånger vävnadens våtvikt och triturate vävnaden tills den är homogeniserad. Värm detta homogenat i 15 minuter till 75 grader Celsius för att denaturera proteinet, centrifugera sedan provet och överför supernatanten till ett nytt rör. Detta prov kan lagras vid minus 80 grader Celsius.Därefter späd det homogeniserade provet två till tre gånger för alkylering i fosfatsaltlösningsbuffert innehållande en EDTA-fri proteashämmare. Tillsätt sedan nyberedd jodoacetamid till en slutlig koncentration av 20 millimol. Lämna provet i en till två timmar vid 20 grader Celsius i mörkret.Upprepa jodoacetamidtillsatsen och inkubationsstegen två gånger. Förbered kolumnen enligt tillverkarens instruktioner genom att först virvla kolumnerna. Ta sedan bort locket som skär bottendelen och centrifugerar dem.Utför sedan ett buffertutbyte genom att först balansera buffertutbyteskolumnerna med hjälp av klickkemiutbytesbufferten och sedan utbyta alla alkylerade prover. För att utvärdera azidonorleucininkorporeringen, ta 40 mikroliter av det anspelade provet och tillsätt fosfatsaltlösningsbuffert till en slutlig volym på 120 mikroliter. Ställ sedan in klickkemireaktionen genom att virvla reaktionen i 20 sekunder.Efter tillsats av varje reagens i angiven ordning så snabbt som möjligt, inkubera proverna i mörkret vid fyra grader Celsius över natten med kontinuerlig rotation. Följande dag centrifugera proverna i fem minuter vid 17 000 gånger G efter centrifugering kommer en något turkos pellet att synas. Överför supernatanten till ett nytt rör och förvara provet vid minus 80 grader Celsius.För märkt proteinrening. Utsätt alla prover för ett buffertutbytesförfarande som visat sig rengöra rester av fri alkyn med neutravidinbindande buffert som jämviktsbuffert. Tvätta sedan neutravidinpärlorna med hög kapacitet tre gånger genom att blanda pärlorna med bindningsbufferten.Centrifugera blandningen, kassera supernatanten och upprepa detta tre gånger. Förbered sedan en en-till-en-uppslamning genom att tillsätta samma volym neutravidin torra pärlor och neutravidinbindande buffert. Lägg åt sidan 20 till 40 mikroliter av varje prov som förrenat lysat och förvara det vid minus 20 grader Celsius.Efter mätning av proteinkoncentrationen i provet blanda ett milligram protein med 40 mikroliter av pärluppslamningen. Inkubera blandningen över natten vid fyra grader Celsius med kontinuerlig rotation som gör att de märkta proteinerna kan binda till pärlorna. Följande dag samla supernatanten genom centrifugering.Ställ en alikvot på 20 till 40 mikroliter av supernatanten åt sidan för senare analys och frys resten vid minus 80 grader Celsius. Tvätta sedan pärlorna tre gånger genom att tillsätta kyld neutravidin tvättbuffert en. Sedimentera pärlorna och kassera supernatanten.Tillsätt sedan samma buffert och inkubera pärlorna i 10 minuter under kontinuerlig rotation vid fyra grader Celsius innan supernatanten kasseras. Upprepa tvätten med neutravidintvättbuffertar två och tre och eluera de klickade proteinerna genom att inkubera pärlorna i 30 minuter vid 20 grader Celsius med en volym neutravidin elueringsbuffert, motsvarande en volym av de använda torra pärlorna. Under elueringen, håll pärlorna i suspension vid 1000 varv per minut i en termoblockskakare undviker två gånger och kombinerar båda eluerna.Klickreaktioner analyserades av SDS-sida och Western immuno blot. Representativa bilder av experimenten visas för administrering av azidonorleucin genom intra peritoneal injektion och för administrering av azidonorleucin via dricksvatten. Ett ytterligare experiment ger ett exempel för bestämning av den optimala disulfidbiotinklyvbara alkynkoncentrationen.I det här exemplet är vikförändringen mellan det märkta provet och kontrollen högst vid 14 mikromolär alkynkoncentration. Ett exempel på ett masspektrometriresultat med en tydlig anrikning i det azidonorleucinmärkta provet jämfört med kontrollen visas här. Denna skillnad var redan synlig i den totala proteinfläcken.Förutom förändringar i peptidintensitet finns det också unika proteiner som finns i båda proverna. Detta är ett tekniskt komplext protokoll och det är ett steg som måste följas noggrant med hjälp av korrekt negativ kontroll alkylering, korrekt (otydlig) och adekvat rengöring av icke-klickarkivet. Våra viktigaste steg i detta protokoll, renade proteiner kan antingen identifieras med masspektrometri om forskarnas intresse är att studera proteiner eller ladda det i en gel för att studera proteiner av intresse av western blot.Förmågan hos denna metod att märka proteiner från ett specifikt cellulärt ursprung har många tillämpningar, såsom spänningen av proteiner eller studien av proteinsyntes in vitro eller in vivo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Beredning av Synaptoneurosomes från mus Cortex med en kontinuerliga Percoll-Sackaros densitetsgradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolera LacZ-uttryckande celler från mus Inre öronvävnader med flödescytometri

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Isolering och kvantifiering av botulinneurotoxin Från Komplexa matriser med de BoTest Matrix Analyser

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Använda Fluorescensaktiverad cellsortering för att Undersök Cell-Type-Specific Gene Expression i råtthjärnvävnad

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Rening av Mouse Brain Fartyg

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

Extern Excite av nervceller Använda elektriska och magnetiska fält i en-och två-dimensionella kulturer

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Snabb och specifika immunmagnetisk isolering av mus primära oligodendrocyter

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Kvantifiera heterogen fördelning av ett Synaptic Protein i mus hjärnan med hjälp av immunofluorescens

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Rening av Prominin-1+ stamceller från Postnatal Mus Cerebellum

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...