Name: in situ hybridization combined with immunohistochemistry in cryosectioned zebrafish embryos
Uploaded: 2022-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة نانتونغ للعلوم والتكنولوجيا في الصين (MS12019011) ، ومؤسسة نانتونغ للعلوم والتكنولوجيا في الصين (JC2021058) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو (21KJB180009).

تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان بجامعة نانتونغ (رقم S20191210-402).
1. مجموعة من أجنة الزرد
<ol><li>قم بإعداد زوج من أسماك الزرد في أحواض تربية في الليلة السابقة لجمع البيض ، أحدهما من الزرد المعدل وراثيا والآخر من ن?...

<ol>
	<li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li><li>Chen, E., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+genomics+research+model.">Zebrafish as a genomics research model.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).</li><li>Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: <a target="_blank" href="https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it">https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it</a> (2018)</li><li>Akam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+location+of+ultrabithorax+transcripts+in+Drosophila+tissue+sections.">The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections.</a> EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).</li><li>Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+in+situ+hybridization+method+for+the+detection+of+cellular+RNAs+in+Drosophila+tissue+sections+and+its+application+for+localizing+transcripts+of+the+homeotic+Antennapedia+gene+complex.">An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex.</a> EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).</li><li>Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryos+and+young+larvae.">In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).</li><li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification.">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li><li>Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+genetic+tools+for+studying+vertebrate+development.">Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development.</a> Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).</li><li>Cunningham, R. L., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry+for+zebrafish+larvae.">Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+5-HT(2C)+receptors+regulate+anxiety-like+behavior.">Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior.</a> Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).</li><li>Ferguson, J. L., Shive, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+immunofluorescence+and+immunohistochemistry+on+cryosectioned+zebrafish+embryos.">Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).</li><li>Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunohistochemistry+in+zebrafish+embryos+and+larvae.">Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).</li><li>Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+whole-mount+immunohistochemistry+of+zebrafish+(Danio+rerio)+embryos+and+larvae+protocol.">General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).</li><li>O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Garbage+in,+garbage+out:+a+critical+evaluation+of+strategies+used+for+validation+of+immunohistochemical+biomarkers.">Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers.</a> Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).</li></ol>

يقترح هذا البروتوكول مزيجا من التهجين في الموقع والكيمياء الهيستولوجية المناعية ، وهي خطوة مهمة في تجارب التوطين المشترك على أجنة الزرد. تعمل هذه الطريقة كطريقة سهلة وفعالة لتحليل mRNA واحد وبروتين واحد في وقت واحد. تم إجراء التهجين في الموقع وتلطيخ الأجسام المضادة على أجنة الزرد...

الزرد هو نموذج قوي للفقاريات لدراسات التنمية وعلم الوراثة1،2. يشترك الزرد والبشر في التماثل الجيني العالي (70٪ من الجينات مشتركة مع الجينوم البشري) ، مما يسمح باستخدامه كنموذج للأمراض البشرية3. في الزرد ، من الشائع جدا اكتشاف أنماط التعبير عن جينين وعلاقتهما المكانية. تم استخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية لأول مرة في عام 1941 للكشف عن مسببات الأمراض في الأنسجة المصابة عن طريق تطبيق الأجسام المضادة التي تحمل علامة FITC4. يتم تمييز البروتين المستهدف في قسم الأنسجة أولا بجسم مضاد أولي ، ثم يتم تمييز القسم بجسم مضاد ثانوي ضد أنواع الغلوبولين المناعي المضيف للجسم المضاد الأساسي. تلطيخ الأجسام المضادة هو نهج قوي للكشف عن توطين البروتينات ، والذي يوفر دقة بصرية عالية على المستوى داخل الخلايا. ومع ذلك ، فإن عدد الأجسام المضادة المتاحة محدود للغاية في الزرد. أظهرت دراسة حديثة أن ما يقرب من 112000 جسم مضاد متاح تجاريا للفئران. ومع ذلك ، فقد ثبت أن عددا قليلا جدا من الأجسام المضادة يمكن الاعتماد عليها في الزرد5.
بدلا من ذلك ، في الزرد ، تم تطبيق التهجين في الموقع على نطاق واسع لتحليل نمط التعبير الجيني. تم استخدام هذه الطريقة لأول مرة لتقييم التعبير الجيني في أجنة ذبابة الفاكهة في ثمانينيات القرن العشرين 6,7 ، ومنذ ذلك الحين ، تم تطوير هذه التكنولوجيا وتحسينها باستمرار. في البداية ، تم استخدام مجسات الحمض النووي ذات العلامات الإشعاعية للكشف عن نسخ mRNA. ومع ذلك ، كانت الدقة المكانية منخفضة نسبيا ، وكانت هناك مخاطر صحية محتملة ناجمة عن النشاط الإشعاعي. بعد ذلك ، يعتمد التهجين في الموقع على مجسات الحمض النووي الريبي الموسومة بالديجوكسيجينين (DIG) أو الفلوريسئين (Fluo) ، والتي يتم اقترانها بالفوسفاتيز القلوي (AP) أو يتم اكتشافها بواسطة تضخيم إشارة التيراميد الفلوري (TSA) 8,9. على الرغم من استخدام TSA للكشف عن جينين أو ثلاثة جينات ، إلا أن وضع العلامات على DIG لتحقيقات الحمض النووي الريبي والأجسام المضادة المترافقة antiDIG AP لا تزال مناهج حساسة للغاية ومستقرة ومستخدمة على نطاق واسع للتهجين في الموقع. لذلك ، فإن الأجسام المضادة التجارية جنبا إلى جنب مع المجسات في الموقع التي تحمل علامة DIG مفيدة لتوفير نظرة ثاقبة حول توطين البروتين والتعبير عن جين واحد.
لا يمكن للأجنة الكاملة أن تكشف عن العلاقة المكانية بين الجينات بسبب الدقة البصرية المنخفضة ، على الرغم من أن أجنة الزرد صغيرة وشفافة10. وبالتالي ، فإن التقسيم ضروري لتحليل أنماط التعبير عن الجينات على المستوى داخل الخلايا. تم استخدام التشريح بالتبريد على نطاق واسع في الزرد لأنه سهل الأداء ويمكن أن يحافظ على المستضد بشكل فعال. لذلك ، يوفر التهجين في الموقع جنبا إلى جنب مع الكيمياء الهيستولوجية المناعية في عمليات التبريد لأسماك الزرد طريقة قوية لتحليل أنماط التعبير لجينين. تم تطبيق مزيج من التهجين في الموقع والكيمياء المناعية على الزرد11. ومع ذلك ، تم استخدام علاج البروتيناز K لتعزيز تغلغل المسبار على حساب سلامة المستضد. للتغلب على هذا القيد ، يستخدم هذا البروتوكول التسخين للحث على استرجاع المستضد. لا ينطبق هذا البروتوكول فقط على الأجنة ذات المراحل المختلفة وأقسام الأنسجة ذات السماكات المختلفة (أقسام الرأس 14 ميكرومتر وأقسام الحبل الشوكي 20 ميكرومتر) ، ولكن تم التحقق منه أيضا باستخدام الجينات المعبر عنها في عضوين ، بما في ذلك الرأس والحبل الشوكي.
سوف تصف هذه المقالة كيفية الجمع بين التهجين في الموقع وتلطيخ الأجسام المضادة في أجنة الزرد في عمليات التبريد. يتم إثبات تنوع هذا البروتوكول باستخدام عدد من تركيبات التهجين والكيمياء الهيستولوجية المناعية في الموقع ، بما في ذلك مجسات التهجين في الموقع لخليتين عصبيتين مختلفتين. هذه الطريقة مناسبة للكشف عن mRNA والبروتين في مناطق مختلفة والأجنة من مختلف الأعمار ، وكذلك أنماط التعبير عن جينين.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin AP Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM purple</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate buffer</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>IH0305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm</td>
			<td>Head Biotechnology</td>
			<td>H4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated Water</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B501005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera, fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NI-SSR 931479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 embryo medium</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>542858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYB</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>preHYB plus 50 &#181;g/mL heparin sodium salt, 100 &#181;g/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical wet box</td>
			<td>Mkbio</td>
			<td>MH10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile leica blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>116481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>M859248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTMT</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ADI-950-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4%</td>
			<td>Abbexa</td>
			<td>abx082483</td>
			<td>made in lab in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1x PBS plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylthiourea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103-85-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (10x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>preHYB</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1092766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R3629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5 mL tubes</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.2x SSC plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1x SSC plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish</td>
			<td>Laboratory Animal Center of Nantong University</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization combined with immunohistochemistry in cryosectioned zebrafish embryos

كفقاريات ، تم استخدام الزرد على نطاق واسع في الدراسات البيولوجية. يشترك الزرد والبشر في التماثل الوراثي العالي ، والذي يسمح باستخدامه كنموذج للأمراض البشرية. تعتمد دراسة وظائف الجينات على الكشف عن أنماط التعبير الجيني. على الرغم من أن الكيمياء الهيستولوجية المناعية توفر طريقة قوية لفحص تعبير البروتين ، إلا أن العدد المحدود من الأجسام المضادة المتاحة تجاريا في الزرد يقيد تطبيق التلطيخ. يستخدم التهجين في الموقع على نطاق واسع في أجنة الزرد للكشف عن تعبير mRNA. يصف هذا البروتوكول كيفية الحصول على الصور من خلال الجمع بين التهجين في الموقع والكيمياء المناعية لأقسام أجنة الزرد. تم إجراء التهجين في الموقع قبل التقسيم بالتبريد ، يليه تلطيخ الأجسام المضادة. تم إجراء الكيمياء الهيستولوجية المناعية وتصوير تشريح واحد بعد التهجين في الموقع . البروتوكول مفيد لكشف نمط التعبير لجينين ، أولا عن طريق الكشف عن النسخ في الموقع ثم عن طريق الكيمياء الهيستولوجية المناعية ضد بروتين في نفس القسم.

يمكن استخدام هذا البروتوكول لفحص نمط التعبير ل mRNA واحد وبروتين واحد في وقت واحد. يوضح الشكل 1 سير العمل التجريبي. مستقبل 5-HT2C هو نوع فرعي من مستقبلات 5-HT المرتبطة بالناقل العصبي السيروتونين (5-هيدروكسي تريبتامين ، 5-HT). يتم توزيعه على نطاق واسع في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ويمكن...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos at JoVE.com

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

يصف هذا البروتوكول كيفية الحصول على الصور من خلال الجمع بين التهجين في الموقع والكيمياء المناعية للأقسام الجنينية لأسماك الزرد. تم إجراء التهجين في الموقع قبل التقسيم بالتبريد ، يليه تلطيخ الأجسام المضادة. من المفيد الكشف عن أنماط التعبير عن جينين في الزرد إذا كان هناك ندرة في الأجسام المضادة.

في الموقع التهجين جنبا إلى جنب مع الكيمياء المناعية في أجنة الزرد المبردة

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

يستخدم هذا البروتوكول مزيجا من التهجين في الموقع والكيمياء الهيستولوجية المناعية ، وهو بمثابة طريقة سهلة وفعالة لتحليل mRNA واحد وبروتين واحد في وقت واحد. ينطبق هذا البروتوكول على الأجنة في مراحل مختلفة ، وأقسام الأنسجة ذات السماكة المختلفة ، والأعضاء المختلفة. للبدء ، قم بتثبيت ما يقرب من 10 أجنة تحتوي على 0.5 إلى 1 ملليلتر من بارافورمالدهايد الطازج 4٪ في أنبوب ميكروفوج سعة 1.5 ملليلتر عند أربع درجات مئوية طوال الليل لمدة 12 إلى 14 ساعة.قم بتجفيف الأجنة تدريجيا عن طريق غسلها ب 25 و 50 و 75٪ ميثانول في PBST على التوالي لمدة خمس دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الأجنة في ميثانول 100٪ لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. احتضان الأجنة في ميثانول 100٪ عند 20 درجة مئوية تحت الصفر طوال الليل على الأقل ، لمدة 12 إلى 14 ساعة.أعد ترطيب الأجنة تدريجيا عن طريق غسلها ب 75 و 50 و 25٪ ميثانول في PBST على التوالي لمدة خمس دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة. مرة أخرى ، اغسل الجنين ثلاث مرات باستخدام PBST لمدة خمس دقائق لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. هضم الأجنة مع 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من البروتيناز K في PBST في درجة حرارة الغرفة ، وغسل الأجنة ثلاث مرات مع PBST لمدة خمس دقائق.ثم ، قم بإعادة إصلاح الأجنة المغسولة في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. مرة أخرى ، اغسل الجنين ثلاث مرات باستخدام PBST أثناء الحضانة لمدة خمس دقائق أثناء كل غسلة. للتهجين المسبق للأجنة ، احتضانها في محلول ما قبل التهجين عند 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.بعد ذلك ، استبدل محلول ما قبل التهجين بمحلول التهجين وقم بالتهجين المسبق لمدة أربع ساعات على الأقل. سخني المسبار في محلول التهجين لمدة خمس دقائق عند 95 درجة مئوية قبل إضافته إلى الأجنة. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من محلول ما قبل التهجين دون السماح للأجنة بالتلامس مع الهواء.إلى الأنبوب الذي يحتوي على الأجنة ، أضف مسبارا مسخنا مسبقا في محلول التهجين واترك المسبار يهجن طوال الليل لمدة 12 إلى 14 ساعة عند 50 إلى 70 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بنضح محلول المسبار باستخدام ماصة وقم بتخزينه في أنبوب عند 20 درجة مئوية تحت الصفر بحيث يمكن إعادة استخدامه عدة مرات. اغسل الأجنة بمحلول تهجين 100٪ متبوعا بغسل متسلسل بمحلول تهجين 75 و 50 و 25٪ بتركيز ضعف SSCT لمدة 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية.ثم اغسل الأجنة مرتين و 0.2 مرة من تركيز SSCT لمدة 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية. اغسل الأجنة مرتين لمدة 10 دقائق في MABT في درجة حرارة الغرفة. سد الأجنة المهجنة والمغسولة لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة ، مع 2٪ محلول مانع -1.استبدل محلول الحجب -1 بمضاد الفوسفاتيز القلوي antidigoxigenin في محلول مانع جديد بنسبة 2٪ -1 ورجه طوال الليل لمدة 12 إلى 14 ساعة عند أربع درجات مئوية. ثم اغسل الأجنة أربع مرات في MABT لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. مرة أخرى ، اغسل الأجنة مرتين في NTMT وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من NTMT من الأجنة باستخدام ماصة.استبدل مع الركيزة الفوسفاتيز القلوية BM الأرجواني وصمة عار الأجنة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بمجرد تطور البقعة ، أوقف التفاعل عن طريق الشطف لفترة وجيزة مرتين باستخدام NTMT. بعد التهجين في الموقع ، شطف الأجنة مع PBST ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة.اغمر الأجنة في 5٪ سكروز في برنامج تلفزيوني طوال الليل لمدة 12 إلى 14 ساعة عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بتغيير المحلول الذي يغطي الأجنة إلى 15٪ سكروز في برنامج تلفزيوني واحتضانه طوال الليل لمدة 12 إلى 16 ساعة عند أربع درجات مئوية. مرة أخرى ، قم بتغيير المحلول الذي يغطي الأجنة إلى 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني واحتضانه لمدة يوم إلى يومين عند أربع درجات مئوية.انقل الأجنة إلى جهاز تبريد جديد للأنسجة واملأه برفق بوسط درجة حرارة القطع الأمثل مع تجنب تكوين الفقاعات. بعد ذلك ، قم بتقطيع العينات إلى أقسام بسمك 12 إلى 20 ميكرومتر باستخدام cryostat ونقل الأقسام بسرعة إلى شرائح زجاجية. اسمح للعينات بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة وقم بتخزين الأقسام في صندوق منزلق مغلق عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامها لاحقا.اغسل الشرائح التي تحتوي على الأقسام باستخدام PBS لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، ضع الشرائح في المخزن المؤقت وقم بتسخين المحلول لمدة 20 دقيقة تقريبا لإبقائه بالقرب من درجة حرارة الغليان. استنزاف المحلول الزائد وجفف المنطقة المحيطة بكل قسم بعناية بقطعة من الأنسجة.بعد ذلك ، ارسم دائرة حول القسم بقلم طارد للماء لتشكيل حاجز كاره للماء وسد القسم لمدة ساعتين في حجب المحلول -2 في درجة حرارة الغرفة. ماصة محلول الأجسام المضادة الأولية لكل شريحة واحتضان الشرائح في مربع رطب المناعي الكيميائي عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني أثناء الحضانة لمدة 10 دقائق أثناء كل غسلة ، واستنزاف PBS الزائد.ثم ، احتضان الشرائح مع الجسم المضاد الثانوي المناسب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني. مرة أخرى ، اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني أثناء الحضانة لمدة 10 دقائق أثناء كل غسلة ، واستنزاف PBS الزائد. بعد ذلك ، ماصة وسيط التثبيت على الشريحة وتركيبها بغطاء منزلق.تم الكشف عن التعبير عن مستقبلات 5-HT2C في الجهاز العصبي المركزي في خط foxP2 egfp-caax المعدل وراثيا. لوحظ التعبير المتزامن ل 5-HT2C في الخط المعدل وراثيا مع الخلايا العصبية foxP2 ، والتي تم تصنيفها بواسطة بروتين الفلوريسئين الأخضر الفلوري. تم الكشف عن التعبير عن insm1a ، وهو عامل نسخ إصبع الزنك في الحبل الشوكي الزرد والخلايا العصبية الحركية ، في الخط المعدل وراثيا.لوحظ التعبير المتزامن ل insm1a في الخط المعدل وراثيا مع الخلايا العصبية hb9 ، والتي تم تصنيفها بواسطة بروتين الفلورسنت الأخضر الفلوريسين. يجب تثبيت الزرد مع بارافورمالدهايد الطازج.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

نقرا الإسفار في الموقع التهجين في أقسام المخ طازجة

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

الجمع بين صبغ محبة للدهون ، في الموقع التهجين ، المناعية ، والأنسجة

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

الكشف عن الجينوم والنصوص من الفيروسات الحمض النووي في الخلايا العصبية الأنسجة الثابتة التي كتبها نيون في الوضع الطبيعي التهجين جنبا إلى جنب مع المناعية

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

إصابة الحبل الشوكي الكامل وبروتوكول تشريح الدماغ لاحقا Wholemount<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين في اليرقات البحر الجلكى

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

التمهيدي لالمناعية على نسيج Cryosectioned دماغ الفئران: مثال تلطيخ لالدبقية الصغيرة والخلايا العصبية

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

الكشف عن Axonally المترجمة من mRNAs في أقسام المخ باستخدام عالية الدقة<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

سريع<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين باستخدام قليل النوكليوتيد تحقيقات على مسبوقة لامتصاص العرق دماغ الفئران مع السيروتونين متلازمة

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

الاستفادة المشتركة منهجيات لتحديد دور البلازما غشاء تسليم خلال أكسون التشعب والعصبية التشكل

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

الجمع بين نقرا الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين مع Immunolabelling للكشف عن التعبير عن ثلاثة جينات في أقسام الدماغ ماوس

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

توطين الجينات مستقبلات أودورانت في هوائيات الجراد بواسطة الحمض النووي الريبي<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...