Name: in situ hybridization combined with immunohistochemistry in cryosectioned zebrafish embryos
Uploaded: 2022-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) og Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).

Alle dyreprotokoller blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Nantong University (nr. S20191210-402).
1. Indsamling af zebrafiskembryoner
<ol><li>Sæt et par zebrafisk op i avlstanke natten før æggene skal indsamles, den ene en transgen zebrafisk og den anden en AB vildtype zebrafisk (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB vildtype eller Tg (hb9:egfp) X AB vildtype) (se materialeoversigten). Brug en diagonal p...

<ol>
	<li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li><li>Chen, E., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+genomics+research+model.">Zebrafish as a genomics research model.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).</li><li>Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: <a target="_blank" href="https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it">https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it</a> (2018)</li><li>Akam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+location+of+ultrabithorax+transcripts+in+Drosophila+tissue+sections.">The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections.</a> EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).</li><li>Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+in+situ+hybridization+method+for+the+detection+of+cellular+RNAs+in+Drosophila+tissue+sections+and+its+application+for+localizing+transcripts+of+the+homeotic+Antennapedia+gene+complex.">An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex.</a> EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).</li><li>Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryos+and+young+larvae.">In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).</li><li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification.">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li><li>Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+genetic+tools+for+studying+vertebrate+development.">Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development.</a> Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).</li><li>Cunningham, R. L., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry+for+zebrafish+larvae.">Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+5-HT(2C)+receptors+regulate+anxiety-like+behavior.">Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior.</a> Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).</li><li>Ferguson, J. L., Shive, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+immunofluorescence+and+immunohistochemistry+on+cryosectioned+zebrafish+embryos.">Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).</li><li>Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunohistochemistry+in+zebrafish+embryos+and+larvae.">Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).</li><li>Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+whole-mount+immunohistochemistry+of+zebrafish+(Danio+rerio)+embryos+and+larvae+protocol.">General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).</li><li>O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Garbage+in,+garbage+out:+a+critical+evaluation+of+strategies+used+for+validation+of+immunohistochemical+biomarkers.">Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers.</a> Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).</li></ol>

Denne protokol foreslår en kombination af in situ hybridisering og immunhistokemi, et vigtigt skridt i colokaliseringsforsøgene på zebrafiskembryoner. Denne metode fungerer som en nem og effektiv måde at samtidig analysere et mRNA og et protein. In situ hybridisering og antistoffarvning blev udført på zebrafiskembryoner. I modsætning til flere protokoller, der tidligere er offentliggjort14,15,16, blev immunofluores...

Zebrafisken er en stærk hvirveldyrmodel til studier af udvikling og genetik 1,2. Zebrafisk og mennesker deler høj genetisk homologi (70% af generne deles med det menneskelige genom), hvilket gør det muligt at bruge det som model for menneskelige sygdomme3. Hos zebrafisk er det ret almindeligt at detektere ekspressionsmønstre for to gener og deres rumlige forhold. Immunohistokemi blev først brugt i 1941 til at detektere patogener i inficerede væv ved at anvende FITC-mærkede antistoffer4. Målproteinet i vævssektionen mærkes først med et primært antistof, og sektionen mærkes derefter med et sekundært antistof mod det primære antistofs værtsart immunoglobulin. Antistoffarvning er en robust tilgang til at detektere lokalisering af proteiner, som tilbyder høj optisk opløsning på intracellulært niveau. Antallet af tilgængelige antistoffer er dog meget begrænset hos zebrafisk. En nylig undersøgelse viser, at ca. 112.000 antistoffer er kommercielt tilgængelige for mus; Imidlertid har meget få antistoffer vist sig at være pålidelige i zebrafisk5.
I stedet er in situ-hybridisering i zebrafisk blevet anvendt bredt til analyse af genekspressionsmønstre. Denne metode blev først brugt til at vurdere genekspression i Drosophila-embryoner i 1980'erne6,7, og siden da er denne teknologi løbende blevet udviklet og forbedret. Oprindeligt blev radioaktivt mærkede DNA-sonder brugt til at detektere mRNA-transkripter; Den rumlige opløsning var imidlertid relativt lav, og der var potentielle sundhedsrisici forårsaget af radioaktiviteten. Derefter er in situ-hybridisering afhængig af RNA-sonderne mærket med digoxigenin (DIG) eller fluorescein (Fluo), som konjugeres til alkalisk fosfatase (AP) eller detekteres ved fluorescerende tyramidsignalforstærkning (TSA)8,9. Selvom TSA er blevet brugt til at detektere to eller tre gener, er DIG-mærkning af RNA-sonder og antiDIG AP-konjugeret antistof stadig meget følsomme, stabile og udbredte tilgange til in situ-hybridisering. Derfor er kommercialiserede antistoffer kombineret med DIG-mærkede in situ-sonder nyttige til at give indsigt i proteinlokalisering og ekspression af et gen.
Helmonterede embryoner kan ikke afsløre det rumlige forhold mellem gener på grund af den lave optiske opløsning, selvom zebrafiskembryoner er små og gennemsigtige10. Derfor er sektionering nødvendig for at analysere ekspressionsmønstre af gener på intracellulært niveau. Kryosektionering har været meget udbredt i zebrafisk, da det er let at udføre og effektivt kan bevare antigenet. Derfor tilbyder in situ-hybridisering kombineret med immunhistokemi i zebrafiskkryosektioner en kraftfuld måde at analysere ekspressionsmønstre for to gener. En kombination af in situ hybridisering og immunhistokemi er blevet anvendt på zebrafisk11. Imidlertid blev proteinase K-behandling brugt til at forbedre sondepenetration på bekostning af antigenintegritet. For at overvinde denne begrænsning bruger denne protokol opvarmning til at inducere antigenhentning. Denne protokol gælder ikke kun for embryoner i forskellige stadier og vævssektioner af forskellig tykkelse (14 μm hovedsektioner og 20 μm rygmarvssektioner), men den er også blevet verificeret ved hjælp af gener udtrykt i to organer, herunder hoved og rygmarv.
Denne artikel vil beskrive, hvordan man kombinerer in situ hybridisering og antistoffarvning i zebrafiskembryoner i kryosektioner. Alsidigheden af denne protokol demonstreres ved anvendelse af en række in situ hybridiserings-immunohistokemiske kombinationer, herunder in situ hybridiseringssonder til to forskellige neuroner. Denne metode er egnet til påvisning af mRNA og protein i forskellige regioner og embryoner i forskellige aldre samt ekspressionsmønstre for to gener.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin AP Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM purple</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate buffer</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>IH0305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm</td>
			<td>Head Biotechnology</td>
			<td>H4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated Water</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B501005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera, fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NI-SSR 931479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 embryo medium</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>542858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYB</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>preHYB plus 50 &#181;g/mL heparin sodium salt, 100 &#181;g/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical wet box</td>
			<td>Mkbio</td>
			<td>MH10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile leica blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>116481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>M859248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTMT</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ADI-950-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4%</td>
			<td>Abbexa</td>
			<td>abx082483</td>
			<td>made in lab in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1x PBS plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylthiourea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103-85-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (10x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>preHYB</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1092766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R3629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5 mL tubes</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.2x SSC plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1x SSC plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish</td>
			<td>Laboratory Animal Center of Nantong University</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization combined with immunohistochemistry in cryosectioned zebrafish embryos

Som hvirveldyr har zebrafisken været meget udbredt i biologiske undersøgelser. Zebrafisk og mennesker deler høj genetisk homologi, hvilket gør det muligt at bruge det som model for menneskelige sygdomme. Genfunktionsundersøgelse er baseret på påvisning af genekspressionsmønstre. Selvom immunhistokemi tilbyder en effektiv måde at analysere proteinekspression på, begrænser det begrænsede antal kommercielt tilgængelige antistoffer i zebrafisk anvendelsen af costaining. In situ hybridisering anvendes i vid udstrækning i zebrafiskembryoner til at detektere mRNA-ekspression. Denne protokol beskriver, hvordan man opnår billeder ved at kombinere in situ hybridisering og immunhistokemi for zebrafiskembryosektioner. In situ hybridisering blev udført før kryosektion, efterfulgt af antistoffarvning. Immunhistokemi og billeddannelse af en enkelt kryosektion blev udført efter in situ hybridisering. Protokollen er nyttig til at optrævle ekspressionsmønsteret for to gener, først ved in situ transkriptdetektion og derefter ved immunhistokemi mod et protein i samme afsnit.

Denne protokol kan bruges til samtidig at undersøge ekspressionsmønsteret for et mRNA og et protein. Figur 1 viser den eksperimentelle arbejdsgang. 5-HT2C-receptoren er en undertype af 5-HT-receptoren bundet af neurotransmitteren serotonin (5-hydroxytryptamin, 5-HT). Det er bredt fordelt i centralnervesystemet (CNS) og kan betydeligt regulere en række hjernefunktioner, herunder appetit, humør, angst og reproduktiv adfærd13. Ekspressionen af 5-HT2C i CNS blev påv...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos at JoVE.com

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

Denne protokol beskriver, hvordan man opnår billeder ved at kombinere in situ hybridisering og immunhistokemi af zebrafiskens embryonale sektioner. In situ hybridisering blev udført før kryosektion, efterfulgt af antistoffarvning. Det er nyttigt at detektere ekspressionsmønstre af to gener i zebrafisk, hvis der er mangel på antistoffer.

In situ Hybridisering kombineret med immunhistokemi i kryosektionerede zebrafiskembryoner

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

Denne protokol bruger en kombination af in situ-hybridisering og immunhistokemi, og den fungerer som en nem og effektiv måde at analysere et mRNA og et protein samtidigt. Denne protokol gælder for embryoner på forskellige stadier, vævssektioner af forskellig tykkelse og forskellige organer. Til at begynde med skal du fikse ca. 10 embryoner med 0,5 til 1 milliliter frisk 4% paraformaldehyd i et 1,5 milliliter mikrofugerør ved fire grader Celsius natten over i 12 til 14 timer.Embryonerne dehydreres gradvist ved at vaske med 25, 50 og 75% methanol i PBST successivt i fem minutter hver ved stuetemperatur. Derefter vaskes embryonerne i 100% methanol i fem minutter ved stuetemperatur. Inkuber embryonerne i 100% methanol ved minus 20 grader Celsius i mindst natten over i 12 til 14 timer.Embryonerne rehydreres gradvist ved at vaske med 75, 50 og 25% methanol i PBST successivt i fem minutter hver ved stuetemperatur. Vask igen embryoet tre gange med PBST i fem minutter hver ved stuetemperatur. Fordøje embryonerne med 10 mikrogram pr. milliliter proteinase K i PBST ved stuetemperatur, og vask embryonerne tre gange med PBST i fem minutter.Derefter fastgøres de vaskede embryoner igen i 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur. Igen vaskes embryoet tre gange med PBST, mens du inkuberer i fem minutter under hver vask. Til præhybridisering af embryonerne inkuberes de i præhybridiseringsopløsning ved 65 grader Celsius i fem minutter.Udskift derefter præhybridiseringsløsningen med hybridiseringsløsningen og præhybridiser i mindst fire timer. Opvarm sonden i hybridiseringsopløsningen i fem minutter ved 95 grader Celsius, før den tilsættes embryonerne. Fjern så meget præhybridiseringsopløsning som muligt uden at lade embryonerne komme i kontakt med luften.Til røret, der indeholder embryonerne, tilsættes forvarmet sonde i hybridiseringsopløsningen og lad sonden hybridisere natten over i 12 til 14 timer ved 50 til 70 grader Celsius. Den næste dag aspireres sondeopløsningen med en pipette og opbevares i et rør ved minus 20 grader Celsius, så den kan genbruges mange gange. Embryonerne vaskes med 100% hybridiseringsopløsning efterfulgt af sekventiel vask med 75, 50 og 25% hybridiseringsopløsning i to gange koncentrationen af SSCT i 15 minutter ved 65 grader Celsius.Derefter vaskes embryonerne to gange og 0,2 gange koncentrationen af SSCT i 15 minutter ved 65 grader Celsius. Embryonerne vaskes to gange i 10 minutter i MABT ved stuetemperatur. Bloker de hybridiserede og vaskede embryoner i mindst to timer ved stuetemperatur med 2% blokerende opløsning-1.Udskift den blokerende opløsning-1 med antidigoxigenin alkalisk fosfatase i en frisk 2% blokerende opløsning-1 og ryst natten over i 12 til 14 timer ved fire grader Celsius. Derefter vaskes embryonerne fire gange i MABT i 30 minutter ved stuetemperatur. Igen vaskes embryonerne to gange i NTMT, og så meget NTMT som muligt fjernes fra embryonerne med en pipette.Udskift med BM lilla alkalisk fosfatasesubstrat og pletter embryonerne ved stuetemperatur i mørket. Når pletten har udviklet sig, skal du stoppe reaktionen ved kort at skylle to gange med NTMT. Efter in situ-hybridisering skylles embryonerne med PBST tre gange i 20 minutter.Nedsænk embryonerne i 5% saccharose i PBS natten over i 12 til 14 timer ved fire grader Celsius. Derefter ændres opløsningen, der dækker embryonerne, til 15% saccharose i PBS og inkuberes natten over i 12 til 16 timer ved fire grader Celsius. Igen ændres opløsningen, der dækker embryonerne, til 30% saccharose i PBS og inkuberes i en til to dage ved fire grader Celsius.Overfør embryonerne til et nyt kryometal til væv og fyld det forsigtigt med optimalt skæretemperaturmedium, samtidig med at dannelse af bobler undgås. Skær derefter prøverne i 12 til 20 mikrometer tykke sektioner ved hjælp af en kryostat og overfør hurtigt sektionerne til glasskinner. Lad prøverne opnå stuetemperatur, og opbevar sektionerne i en forseglet diaskasse ved minus 80 grader Celsius til efterfølgende brug.Vask diasene med PBS i fem minutter. Anbring derefter objektglassene i bufferen og opvarm opløsningen i ca. 20 minutter for at holde den tæt på kogetemperaturen. Tøm overskydende opløsning og tør forsigtigt området omkring hver sektion med et stykke væv.Tegn derefter en cirkel rundt om sektionen med en vandafvisende pen for at danne en hydrofob barriere og bloker sektionen i to timer i blokering af opløsning-2 ved stuetemperatur. Pipette primær antistofopløsning pr. dias og inkuber diasene i en immunhistokemisk vådkasse ved fire grader Celsius natten over. Vask diasene tre gange med PBS, mens du inkuberer i 10 minutter under hver vask, og tøm overskydende PBS.Derefter inkuberes objektglassene med det relevante sekundære antistof i en time ved stuetemperatur i PBS. Vask igen diasene tre gange med PBS, mens du inkuberer i 10 minutter under hver vask, og dræn overskydende PBS. Derefter pipetteres monteringsmediet på diaset og monteres med et glidedæksel.Ekspressionen af 5-HT2C-receptoren i centralnervesystemet blev påvist i den transgene foxP2 egfp-caax-linje. Den samtidige ekspression af 5-HT2C blev observeret i den transgene linje sammen med foxP2-neuroner, som blev mærket af fluorescein grønt fluorescerende protein. Ekspressionen af insm1a, en zink-finger transkriptionsfaktor i zebrafiskens rygmarv og motorneuroner, blev påvist i den transgene linje.Den samtidige ekspression af insm1a blev observeret i den transgene linje sammen med hb9-neuroner, som blev mærket med fluorescein grønt fluorescerende protein. Zebrafisk skal fastgøres med friskfremstillet paraformaldehyd.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Påvisning af genom og Udskrifter af en Vedvarende DNA-virus i neuronvæv af Fluorescent In situ Hybridization Kombineret med Immunfarvning

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Komplet Rygmarvsskader og Brain Dissektion Protokol for Efterfølgende whole- mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i Larver havlampret

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Primer til Immunhistokemi på Cryosectioned Rat Brain Tissue: Eksempel farvning for Mikroglia og Neuroner

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Påvisning af Axonally Lokaliseret mRNA i Brain Sektioner Brug High-Resolution<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Hurtig<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering anvendelse af oligonukleotidprober på Paraformaldehyd-præfikset Brain af rotter med serotonin syndrom

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Udnytte Kombineret Metoder til Definer rolle plasmamembranen Delivery Under Axon Forgrening og neuronal Morfogenese

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Kombination Dobbelt Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering med immunomærkning for Påvisning af ekspression af tre gener i musehjerne Sektioner

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Lokalisering af odorantreceptorgener i locustantennet af RNA<em&gt; I situ</em&gt; Hybridisering

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...