Name: in situ hybridization combined with immunohistochemistry in cryosectioned zebrafish embryos
Uploaded: 2022-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), de Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) en de Natural Science Foundation van de Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).

Alle dierprotocollen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Nantong University (nr. S20191210-402).
1. Verzameling zebravisembryo's
<ol><li>Zet de avond voordat de eieren worden verzameld een paar zebravissen in kweekbakken, de ene een transgene zebravis en de andere een AB wild-type zebravis (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB wild-type of Tg (hb9:egfp) X AB wild-type) (zie de Tabel met Materialen).</e...

<ol>
	<li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li><li>Chen, E., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+genomics+research+model.">Zebrafish as a genomics research model.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).</li><li>Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: <a target="_blank" href="https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it">https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it</a> (2018)</li><li>Akam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+location+of+ultrabithorax+transcripts+in+Drosophila+tissue+sections.">The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections.</a> EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).</li><li>Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+in+situ+hybridization+method+for+the+detection+of+cellular+RNAs+in+Drosophila+tissue+sections+and+its+application+for+localizing+transcripts+of+the+homeotic+Antennapedia+gene+complex.">An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex.</a> EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).</li><li>Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryos+and+young+larvae.">In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).</li><li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification.">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li><li>Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+genetic+tools+for+studying+vertebrate+development.">Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development.</a> Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).</li><li>Cunningham, R. L., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry+for+zebrafish+larvae.">Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+5-HT(2C)+receptors+regulate+anxiety-like+behavior.">Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior.</a> Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).</li><li>Ferguson, J. L., Shive, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+immunofluorescence+and+immunohistochemistry+on+cryosectioned+zebrafish+embryos.">Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).</li><li>Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunohistochemistry+in+zebrafish+embryos+and+larvae.">Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).</li><li>Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+whole-mount+immunohistochemistry+of+zebrafish+(Danio+rerio)+embryos+and+larvae+protocol.">General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).</li><li>O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Garbage+in,+garbage+out:+a+critical+evaluation+of+strategies+used+for+validation+of+immunohistochemical+biomarkers.">Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers.</a> Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).</li></ol>

Dit protocol stelt een combinatie voor van in situ hybridisatie en immunohistochemie, een belangrijke stap in de colokalisatie-experimenten op zebravisembryo's. Deze methode dient als een eenvoudige en efficiënte manier om tegelijkertijd één mRNA en één eiwit te analyseren. In situ hybridisatie en antilichaamkleuring werden uitgevoerd op zebravisembryo's. In tegenstelling tot verschillende protocollen die eerder 14,15,16 werden gepubliceerd,<sup class=...

De zebravis is een krachtig gewerveld model voor studies van ontwikkeling en genetica 1,2. Zebravissen en mensen delen een hoge genetische homologie (70% van de genen wordt gedeeld met het menselijk genoom), waardoor het kan worden gebruikt als model voor menselijke ziekten3. Bij zebravissen is het vrij gebruikelijk om de expressiepatronen van twee genen en hun ruimtelijke relatie te detecteren. Immunohistochemie werd voor het eerst gebruikt in 1941 om pathogenen in geïnfecteerde weefsels te detecteren door FITC-gelabelde antilichamen toe te passen4. Het doeleiwit in de weefselsectie wordt eerst gelabeld met een primair antilichaam en de sectie wordt vervolgens gelabeld met een secundair antilichaam tegen de gastheersoort immunoglobuline van het primaire antilichaam. Antilichaamkleuring is een robuuste aanpak om de lokalisatie van eiwitten te detecteren, die een hoge optische resolutie op intracellulair niveau biedt. Het aantal beschikbare antilichamen is echter zeer beperkt bij zebravissen. Een recente studie toont aan dat ongeveer 112.000 antilichamen commercieel beschikbaar zijn voor muizen; Er zijn echter zeer weinig antilichamen aangetoond die betrouwbaar zijn bij zebravissen5.
In plaats daarvan is in zebravissen in situ hybridisatie op grote schaal toegepast voor genexpressiepatroonanalyse. Deze methode werd voor het eerst gebruikt om genexpressie in Drosophila-embryo's te beoordelen in de jaren 19806,7, en sindsdien is deze technologie voortdurend ontwikkeld en verbeterd. Aanvankelijk werden radioactief gelabelde DNA-sondes gebruikt om mRNA-transcripten te detecteren; De ruimtelijke resolutie was echter relatief laag en er waren potentiële gezondheidsrisico's veroorzaakt door de radioactiviteit. Vervolgens is in situ hybridisatie afhankelijk van de RNA-sondes gelabeld met digoxigenine (DIG) of fluoresceïne (Fluo), die worden geconjugeerd tot alkalische fosfatase (AP) of gedetecteerd door fluorescerende tyramidesignaalversterking (TSA)8,9. Hoewel TSA is gebruikt om twee of drie genen te detecteren, zijn DIG-labeling van RNA-sondes en antiDIG AP-geconjugeerd antilichaam nog steeds zeer gevoelige, stabiele en veelgebruikte benaderingen voor in situ hybridisatie. Daarom zijn gecommercialiseerde antilichamen in combinatie met DIG-gelabelde in situ probes nuttig om inzicht te geven in eiwitlokalisatie en expressie van één gen.
Embryo's met hele mounts kunnen de ruimtelijke relatie tussen genen niet onthullen vanwege de lage optische resolutie, ook al zijn zebravisembryo's klein en transparant10. Daarom is sectionering noodzakelijk om de expressiepatronen van genen op intracellulair niveau te analyseren. Cryosectieing is veel gebruikt bij zebravissen omdat het gemakkelijk uit te voeren is en het antigeen effectief kan behouden. Daarom biedt in situ hybridisatie in combinatie met immunohistochemie in cryosecties van zebravissen een krachtige manier om de expressiepatronen van twee genen te analyseren. Een combinatie van in situ hybridisatie en immunohistochemie is toegepast op zebravissen11. Proteïnase K-behandeling werd echter gebruikt om de penetratie van de sonde te verbeteren ten koste van de antigeenintegriteit. Om deze beperking te overwinnen, gebruikt dit protocol verwarming om antigeenopvraging te induceren. Dit protocol is niet alleen van toepassing op embryo's van verschillende stadia en weefselsecties van verschillende diktes (14 μm hoofdsecties en 20 μm ruggenmergsecties), maar het is ook geverifieerd met behulp van genen die tot expressie komen in twee organen, waaronder het hoofd en het ruggenmerg.
Dit artikel beschrijft hoe in situ hybridisatie en antilichaamkleuring in zebravisembryo's in cryosecties kunnen worden gecombineerd. De veelzijdigheid van dit protocol wordt aangetoond door gebruik te maken van een aantal in situ hybridisatie-immunohistochemie combinaties, waaronder in situ hybridisatie probes voor twee verschillende neuronen. Deze methode is geschikt voor het detecteren van mRNA en eiwit in verschillende regio's en embryo's van verschillende leeftijden, evenals de expressiepatronen van twee genen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin AP Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM purple</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate buffer</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>IH0305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm</td>
			<td>Head Biotechnology</td>
			<td>H4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated Water</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B501005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera, fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NI-SSR 931479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 embryo medium</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>542858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYB</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>preHYB plus 50 &#181;g/mL heparin sodium salt, 100 &#181;g/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical wet box</td>
			<td>Mkbio</td>
			<td>MH10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile leica blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>116481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>M859248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTMT</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ADI-950-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4%</td>
			<td>Abbexa</td>
			<td>abx082483</td>
			<td>made in lab in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1x PBS plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylthiourea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103-85-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (10x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>preHYB</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1092766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R3629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5 mL tubes</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.2x SSC plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1x SSC plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish</td>
			<td>Laboratory Animal Center of Nantong University</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization combined with immunohistochemistry in cryosectioned zebrafish embryos

Als gewerveld dier is de zebravis veel gebruikt in biologische studies. Zebravissen en mensen delen een hoge genetische homologie, waardoor het kan worden gebruikt als een model voor menselijke ziekten. Genfunctiestudie is gebaseerd op de detectie van genexpressiepatronen. Hoewel immunohistochemie een krachtige manier biedt om eiwitexpressie te testen, beperkt het beperkte aantal commercieel beschikbare antilichamen in zebravissen de toepassing van costaining. In situ hybridisatie wordt veel gebruikt in zebravisembryo's om mRNA-expressie te detecteren. Dit protocol beschrijft hoe beelden kunnen worden verkregen door in situ hybridisatie en immunohistochemie te combineren voor embryosecties van zebravissen. In situ hybridisatie werd uitgevoerd voorafgaand aan cryosectie, gevolgd door antilichaamkleuring. Immunohistochemie en de beeldvorming van een enkele cryosectie werden uitgevoerd na in situ hybridisatie. Het protocol is nuttig om het expressiepatroon van twee genen te ontrafelen, eerst door in situ transcriptdetectie en vervolgens door immunohistochemie tegen een eiwit in dezelfde sectie.

Dit protocol kan worden gebruikt om tegelijkertijd het expressiepatroon van één mRNA en één eiwit te onderzoeken. Figuur 1 toont de experimentele workflow. De 5-HT2C-receptor is een subtype van de 5-HT-receptor gebonden door de neurotransmitter serotonine (5-hydroxytryptamine, 5-HT). Het is wijd verspreid in het centrale zenuwstelsel (CZS) en kan een verscheidenheid aan hersenfuncties aanzienlijk reguleren, waaronder eetlust, stemming, angst en reproductief gedrag13</su...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos at JoVE.com

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

Dit protocol beschrijft hoe beelden kunnen worden verkregen door in situ hybridisatie en immunohistochemie van embryonale secties van zebravissen te combineren. In situ hybridisatie werd uitgevoerd voorafgaand aan cryosectie, gevolgd door antilichaamkleuring. Het is nuttig om de expressiepatronen van twee genen in zebravissen te detecteren als er een tekort aan antilichamen is.

Ter plaatse Hybridisatie gecombineerd met immunohistochemie in cryosectie zebravisembryo's

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

Dit protocol maakt gebruik van een combinatie van in situ hybridisatie en de immunohistochemie, en het dient als een eenvoudige en efficiënte manier om tegelijkertijd één mRNA en één eiwit te analyseren. Dit protocol is van toepassing op embryo's in verschillende stadia, weefselsecties van verschillende dikte en verschillende organen. Om te beginnen, fixeer ongeveer 10 embryo's met 0,5 tot 1 milliliter vers 4% paraformaldehyde in een microfugebuis van 1,5 milliliter bij vier graden Celsius gedurende 12 tot 14 uur.Droog de embryo's geleidelijk uit door achtereenvolgens vijf minuten op kamertemperatuur te wassen met 25, 50 en 75% methanol in PBST. Was de embryo's vervolgens gedurende vijf minuten in 100% methanol op kamertemperatuur. Incubeer de embryo's in 100% methanol bij min 20 graden Celsius gedurende ten minste een nacht, gedurende 12 tot 14 uur.Rehydrateer de embryo's geleidelijk door te wassen met 75, 50 en 25% methanol in PBST gedurende achtereenvolgens vijf minuten op kamertemperatuur. Nogmaals, was het embryo driemaal met PBST gedurende vijf minuten elk op kamertemperatuur. Verwerk de embryo's met 10 microgram per milliliter proteïnase K in PBST bij kamertemperatuur en was de embryo's driemaal met PBST gedurende vijf minuten.Bevestig vervolgens de gewassen embryo's gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in 4% paraformaldehyde. Nogmaals, was het embryo driemaal met PBST tijdens het incuberen gedurende vijf minuten tijdens elke wasbeurt. Voor het pre-hybridiseren van de embryo's, incubeer ze in pre-hybridisatie-oplossing bij 65 graden Celsius gedurende vijf minuten.Vervang vervolgens de pre-hybridisatieoplossing door de hybridisatieoplossing en pre-hybridiseer gedurende ten minste vier uur. Verwarm de sonde in de hybridisatieoplossing gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius voordat u deze aan de embryo's toevoegt. Verwijder zoveel mogelijk pre-hybridisatie-oplossing zonder de embryo's in contact te laten komen met de lucht.Voeg aan de buis met de embryo's de voorverwarmde sonde toe in de hybridisatieoplossing en laat de sonde gedurende 12 tot 14 uur bij 50 tot 70 graden Celsius een nacht hybridiseren. Zuig de sondeoplossing de volgende dag op met een pipet en bewaar deze in een buis bij min 20 graden Celsius, zodat deze vele malen kan worden hergebruikt. Was de embryo's met 100% hybridisatie-oplossing gevolgd door sequentieel wassen met 75, 50 en 25% hybridisatie-oplossing in tweemaal de concentratie van SSCT gedurende 15 minuten bij 65 graden Celsius.Was vervolgens de embryo's in twee keer en 0,2 keer de concentratie SSCT gedurende 15 minuten bij 65 graden Celsius. Was de embryo's tweemaal gedurende 10 minuten in MABT op kamertemperatuur. Blokkeer de gehybridiseerde en gewassen embryo's gedurende ten minste twee uur bij kamertemperatuur, met 2% blokkerende oplossing-1.Vervang de blokkerende oplossing-1 door antidigoxigenine alkalische fosfatase in een verse 2% blokkerende oplossing-1 en schud een nacht gedurende 12 tot 14 uur bij vier graden Celsius. Was de embryo's vervolgens vier keer in MABT gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Nogmaals, was de embryo's twee keer in NTMT en verwijder zoveel mogelijk NTMT uit de embryo's met behulp van een pipet.Vervang door BM paars alkalisch fosfatasesubstraat en kleur de embryo's bij kamertemperatuur in het donker. Zodra de vlek zich heeft ontwikkeld, stopt u de reactie door twee keer kort te spoelen met NTMT. Na in situ hybridisatie, spoel de embryo's driemaal met PBST gedurende 20 minuten.Dompel de embryo's 's in 5% sucrose in PBS gedurende een nacht van 12 tot 14 uur bij vier graden Celsius. Verander vervolgens de oplossing die de embryo's bedekt tot 15% sucrose in PBS en incuber 's nachts gedurende 12 tot 16 uur bij vier graden Celsius. Nogmaals, verander de oplossing die de embryo's bedekt tot 30% sucrose in PBS en incubeer gedurende één tot twee dagen bij vier graden Celsius.Breng de embryo's over naar een nieuwe cryomold voor weefsel en vul deze voorzichtig met een optimaal snijtemperatuurmedium terwijl de vorming van bellen wordt vermeden. Snijd vervolgens de monsters in 12 tot 20 micrometer dikke secties met behulp van een cryostaat en breng de secties snel over naar glazen dia's. Laat de monsters op kamertemperatuur komen en bewaar de secties in een afgesloten schuifdoos bij min 80 graden Celsius voor later gebruik.Was de dia's met de secties met PBS gedurende vijf minuten. Plaats vervolgens de dia's in de buffer en verwarm de oplossing gedurende ongeveer 20 minuten om deze in de buurt van de kooktemperatuur te houden. Giet de overtollige oplossing af en droog het gebied rond elke sectie voorzichtig af met een stuk weefsel.Teken vervolgens een cirkel rond de sectie met een waterafstotende pen om een hydrofobe barrière te vormen en blokkeer de sectie gedurende twee uur in blokkerende oplossing-2 bij kamertemperatuur. Pipetteer primaire antilichaamoplossing per dia en incubeer de dia's in een immunohistochemische natte doos bij vier graden Celsius gedurende een nacht. Was de dia's drie keer met PBS tijdens het incuberen gedurende 10 minuten tijdens elke wasbeurt en laat de overtollige PBS uitlekken.Incubeer vervolgens de dia's met het juiste secundaire antilichaam gedurende één uur bij kamertemperatuur in PBS. Nogmaals, was de dia's driemaal met PBS tijdens het incuberen gedurende 10 minuten tijdens elke wasbeurt en giet de overtollige PBS af. Vervolgens pipetteer je het montagemedium op de glijbaan en monteer je met een schuifafdekplaat.De expressie van 5-HT2C-receptor in het centrale zenuwstelsel werd gedetecteerd in de transgene foxP2 egfp-caaxlijn. De gelijktijdige expressie van 5-HT2C werd waargenomen in de transgene lijn samen met foxP2-neuronen, die werden gelabeld door fluoresceïnegroen fluorescerend eiwit. De expressie van insm1a, een zinkvingertranscriptiefactor in het ruggenmerg en motorneuronen van de zebravis, werd gedetecteerd in de transgene lijn.De gelijktijdige expressie van insm1a werd waargenomen in de transgene lijn samen met hb9-neuronen, die werden gelabeld door fluoresceïnegroen fluorescerend eiwit. Zebravissen moeten worden gefixeerd met vers bereide paraformaldehyde.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Dubbele Fluorescentie In situ Hybridisatie in Fresh Brain secties

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

De combinatie van Lipophilic kleurstof, In situ Hybridisatie, immunohistochemie, en Histologie

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Detectie van het genoom en de transcripties van een persistente DNA Virus in neuronale weefsels door Fluorescent In situ Hybridisatie Gecombineerd met Immunokleuring

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Compleet ruggenmergletsel en Brain Dissection Protocol voor Latere Wholemount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in Larvale Overzeese Lamprei

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Primer voor Immunohistochemie op Cryosectioned Rat Brain Tissue: Voorbeeld kleuring voor Microglia en Neuronen

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detectie van Axonally Gelokaliseerde mRNA in Brain secties met behulp van High-Resolution<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Snel<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie met behulp van oligonucleotideprobes op Paraformaldehyde vooraf hersenen van ratten met Serotonine Syndroom

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Gebruik makend van gecombineerde methoden om de rol van de plasmamembraan Delivery Tijdens Axon vertakking en neuronale Morphogenesis Definieer

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

De combinatie van Double Fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie met immunolabel voor detectie van de expressie van drie genen in de hersenen van muizen Secties

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Lokalisatie van Receptorgenen van Reukstof in Locustantenne door RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...