Name: in situ hybridization combined with immunohistochemistry in cryosectioned zebrafish embryos
Uploaded: 2022-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע והטכנולוגיה של נאנטונג של סין (MS12019011), קרן המדע והטכנולוגיה של נאנטונג של סין (JC2021058), והקרן למדעי הטבע של מוסדות ההשכלה הגבוהה של ג'יאנגסו (21KJB180009).

כל הפרוטוקולים של בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ננטונג (מס 'S20191210-402).
1. אוסף עוברים של דגי זברה
<ol><li>הציבו זוג דגי זברה במכלי רבייה בלילה שלפני איסוף הביצים, האחד דג זברה מהונדס והשני דג זברה מסוג AB (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB wil...

<ol>
	<li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li><li>Chen, E., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+genomics+research+model.">Zebrafish as a genomics research model.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).</li><li>Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: <a target="_blank" href="https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it">https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it</a> (2018)</li><li>Akam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+location+of+ultrabithorax+transcripts+in+Drosophila+tissue+sections.">The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections.</a> EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).</li><li>Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+in+situ+hybridization+method+for+the+detection+of+cellular+RNAs+in+Drosophila+tissue+sections+and+its+application+for+localizing+transcripts+of+the+homeotic+Antennapedia+gene+complex.">An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex.</a> EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).</li><li>Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryos+and+young+larvae.">In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).</li><li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification.">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li><li>Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+genetic+tools+for+studying+vertebrate+development.">Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development.</a> Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).</li><li>Cunningham, R. L., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry+for+zebrafish+larvae.">Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+5-HT(2C)+receptors+regulate+anxiety-like+behavior.">Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior.</a> Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).</li><li>Ferguson, J. L., Shive, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+immunofluorescence+and+immunohistochemistry+on+cryosectioned+zebrafish+embryos.">Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).</li><li>Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunohistochemistry+in+zebrafish+embryos+and+larvae.">Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).</li><li>Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+whole-mount+immunohistochemistry+of+zebrafish+(Danio+rerio)+embryos+and+larvae+protocol.">General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).</li><li>O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Garbage+in,+garbage+out:+a+critical+evaluation+of+strategies+used+for+validation+of+immunohistochemical+biomarkers.">Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers.</a> Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).</li></ol>

פרוטוקול זה מציע שילוב של הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה, צעד חשוב בניסויי הקולוקליזציה בעוברים של דגי זברה. שיטה זו משמשת דרך קלה ויעילה לנתח בו זמנית mRNA אחד וחלבון אחד. הכלאה באתרו וצביעת נוגדנים בוצעו על עוברים של דגי זברה. בניגוד למספר פרוטוקולים שפורסמו בעבר14,15,16</sup...

דג הזברה הוא מודל רב עוצמה של בעלי חוליות לחקר התפתחות וגנטיקה 1,2. דגי זברה ובני אדם חולקים הומולוגיה גנטית גבוהה (70% מהגנים משותפים עם הגנום האנושי), המאפשרת את השימוש בה כמודל למחלות אנושיות3. בדגי זברה שכיח למדי לזהות את דפוסי הביטוי של שני גנים ואת הקשר המרחבי ביניהם. אימונוהיסטוכימיה שימשה לראשונה בשנת 1941 לזיהוי פתוגנים ברקמות נגועות על ידי יישום נוגדנים המסומנים בתווית FITC4. חלבון המטרה באזור הרקמה מסומן תחילה בנוגדן ראשוני, ולאחר מכן החלק מסומן בנוגדן משני כנגד המין המארח של הנוגדן הראשוני, אימונוגלובולין. צביעת נוגדנים היא גישה חזקה לזיהוי לוקליזציה של חלבונים, המציעה רזולוציה אופטית גבוהה ברמה התוך תאית. עם זאת, מספר הנוגדנים הזמינים מוגבל מאוד בדגי זברה. מחקר שנערך לאחרונה מראה כי כ -112,000 נוגדנים זמינים באופן מסחרי עבור עכברים; עם זאת, מעט מאוד נוגדנים הוכחו כאמינים בדגי זברה5.
במקום זאת, בדגי זברה, הכלאה באתרה יושמה באופן נרחב לניתוח דפוסי ביטוי גנים. שיטה זו שימשה לראשונה להערכת ביטוי גנים בעוברי דרוזופילה בשנות ה-80 6,7, ומאז טכנולוגיה זו פותחה ושוכללה ללא הרף. בתחילה, בדיקות DNA מסומנות רדיו שימשו כדי לזהות תעתיקי mRNA; עם זאת, הרזולוציה המרחבית הייתה נמוכה יחסית, והיו סיכונים בריאותיים פוטנציאליים שנגרמו על ידי הרדיואקטיביות. לאחר מכן, הכלאה באתרה מסתמכת על בדיקות RNA המסומנות עם digoxigenin (DIG) או fluorescein (Fluo), אשר מצומדות לפוספטאז אלקליין (AP) או מזוהות על ידי הגברת אות טירמיד פלואורסצנטי (TSA)8,9. למרות שנעשה שימוש ב-TSA כדי לזהות שניים או שלושה גנים, תיוג DIG של בדיקות RNA ונוגדנים מצומדים של antiDIG AP הם עדיין גישות רגישות מאוד, יציבות ובשימוש נרחב להכלאה באתר. לכן, נוגדנים ממוסחרים בשילוב עם בדיקות באתרן המסומנות ב-DIG שימושיים למתן תובנה לגבי לוקליזציה של חלבונים וביטוי של גן אחד.
עוברים שלמים אינם יכולים לחשוף את הקשר המרחבי בין גנים בשל הרזולוציה האופטית הנמוכה, למרות שעוברים של דגי זברה קטנים ושקופים10. לפיכך, חתך יש צורך לנתח את דפוסי הביטוי של גנים ברמה התאית. Cryosectioning כבר בשימוש נרחב בדגי זברה כפי שהוא קל לבצע יכול ביעילות לשמר את האנטיגן. לכן, הכלאה באתרו בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בקריוסקציות של דגי זברה מציעה דרך רבת עוצמה לניתוח דפוסי הביטוי של שני גנים. שילוב של הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה יושם על דגי זברה11. עם זאת, טיפול בפרוטאינאז K שימש לשיפור חדירת הבדיקה על חשבון שלמות האנטיגן. כדי להתגבר על מגבלה זו, פרוטוקול זה משתמש בחימום כדי לגרום לשליפת אנטיגן. פרוטוקול זה חל לא רק על עוברים בשלבים שונים וחלקי רקמות בעוביים שונים (קטעי ראש של 14 מיקרומטר וחלקי חוט שדרה של 20 מיקרומטר), אלא הוא אומת גם באמצעות גנים המבוטאים בשני איברים, כולל הראש וחוט השדרה.
מאמר זה יתאר כיצד לשלב הכלאה באתרו וצביעת נוגדנים בעוברים של דגי זברה בהקפאה. הרבגוניות של פרוטוקול זה מודגמת על ידי שימוש במספר שילובים של הכלאה באתרו-אימונוהיסטוכימיה, כולל בדיקות הכלאה באתרן עבור שני נוירונים שונים. שיטה זו מתאימה לאיתור mRNA וחלבון באזורים שונים ובעוברים בגילאים שונים, וכן לדפוסי ביטוי של שני גנים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin AP Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM purple</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate buffer</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>IH0305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm</td>
			<td>Head Biotechnology</td>
			<td>H4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated Water</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B501005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera, fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NI-SSR 931479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 embryo medium</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>542858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYB</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>preHYB plus 50 &#181;g/mL heparin sodium salt, 100 &#181;g/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical wet box</td>
			<td>Mkbio</td>
			<td>MH10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile leica blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>116481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>M859248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTMT</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ADI-950-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4%</td>
			<td>Abbexa</td>
			<td>abx082483</td>
			<td>made in lab in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1x PBS plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylthiourea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103-85-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (10x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>preHYB</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1092766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R3629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5 mL tubes</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.2x SSC plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1x SSC plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish</td>
			<td>Laboratory Animal Center of Nantong University</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization combined with immunohistochemistry in cryosectioned zebrafish embryos

כבעל חוליות, דג הזברה נמצא בשימוש נרחב במחקרים ביולוגיים. דגי זברה ובני אדם חולקים הומולוגיה גנטית גבוהה, המאפשרת את השימוש בה כמודל למחלות אנושיות. מחקר תפקוד גנים מבוסס על זיהוי דפוסי ביטוי גנים. למרות שאימונוהיסטוכימיה מציעה דרך רבת עוצמה להעריך ביטוי חלבונים, המספר המוגבל של נוגדנים זמינים מסחרית בדגי זברה מגביל את היישום של costaining. הכלאה באתרו נמצאת בשימוש נרחב בעוברים של דגי זברה כדי לזהות ביטוי mRNA. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג תמונות על ידי שילוב הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה עבור קטעי עוברים של דגי זברה. הכלאה באתרו בוצעה לפני הקפאה, ואחריה הכתמת נוגדנים. אימונוהיסטוכימיה והדמיה של קריוסקציה יחידה בוצעו לאחר הכלאה באתר . הפרוטוקול עוזר לפענח את דפוס הביטוי של שני גנים, תחילה על ידי זיהוי תעתיק באתרו ולאחר מכן על ידי אימונוהיסטוכימיה כנגד חלבון באותו קטע.

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבחון בו זמנית את דפוס הביטוי של mRNA אחד וחלבון אחד. איור 1 מראה את זרימת העבודה הניסיונית. קולטן 5-HT2C הוא תת-סוג של קולטן 5-HT הקשור על ידי המוליך העצבי סרוטונין (5-hydroxytryptamine, 5-HT). הוא מופץ באופן נרחב במערכת העצבים המרכזית (CNS) ויכול לווסת באופן משמעותי מגו...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos at JoVE.com

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג תמונות על ידי שילוב הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה של חלקים עובריים של דגי זברה. הכלאה באתרו בוצעה לפני הקפאה, ואחריה הכתמת נוגדנים. כדאי לזהות את דפוסי הביטוי של שני גנים בדגי זברה אם יש מיעוט נוגדנים.

ב Situ הכלאה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בעוברי דגי זברה Cryosectioned

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

פרוטוקול זה משתמש בשילוב של הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה, והוא משמש דרך קלה ויעילה לנתח בו זמנית mRNA אחד וחלבון אחד. פרוטוקול זה חל על עוברים בשלבים שונים, חלקי רקמות בעובי שונה ואיברים שונים. כדי להתחיל, לתקן כ -10 עוברים עם 0.5 עד 1 מיליליטר של 4% paraformaldehyde טרי בצינור מיקרופוגה 1.5 מיליליטר בארבע מעלות צלזיוס במשך הלילה במשך 12 עד 14 שעות.יש לייבש בהדרגה את העוברים על ידי שטיפה עם מתנול 25, 50 ו-75% ב-PBST ברציפות במשך חמש דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את העוברים ב 100% מתנול במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לדגור על העוברים במתנול 100% במינוס 20 מעלות צלזיוס לפחות למשך הלילה, למשך 12 עד 14 שעות.יש להחזיר בהדרגה לחות לעוברים על ידי שטיפה עם מתנול 75, 50 ו-25% ב-PBST ברציפות במשך חמש דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. שוב, שטפו את העובר שלוש פעמים עם PBST במשך חמש דקות כל אחת בטמפרטורת החדר. לעכל את העוברים עם 10 מיקרוגרם למיליליטר של פרוטאינאז K ב PBST בטמפרטורת החדר, ולשטוף את העוברים שלוש פעמים עם PBST במשך חמש דקות.לאחר מכן, תקן מחדש את העוברים שטופים ב 4% paraformaldehyde במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שוב, שטפו את העובר שלוש פעמים עם PBST תוך דגירה במשך חמש דקות במהלך כל שטיפה. עבור טרום הכלאה של העוברים, לדגור אותם בתמיסת טרום הכלאה ב 65 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.לאחר מכן, החליפו את פתרון טרום ההכלאה בפתרון ההיברידיזציה ובצעו טרום הכלאה למשך ארבע שעות לפחות. חממו את הבדיקה בתמיסת ההכלאה במשך חמש דקות בחום של 95 מעלות צלזיוס לפני הוספתם לעוברים. הוציאו כמה שיותר תמיסת טרום הכלאה מבלי לתת לעוברים לבוא במגע עם האוויר.לצינור המכיל את העוברים, הוסיפו בדיקה שחוממה מראש בתמיסת ההכלאה ואפשרו לגשושית לבצע הכלאה למשך לילה למשך 12 עד 14 שעות בטמפרטורה של 50 עד 70 מעלות צלזיוס. למחרת, שאפו את תמיסת הבדיקה עם פיפטה ואחסנו אותה בצינור במינוס 20 מעלות צלזיוס, כך שניתן יהיה לעשות בה שימוש חוזר פעמים רבות. שטפו את העוברים בתמיסת הכלאה של 100% ואחריה שטיפה רציפה בתמיסת הכלאה של 75, 50 ו-25% בריכוז כפול של SSCT למשך 15 דקות ב-65 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, לשטוף את העוברים פי שניים ו 0.2 ריכוז של SSCT במשך 15 דקות ב 65 מעלות צלזיוס. שטפו את העוברים פעמיים במשך 10 דקות ב-MABT בטמפרטורת החדר. חסמו את העוברים ההיברידיים והשטופים למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר, עם תמיסה חוסמת של 2%-1.החלף את התמיסה החוסמת-1 באנטידיגוקסיגנין אלקליין פוספטאז בתמיסה חוסמת טרייה של 2%-1 ונער למשך הלילה במשך 12 עד 14 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את העוברים ארבע פעמים ב-MABT במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שוב, שטפו את העוברים פעמיים ב-NTMT והוציאו כמה שיותר NTMT מהעוברים באמצעות פיפטה.יש להחליף במצע אלקליין פוספטאז סגול BM ולהכתים את העוברים בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר שהכתם התפתח, יש להפסיק את התגובה על ידי שטיפה קצרה פעמיים עם NTMT. לאחר הכלאה באתר, שטפו את העוברים עם PBST שלוש פעמים במשך 20 דקות.טבלו את העוברים ב-5% סוכרוז ב-PBS למשך הלילה למשך 12 עד 14 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שנו את התמיסה המכסה את העוברים ל-15% סוכרוז ב-PBS ודגרו למשך הלילה למשך 12 עד 16 שעות בארבע מעלות צלזיוס. שוב, לשנות את התמיסה המכסה את העוברים ל 30% סוכרוז ב PBS ולדגור במשך יום עד יומיים בארבע מעלות צלזיוס.מעבירים את העוברים לקריאומולד חדש לרקמה וממלאים אותו בעדינות במדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלית תוך הימנעות מהיווצרות בועות. לאחר מכן, חתכו את הדגימות למקטעים בעובי 12 עד 20 מיקרומטר באמצעות קריוסטט והעבירו במהירות את החלקים לשקופיות זכוכית. אפשרו לדגימות להגיע לטמפרטורת החדר ואחסנו את המקטעים בקופסת שקופיות אטומה בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש לאחר מכן.שטפו את השקופיות המכילות את הקטעים עם PBS במשך חמש דקות. לאחר מכן, הניחו את המגלשות במאגר וחממו את התמיסה במשך כ-20 דקות כדי לשמור אותה קרובה לטמפרטורת הרתיחה. מסננים את התמיסה העודפת ומייבשים בזהירות את האזור סביב כל קטע עם חתיכת רקמה.לאחר מכן, ציירו עיגול סביב הקטע עם עט דוחה מים כדי ליצור מחסום הידרופובי וחסמו את הקטע למשך שעתיים בתמיסה חוסמת -2 בטמפרטורת החדר. פיפטה תמיסת נוגדנים ראשונית לכל מגלשה ולדגור על המגלשות בקופסה רטובה אימונוהיסטוכימית בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם PBS תוך כדי דגירה במשך 10 דקות במהלך כל שטיפה, ורוקנו את עודפי PBS.לאחר מכן, לדגור על המגלשות עם הנוגדן המשני המתאים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ב- PBS. שוב, שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם PBS תוך כדי דגירה במשך 10 דקות במהלך כל שטיפה, ונקזו את עודפי PBS. לאחר מכן, פיפטה את מדיום ההרכבה על המגלשה והרכבה עם כיסוי שקופיות.הביטוי של קולטן 5-HT2C במערכת העצבים המרכזית זוהה בקו foxP2 egfp-caax מהונדס. הביטוי בו זמנית של 5-HT2C נצפה בקו המהונדס יחד עם נוירונים foxP2, אשר סומנו על ידי חלבון פלואורסצאין ירוק פלואורסצנטי. הביטוי של insm1a, גורם שעתוק אצבע אבץ בחוט השדרה ובנוירונים המוטוריים של דג הזברה, זוהה בקו המהונדס.הביטוי הסימולטני של insm1a נצפה בקו המהונדס יחד עם נוירונים hb9, אשר סומנו על ידי חלבון פלואורסצאין ירוק פלואורסצנטי. דג זברה חייב להיות קבוע עם paraformaldehyde מוכן טרי.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

פעמיים פלואורסצנטי באתרו הכלאה בסעיפים המוח טריים

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

שילוב של צבע lipophilic, באתרו</emהכלאה>, אימונוהיסטוכימיה ו היסטולוגיה

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

איתור של הגנום והתמלילים של וירוס ה-DNA מתמיד ברקמות עצבית על ידי פלורסנט באתרו הכלאת שילוב עם Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

חוט השדרה מלא פגיעה ומוח Dissection פרוטוקול Wholemount לאחר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בזחל ים צמד ים

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

פריימר לאימונוהיסטוכימיה על רקמות Cryosectioned מוח חולדה: דוגמא להכתמת Microglia ונוירונים

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

מהיר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה באמצעות oligonucleotide בדיקות במוח-התחילית Paraformaldehyde של חולדות עם סרוטונין תסמונת

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

ניצול מתודולוגיות משולב להגדיר את התפקיד של משלוח ממברנה פלזמה במהלך אקסון מסעף ו העצבית המורפוגנזה

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

שילוב קרינה זוגית<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה עם Immunolabelling עבור איתור של הביטוי של שלושה גנים בסעיפי מוח עכבר

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

לוקליזציה של גנים קולטן Odorant ב אנטנות ארבה על ידי RNA<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...