Name: in situ hybridization combined with immunohistochemistry in cryosectioned zebrafish embryos
Uploaded: 2022-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), dalla Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) e dalla Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).

Tutti i protocolli sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Nantong (n. S20191210-402).
1. Raccolta di embrioni di zebrafish
<ol><li>Sistemare una coppia di zebrafish in vasche di riproduzione la sera prima della raccolta delle uova, uno un pesce zebra transgenico e l'altro un pesce zebra selvatico AB (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB wild-type o Tg (hb9:egfp) X AB wild-type) (vedi...

<ol>
	<li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li><li>Chen, E., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+genomics+research+model.">Zebrafish as a genomics research model.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).</li><li>Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: <a target="_blank" href="https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it">https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it</a> (2018)</li><li>Akam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+location+of+ultrabithorax+transcripts+in+Drosophila+tissue+sections.">The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections.</a> EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).</li><li>Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+in+situ+hybridization+method+for+the+detection+of+cellular+RNAs+in+Drosophila+tissue+sections+and+its+application+for+localizing+transcripts+of+the+homeotic+Antennapedia+gene+complex.">An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex.</a> EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).</li><li>Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryos+and+young+larvae.">In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).</li><li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification.">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li><li>Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+genetic+tools+for+studying+vertebrate+development.">Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development.</a> Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).</li><li>Cunningham, R. L., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry+for+zebrafish+larvae.">Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+5-HT(2C)+receptors+regulate+anxiety-like+behavior.">Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior.</a> Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).</li><li>Ferguson, J. L., Shive, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+immunofluorescence+and+immunohistochemistry+on+cryosectioned+zebrafish+embryos.">Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).</li><li>Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunohistochemistry+in+zebrafish+embryos+and+larvae.">Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).</li><li>Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+whole-mount+immunohistochemistry+of+zebrafish+(Danio+rerio)+embryos+and+larvae+protocol.">General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).</li><li>O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Garbage+in,+garbage+out:+a+critical+evaluation+of+strategies+used+for+validation+of+immunohistochemical+biomarkers.">Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers.</a> Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).</li></ol>

Questo protocollo propone una combinazione di ibridazione in situ e immunoistochimica, un passo importante negli esperimenti di colocalizzazione su embrioni di zebrafish. Questo metodo serve come un modo semplice ed efficiente per analizzare simultaneamente un mRNA e una proteina. L'ibridazione in situ e la colorazione anticorpale sono state eseguite su embrioni di zebrafish. In contrasto con diversi protocolli pubblicati in precedenza14,15,16,<...

Il pesce zebra è un potente modello di vertebrato per studi di sviluppo e genetica 1,2. Il pesce zebra e l'uomo condividono un'elevata omologia genetica (il 70% dei geni sono condivisi con il genoma umano), che ne consente l'uso come modello per le malattie umane3. Nel pesce zebra, è abbastanza comune rilevare i modelli di espressione di due geni e la loro relazione spaziale. L'immunoistochimica è stata utilizzata per la prima volta nel 1941 per rilevare agenti patogeni nei tessuti infetti applicando anticorpi marcati con FITC4. La proteina bersaglio nella sezione del tessuto viene prima marcata con un anticorpo primario e la sezione viene quindi etichettata con un anticorpo secondario contro l'immunoglobulina della specie ospite dell'anticorpo primario. La colorazione anticorpale è un approccio robusto per rilevare la localizzazione delle proteine, che offre un'elevata risoluzione ottica a livello intracellulare. Tuttavia, il numero di anticorpi disponibili è molto limitato nel pesce zebra. Uno studio recente mostra che circa 112.000 anticorpi sono disponibili in commercio per i topi; Tuttavia, pochissimi anticorpi si sono dimostrati affidabili nel pesce zebra5.
Invece, nel pesce zebra, l'ibridazione in situ è stata ampiamente applicata per l'analisi del pattern di espressione genica. Questo metodo è stato utilizzato per la prima volta per valutare l'espressione genica negli embrioni di Drosophila nel 19806,7, e da allora, questa tecnologia è stata continuamente sviluppata e migliorata. Inizialmente, sono state utilizzate sonde di DNA radiomarcate per rilevare trascritti di mRNA; Tuttavia, la risoluzione spaziale era relativamente bassa e c'erano potenziali rischi per la salute causati dalla radioattività. Successivamente, l'ibridazione in situ si basa sulle sonde di RNA marcate con digoxigenina (DIG) o fluoresceina (Fluo), che sono coniugate alla fosfatasi alcalina (AP) o rilevate mediante amplificazione del segnale fluorescente della tiramido (TSA)8,9. Sebbene la TSA sia stata utilizzata per rilevare due o tre geni, l'etichettatura DIG delle sonde di RNA e degli anticorpi antiDIG coniugati con AP sono ancora approcci altamente sensibili, stabili e ampiamente utilizzati per l'ibridazione in situ. Pertanto, gli anticorpi commercializzati combinati con sonde in situ marcate con DIG sono utili per fornire informazioni sulla localizzazione delle proteine e sull'espressione di un gene.
Gli embrioni interi non possono rivelare la relazione spaziale tra i geni a causa della bassa risoluzione ottica, anche se gli embrioni di zebrafish sono piccoli e trasparenti10. Quindi, il sezionamento è necessario per analizzare i modelli di espressione dei geni a livello intracellulare. La criosezione è stata ampiamente utilizzata nel pesce zebra in quanto è facile da eseguire e può preservare efficacemente l'antigene. Pertanto, l'ibridazione in situ combinata con l'immunoistochimica nelle criosezioni del pesce zebra offre un modo potente per analizzare i modelli di espressione di due geni. Una combinazione di ibridazione in situ e immunoistochimica è stata applicata al pesce zebra11. Tuttavia, il trattamento con proteinasi K è stato utilizzato per migliorare la penetrazione della sonda a scapito dell'integrità dell'antigene. Per superare questa limitazione, questo protocollo utilizza il riscaldamento per indurre il recupero dell'antigene. Questo protocollo non è applicabile solo a embrioni di diversi stadi e sezioni di tessuto di vari spessori (sezioni della testa da 14 μm e sezioni del midollo spinale da 20 μm), ma è stato anche verificato utilizzando geni espressi in due organi, tra cui la testa e il midollo spinale.
Questo articolo descriverà come combinare l'ibridazione in situ e la colorazione anticorpale negli embrioni di zebrafish nelle criosezioni. La versatilità di questo protocollo è dimostrata utilizzando una serie di combinazioni di ibridazione in situ-immunoistochimica, comprese le sonde di ibridazione in situ per due diversi neuroni. Questo metodo è adatto per rilevare mRNA e proteine in diverse regioni ed embrioni di età diverse, nonché i modelli di espressione di due geni.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin AP Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM purple</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate buffer</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>IH0305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm</td>
			<td>Head Biotechnology</td>
			<td>H4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated Water</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B501005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera, fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NI-SSR 931479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 embryo medium</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>542858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYB</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>preHYB plus 50 &#181;g/mL heparin sodium salt, 100 &#181;g/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical wet box</td>
			<td>Mkbio</td>
			<td>MH10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile leica blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>116481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>M859248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTMT</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ADI-950-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4%</td>
			<td>Abbexa</td>
			<td>abx082483</td>
			<td>made in lab in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1x PBS plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylthiourea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103-85-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (10x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>preHYB</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1092766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R3629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5 mL tubes</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.2x SSC plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1x SSC plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish</td>
			<td>Laboratory Animal Center of Nantong University</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization combined with immunohistochemistry in cryosectioned zebrafish embryos

Come vertebrato, il pesce zebra è stato ampiamente utilizzato negli studi biologici. Il pesce zebra e gli esseri umani condividono un'elevata omologia genetica, che ne consente l'uso come modello per le malattie umane. Lo studio della funzione genica si basa sulla rilevazione dei modelli di espressione genica. Sebbene l'immunoistochimica offra un modo potente per saggiare l'espressione proteica, il numero limitato di anticorpi disponibili in commercio nel pesce zebra limita l'applicazione del costaining. L'ibridazione in situ è ampiamente utilizzata negli embrioni di zebrafish per rilevare l'espressione di mRNA. Questo protocollo descrive come ottenere immagini combinando ibridazione in situ e immunoistochimica per sezioni di embrioni di zebrafish. L'ibridazione in situ è stata eseguita prima della criosezione, seguita dalla colorazione anticorpale. L'immunoistochimica e l'imaging di una singola criosezione sono stati eseguiti dopo l'ibridazione in situ . Il protocollo è utile per svelare il modello di espressione di due geni, prima mediante il rilevamento di trascritti in situ e poi mediante immunoistochimica contro una proteina nella stessa sezione.

Questo protocollo può essere utilizzato per esaminare simultaneamente il modello di espressione di un mRNA e di una proteina. Nella Figura 1 viene illustrato il flusso di lavoro sperimentale. Il recettore 5-HT2C è un sottotipo del recettore 5-HT legato dal neurotrasmettitore serotonina (5-idrossitriptamina, 5-HT). È ampiamente distribuito nel sistema nervoso centrale (SNC) e può regolare significativamente una varietà di funzioni cerebrali, tra cui appetito, umore, ansia e comportamento...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos at JoVE.com

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

Questo protocollo descrive come ottenere immagini combinando l'ibridazione in situ e l'immunoistochimica delle sezioni embrionali di zebrafish. L'ibridazione in situ è stata eseguita prima della criosezione, seguita dalla colorazione anticorpale. È utile rilevare i modelli di espressione di due geni nel pesce zebra se c'è una scarsità di anticorpi.

Sul posto Ibridazione combinata con immunoistochimica in embrioni di zebrafish criosezionati

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

Questo protocollo utilizza una combinazione di ibridazione in situ e immunoistochimica e serve come un modo semplice ed efficiente per analizzare simultaneamente un mRNA e una proteina. Questo protocollo è applicabile a embrioni in diverse fasi, sezioni di tessuto di vario spessore e diversi organi. Per iniziare, fissare circa 10 embrioni con 0,5-1 millilitro di paraformaldeide fresca al 4% in un tubo di microfuge da 1,5 millilitri a quattro gradi Celsius durante la notte per 12-14 ore.Disidratare gradualmente gli embrioni lavando con 25, 50 e 75% metanolo in PBST successivamente per cinque minuti ciascuno a temperatura ambiente. Quindi, lavare gli embrioni in metanolo al 100% per cinque minuti a temperatura ambiente. Incubare gli embrioni al 100% metanolo a meno 20 gradi Celsius per almeno una notte, per 12-14 ore.Reidratare gradualmente gli embrioni lavando con il 75, 50 e 25% di metanolo in PBST successivamente per cinque minuti ciascuno a temperatura ambiente. Ancora una volta, lavare l'embrione tre volte con PBST per cinque minuti ciascuno a temperatura ambiente. Digerire gli embrioni con 10 microgrammi per millilitro di proteinasi K in PBST a temperatura ambiente e lavare gli embrioni tre volte con PBST per cinque minuti.Quindi, rifissare gli embrioni lavati in paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente. Ancora una volta, lavare l'embrione tre volte con PBST durante l'incubazione per cinque minuti durante ogni lavaggio. Per pre-ibridare gli embrioni, incubarli in soluzione di pre-ibridazione a 65 gradi Celsius per cinque minuti.Quindi, sostituire la soluzione di pre-ibridazione con la soluzione di ibridazione e pre-ibridare per almeno quattro ore. Riscaldare la sonda nella soluzione di ibridazione per cinque minuti a 95 gradi Celsius prima di aggiungere agli embrioni. Rimuovere quanta più soluzione di pre-ibridazione possibile senza lasciare che gli embrioni entrino in contatto con l'aria.Al tubo contenente gli embrioni, aggiungere la sonda preriscaldata nella soluzione di ibridazione e consentire alla sonda di ibridarsi durante la notte per 12-14 ore a 50-70 gradi Celsius. Il giorno successivo, aspirare la soluzione della sonda con una pipetta e conservarla in un tubo a meno 20 gradi Celsius in modo che possa essere riutilizzata molte volte. Lavare gli embrioni con una soluzione di ibridazione al 100% seguita da un lavaggio sequenziale con una soluzione di ibridazione al 75, 50 e 25% in due volte la concentrazione di SSCT per 15 minuti a 65 gradi Celsius.Quindi, lavare gli embrioni due volte e 0,2 volte la concentrazione di SSCT per 15 minuti a 65 gradi Celsius. Lavare gli embrioni due volte per 10 minuti in MABT a temperatura ambiente. Bloccare gli embrioni ibridati e lavati per almeno due ore a temperatura ambiente, con soluzione bloccante al 2%-1.Sostituire la soluzione bloccante-1 con fosfatasi alcalina antidigoxigenina in una nuova soluzione bloccante al 2%-1 e agitare per una notte per 12-14 ore a quattro gradi Celsius. Quindi, lavare gli embrioni quattro volte in MABT per 30 minuti a temperatura ambiente. Ancora una volta, lavare gli embrioni due volte in NTMT e rimuovere quanto più NTMT possibile dagli embrioni usando una pipetta.Sostituire con substrato di fosfatasi alcalina viola BM e colorare gli embrioni a temperatura ambiente al buio. Una volta che la macchia si è sviluppata, interrompere la reazione risciacquando brevemente due volte con NTMT. Dopo l'ibridazione in situ, sciacquare gli embrioni con PBST tre volte per 20 minuti.Immergere gli embrioni nel 5% di saccarosio in PBS durante la notte per 12-14 ore a quattro gradi Celsius. Quindi, cambiare la soluzione che copre gli embrioni al 15% di saccarosio in PBS e incubare durante la notte per 12-16 ore a quattro gradi Celsius. Ancora una volta, cambiare la soluzione che copre gli embrioni al 30% di saccarosio in PBS e incubare per uno o due giorni a quattro gradi Celsius.Trasferire gli embrioni in un nuovo criomold per il tessuto e riempirlo delicatamente con un mezzo di temperatura di taglio ottimale evitando la formazione di bolle. Quindi, tagliare i campioni in sezioni spesse da 12 a 20 micrometri usando un criostato e trasferire rapidamente le sezioni su vetrini. Lasciare che i campioni raggiungano la temperatura ambiente e conservare le sezioni in una scatola di scorrimento sigillata a meno 80 gradi Celsius per un uso successivo.Lavare i vetrini contenenti le sezioni con PBS per cinque minuti. Quindi, posizionare i vetrini nel tampone e riscaldare la soluzione per circa 20 minuti per mantenerla vicino alla temperatura di ebollizione. Scolare la soluzione in eccesso e asciugare accuratamente l'area intorno a ciascuna sezione con un pezzo di tessuto.Quindi, disegnare un cerchio attorno alla sezione con una penna idrorepellente per formare una barriera idrofobica e bloccare la sezione per due ore bloccando la soluzione-2 a temperatura ambiente. Pipetta la soluzione di anticorpi primari per vetrino e incubare i vetrini in una scatola umida immunoistochimica a quattro gradi Celsius durante la notte. Lavare i vetrini tre volte con PBS durante l'incubazione per 10 minuti durante ogni lavaggio e scolare il PBS in eccesso.Quindi, incubare i vetrini con l'anticorpo secondario appropriato per un'ora a temperatura ambiente in PBS. Ancora una volta, lavare i vetrini tre volte con PBS durante l'incubazione per 10 minuti durante ogni lavaggio e drenare il PBS in eccesso. Successivamente, pipettare il mezzo di montaggio sulla slitta e montare con una sottoveste di copertura della diapositiva.L'espressione del recettore 5-HT2C nel sistema nervoso centrale è stata rilevata nella linea transgenica foxP2 egfp-caax. L'espressione simultanea di 5-HT2C è stata osservata nella linea transgenica insieme ai neuroni foxP2, che sono stati marcati dalla proteina fluorescente verde fluoresceina. L'espressione di insm1a, un fattore di trascrizione a dita di zinco nel midollo spinale e nei motoneuroni del pesce zebra, è stata rilevata nella linea transgenica.L'espressione simultanea di insm1a è stata osservata nella linea transgenica insieme ai neuroni hb9, che sono stati marcati dalla proteina fluorescente verde fluoresceina. Il pesce zebra deve essere fissato con paraformaldeide appena preparata.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Doppia fluorescenza In situ</emIbridazione> nelle sezioni cervello fresco

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Ricerca

Neuroscienze

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

La combinazione di coloranti lipofili, In situ Ibridazione, Immunoistochimica e Istologia

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

La rilevazione del genoma e Trascrizioni di un virus DNA persistente in tessuti neuronali da fluorescente In situ Ibridazione In combinazione con Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Completa lesioni del midollo spinale e del cervello dissezione Protocollo per Wholemount successiva<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in larvale Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Primer per immunoistochimica su Cryosectioned Rat tessuto cerebrale: Esempio colorazione per Microglia e neuroni

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Rilevazione di assoni localizzato mRNA nelle sezioni del cervello Utilizzando ad alta risoluzione<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapido<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione utilizzando oligonucleotidi sonde su Paraformaldeide prefissa cervello di ratti con Sindrome serotoninergica

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Utilizzando metodologie combinati per definire il ruolo della membrana plasmatica di consegna Durante Axon ramificazione e neuronale morfogenesi

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

La combinazione di doppio Fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione con Immunolabelling per il rilevamento della Manifestazione di tre geni nel cervello di topo Sezioni

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localizzazione dei geni del recettore degli odoranti nell&#39;antenna di Locust da RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...