Name: in situ hybridization combined with immunohistochemistry in cryosectioned zebrafish embryos
Uploaded: 2022-03-03T13:00:00
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この研究は、中国の南通科学技術財団(MS12019011)、中国の南通科学技術財団(JC2021058)、および江蘇高等教育機関の自然科学財団(21KJB180009)によってサポートされました。

すべての動物プロトコルは、南通大学の施設動物管理および使用委員会(No.S20191210-402)によって承認されました。
1. ゼブラフィッシュ胚の採取
<ol><li>卵を採取する前夜に、トランスジェニックゼブラフィッシュとAB野生型ゼブラフィッシュ(Tg (foxP2:egfp-caax)X AB野生型または Tg (hb9:egfp)X AB野生型)のゼブラフィッシュのペアを飼育タンク...

<ol>
	<li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li><li>Chen, E., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+genomics+research+model.">Zebrafish as a genomics research model.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).</li><li>Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: <a target="_blank" href="https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it">https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it</a> (2018)</li><li>Akam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+location+of+ultrabithorax+transcripts+in+Drosophila+tissue+sections.">The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections.</a> EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).</li><li>Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+in+situ+hybridization+method+for+the+detection+of+cellular+RNAs+in+Drosophila+tissue+sections+and+its+application+for+localizing+transcripts+of+the+homeotic+Antennapedia+gene+complex.">An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex.</a> EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).</li><li>Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryos+and+young+larvae.">In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).</li><li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification.">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li><li>Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+genetic+tools+for+studying+vertebrate+development.">Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development.</a> Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).</li><li>Cunningham, R. L., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry+for+zebrafish+larvae.">Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+5-HT(2C)+receptors+regulate+anxiety-like+behavior.">Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior.</a> Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).</li><li>Ferguson, J. L., Shive, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+immunofluorescence+and+immunohistochemistry+on+cryosectioned+zebrafish+embryos.">Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).</li><li>Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunohistochemistry+in+zebrafish+embryos+and+larvae.">Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).</li><li>Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+whole-mount+immunohistochemistry+of+zebrafish+(Danio+rerio)+embryos+and+larvae+protocol.">General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).</li><li>O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Garbage+in,+garbage+out:+a+critical+evaluation+of+strategies+used+for+validation+of+immunohistochemical+biomarkers.">Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers.</a> Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).</li></ol>

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の共局在実験における重要なステップであるin situハイブリダイゼーションと免疫組織化学の組み合わせを提案しています。この方法は、1つのmRNAと1つのタンパク質を同時に分析するための簡単で効率的な方法として機能します。in situハイブリダイゼーションおよび抗体染色をゼブラフィッシュ胚に対して行った。以前に公開されたいく?...

ゼブラフィッシュは、発生と遺伝学の研究のための強力な脊椎動物モデルです1,2。ゼブラフィッシュとヒトは高い遺伝的相同性を共有しており(遺伝子の70%がヒトゲノムと共有されています)、ヒトの病気のモデルとして使用できます3。ゼブラフィッシュでは、2つの遺伝子の発現パターンとそれらの空間的関係を検出することは非常に一般的です。免疫組織化学は、FITC標識抗体を適用して感染組織内の病原体を検出するために1941年に最初に使用されました4。組織切片の標的タンパク質は、最初に一次抗体で標識され、次に切片は一次抗体の宿主種免疫グロブリンに対する二次抗体で標識されます。抗体染色は、タンパク質の局在を検出するための堅牢なアプローチであり、細胞内レベルで高い光学分解能を提供します。しかし、ゼブラフィッシュでは利用可能な抗体の数は非常に限られています。最近の研究では、約112,000の抗体がマウス用に市販されていることを示しています。しかしながら、ゼブラフィッシュ5において信頼性が実証されている抗体はほとんどない。
代わりに、ゼブラフィッシュでは、in situハイブリダイゼーションが遺伝子発現パターン解析に広く適用されている。この方法は、1980年代にショウジョウバエ胚の遺伝子発現を評価するために最初に使用され6,7、それ以来、この技術は継続的に開発および改良されてきました。当初、放射性標識されたDNAプローブを使用してmRNA転写物を検出しました。しかし、空間分解能は比較的低く、放射能によって引き起こされる潜在的な健康リスクがありました。その後、in situハイブリダイゼーションは、アルカリホスファターゼ(AP)に結合するか、蛍光チラミドシグナル増幅(TSA)によって検出されるジゴキシゲニン(DIG)またはフルオレセイン(Fluo)で標識されたRNAプローブに依存しています8,9。TSAは2つまたは3つの遺伝子の検出に使用されてきましたが、RNAプローブと抗DIG AP結合抗体のDIG標識は依然として高感度で安定しており、in situハイブリダイゼーションに広く使用されているアプローチです。したがって、DIG標識in situプローブと組み合わせた市販された抗体は、タンパク質の局在と1つの遺伝子の発現に関する洞察を提供するのに有用です。
ゼブラフィッシュの胚は小さく透明であるにもかかわらず、全マウント胚は光学分解能が低いため、遺伝子間の空間的関係を明らかにすることはできません10。そのため、細胞内レベルで遺伝子の発現パターンを解析するためには切片作成が必要です。凍結切開は、実行が容易で抗原を効果的に保存できるため、ゼブラフィッシュで広く使用されています。したがって、ゼブラフィッシュ凍結切片における免疫組織化学と組み合わせた in situ ハイブリダイゼーションは、2つの遺伝子の発現パターンを分析するための強力な方法を提供します。 in situ ハイブリダイゼーションと免疫組織化学の組み合わせがゼブラフィッシュ11に適用されています。しかし、プロテイナーゼK処理は、抗原の完全性を犠牲にしてプローブの浸透を促進するために使用されました。この制限を克服するために、このプロトコルは加熱を使用して抗原賦活化を誘導します。このプロトコルは、さまざまなステージの胚やさまざまな厚さの組織切片(14μmの頭部切片と20μmの脊髄切片)に適用できるだけでなく、頭部と脊髄を含む2つの臓器で発現する遺伝子を使用して検証されています。
この記事では、凍結切片におけるゼブラフィッシュ胚における in situ ハイブリダイゼーションと抗体染色を組み合わせる方法について説明します。このプロトコルの汎用性は、2つの異なるニューロンに対するin situ ハイブリダイゼーションプローブを含む、多数の in situ ハイブリダイゼーション-免疫組織化学の組み合わせを使用することによって実証されます。この方法は、異なる領域および異なる年齢の胚におけるmRNAおよびタンパク質、ならびに2つの遺伝子の発現パターンを検出するのに適している。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin AP Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM purple</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate buffer</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>IH0305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm</td>
			<td>Head Biotechnology</td>
			<td>H4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated Water</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B501005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera, fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NI-SSR 931479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 embryo medium</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>542858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYB</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>preHYB plus 50 &#181;g/mL heparin sodium salt, 100 &#181;g/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical wet box</td>
			<td>Mkbio</td>
			<td>MH10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile leica blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>116481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>M859248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTMT</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ADI-950-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4%</td>
			<td>Abbexa</td>
			<td>abx082483</td>
			<td>made in lab in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1x PBS plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylthiourea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103-85-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (10x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>preHYB</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1092766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R3629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5 mL tubes</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.2x SSC plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1x SSC plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish</td>
			<td>Laboratory Animal Center of Nantong University</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization combined with immunohistochemistry in cryosectioned zebrafish embryos

脊椎動物として、ゼブラフィッシュは生物学的研究で広く使用されています。ゼブラフィッシュとヒトは高い遺伝的相同性を共有しているため、ヒトの病気のモデルとして使用できます。遺伝子機能研究は、遺伝子発現パターンの検出に基づいています。免疫組織化学はタンパク質発現をアッセイする強力な方法を提供しますが、ゼブラフィッシュの市販抗体の数が限られているため、共染色の適用が制限されます。 in situ ハイブリダイゼーションは、mRNA発現を検出するためにゼブラフィッシュ胚において広く使用されている。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚切片の in situ ハイブリダイゼーションと免疫組織化学を組み合わせて画像を取得する方法について説明します。凍結切片の前に in situ ハイブリダイゼーションを行い、続いて抗体染色を行った。免疫組織化学および単一凍結切片のイメージングは、 in situ ハイブリダイゼーション後に実施した。このプロトコルは、最初に in situ 転写産物検出によって、次に同じセクションのタンパク質に対する免疫組織化学によって、2つの遺伝子の発現パターンを解明するのに役立ちます。

このプロトコルは、1つのmRNAと1つのタンパク質の発現パターンを同時に調べるために使用できます。図1に実験ワークフローを示します。5-HT2C受容体は、神経伝達物質セロトニン(5-ヒドロキシトリプタミン、5-HT)によって結合された5-HT受容体のサブタイプです。中枢神経系(CNS)に広く分布しており、食欲、気分、不安、生殖行動など、さまざまな脳機能を大幅に調節する?...

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In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚切片の in situ ハイブリダイゼーションと免疫組織化学を組み合わせて画像を取得する方法について説明します。凍結切片の前に in situ ハイブリダイゼーションを行い、続いて抗体染色を行った。ゼブラフィッシュの2つの遺伝子の発現パターンを検出することは、抗体が不足している場合に有用です。

その場で 凍結切片ゼブラフィッシュ胚における免疫組織化学と組み合わせたハイブリダイゼーション

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

このプロトコルは、in situハイブリダイゼーションと免疫組織化学の組み合わせを使用し、1つのmRNAと1つのタンパク質を同時に分析するための簡単で効率的な方法として機能します。このプロトコルは、さまざまな段階の胚、さまざまな厚さの組織切片、およびさまざまな臓器に適用できます。まず、約10個の胚を0.5〜1ミリリットルの新鮮な4%パラホルムアルデヒドで1.5ミリリットルのマイクロファージチューブに摂氏4度で一晩12〜14時間固定します。PBST中の25、50、および75%メタノールで室温でそれぞれ5分間連続して洗浄することにより、胚を徐々に脱水します。次に、胚を100%メタノール中で室温で5分間洗浄する。胚を100%メタノール中でマイナス20°Cで少なくとも一晩、12〜14時間インキュベートします。PBST中の75、50、および25%メタノールで室温でそれぞれ5分間連続して洗浄することにより、胚を徐々に再水和します。再度、胚をPBSTで室温でそれぞれ5分間3回洗浄する。室温でPBST中でプロテイナーゼK1ミリリットル当たり10マイクログラムで胚を消化し、PBSTで5分間胚を3回洗浄する。次に、洗浄した胚を4%パラホルムアルデヒドに室温で15分間再固定します。再度、胚をPBSTで3回洗浄し、各洗浄中に5分間インキュベートします。胚をプレハイブリダイズするには、それらをプレハイブリダイゼーション溶液中で摂氏65度で5分間インキュベートします。次いで、プレハイブリダイゼーション溶液をハイブリダイゼーション溶液と交換し、少なくとも4時間プレハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション溶液中のプローブを摂氏95度で5分間加熱してから、胚に加えます。胚を空気と接触させないように、できるだけ多くのプレハイブリダイゼーション溶液を除去する。胚を含むチューブに、予熱したプローブをハイブリダイゼーション溶液に加え、プローブを摂氏50〜70度で12〜14時間一晩ハイブリダイズさせます。翌日、プローブ溶液をピペットで吸引し、マイナス20°Cのチューブに保管して、何度も再利用できるようにします。胚を100%ハイブリダイゼーション溶液で洗浄した後、摂氏65度で15分間、SSCTの2倍の濃度の75、50、および25%ハイブリダイゼーション溶液で順次洗浄します。その後、胚をSSCTの濃度の2倍と0.2倍で摂氏65度で15分間洗浄します。胚を室温のMABT中で10分間2回洗浄する。ハイブリダイズおよび洗浄した胚を室温で少なくとも2時間、2%ブロッキング溶液-1でブロックします。ブロッキング溶液-1を新しい2%ブロッキング溶液-1中のアンチジゴキシゲニンアルカリホスファターゼと交換し、摂氏4度で12〜14時間一晩振とうします。その後、胚をMABT中で室温で30分間4回洗浄する。繰り返しますが、胚をNTMTで2回洗浄し、ピペットを使用して胚からできるだけ多くのNTMTを取り除きます。BMパープルアルカリホスファターゼ基質と交換し、暗所で室温で胚を染色します。汚れができたら、NTMTで2回短時間すすぎ、反応を止めます。in situハイブリダイゼーション後、胚をPBSTで20分間3回すすぐ。胚をPBSの5%スクロースに4°Cで12〜14時間一晩浸します。次に、胚を覆う溶液をPBS中の15%スクロースに変更し、摂氏4度で12〜16時間一晩インキュベートします。繰り返しになりますが、胚を覆う溶液をPBS中の30%スクロースに変更し、摂氏4度で1〜2日間インキュベートします。胚を組織用の新しいクライオモールドに移し、気泡の形成を避けながら、最適な切断温度の培地で静かに満たします。次に、クライオスタットを使用して標本を12〜20マイクロメートルの厚さの切片に切断し、切片をスライドガラスにすばやく移します。サンプルを室温に到達させ、その後の使用のために摂氏マイナス80度の密閉スライドボックスにセクションを保管します。切片を含むスライドをPBSで5分間洗浄します。次に、スライドをバッファーに入れ、溶液を約20分間加熱して沸騰温度に近づけます。余分な溶液を排出し、各セクションの周囲をティッシュで慎重に乾燥させます。次に、撥水性ペンで切片の周りに円を描いて疎水性バリアを形成し、室温でブロッキング溶液-2で2時間切片をブロックします。一次抗体溶液をスライドごとにピペットで送り、免疫組織化学的ウェットボックス内で4°Cで一晩インキュベートします。各洗浄中に10分間インキュベートしながらスライドをPBSで3回洗浄し、余分なPBSを排出します。次に、スライドを適切な二次抗体とともにPBS中で室温で1時間インキュベートします。再度、各洗浄中に10分間インキュベートしながらスライドをPBSで3回洗浄し、余分なPBSを排出します。続いて、封入剤をスライド上にピペットで移し、スライドカバースリップで取り付けます。中枢神経系における5-HT2C受容体の発現は、トランスジェニックfoxP2 egfp-caax系統において検出された。5-HT2Cの同時発現は、フルオレセイン緑色蛍光タンパク質によって標識されたfoxP2ニューロンと共にトランスジェニック株において観察された。ゼブラフィッシュの脊髄および運動ニューロンにおけるジンクフィンガー転写因子であるinsm1aの発現がトランスジェニック系統で検出されました。insm1aの同時発現は、フルオレセイン緑色蛍光タンパク質によって標識されたhb9ニューロンと一緒にトランスジェニックラインで観察されました。ゼブラフィッシュは作りたてのパラホルムアルデヒドで固定する必要があります。

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Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

その後のホールマウントのための完全な脊髄損傷や脳解剖プロトコル<em&gt;その場で</em&gt;幼虫海ヤツメウナギにおけるハイブリダイゼーション

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

ミクログリアとニューロンのための例染色：凍結切片ラット脳組織の免疫組織化学のためのプライマー

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出<em&gt;その場での</em&gt;ハイブリダイゼーション

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

ラピッド<em&gt;その場で</emセロトニン症候群のラットのパラホルムアルデヒド接頭辞脳にオリゴヌクレオチドプローブを使用して&gt;ハイブリダイゼーション

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

ダブル蛍光を組み合わせます<em&gt;その場で</em&gt;マウス脳切片の3遺伝子の発現を検出するための免疫標識とのハイブリダイゼーション

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Locust AntennaeにおけるRNAによる嗅覚受容体遺伝子の局在<em&gt;現場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

その場で 凍結切片ゼブラフィッシュ胚における免疫組織化学と組み合わせたハイブリダイゼーション

その場で凍結切片ゼブラフィッシュ胚における免疫組織化学と組み合わせたハイブリダイゼーション