Name: in situ hybridization combined with immunohistochemistry in cryosectioned zebrafish embryos
Uploaded: 2022-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos at JoVE.com

이 작업은 중국 난퉁 과학 기술 재단 (MS12019011), 중국 난퉁 과학 기술 재단 (JC2021058) 및 장쑤 고등 교육 기관 자연 과학 재단 (21KJB180009)의 지원을 받았습니다.

모든 동물 프로토콜은 난퉁 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(No. S20191210-402)의 승인을 받았습니다.
1. 제브라 피쉬 배아 수집
<ol><li>알을 채취하기 전날 밤에 번식 탱크에 한 쌍의 제브라피쉬를 설치하는데, 하나는 형질전환 제브라피쉬이고 다른 하나는 AB 야생형 제브라피쉬(Tg (foxP2:egfp-caax) X AB 야생형 또는 Tg (hb9:egfp) X AB 야생형...

<ol>
	<li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li><li>Chen, E., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+genomics+research+model.">Zebrafish as a genomics research model.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).</li><li>Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: <a target="_blank" href="https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it">https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it</a> (2018)</li><li>Akam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+location+of+ultrabithorax+transcripts+in+Drosophila+tissue+sections.">The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections.</a> EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).</li><li>Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+in+situ+hybridization+method+for+the+detection+of+cellular+RNAs+in+Drosophila+tissue+sections+and+its+application+for+localizing+transcripts+of+the+homeotic+Antennapedia+gene+complex.">An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex.</a> EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).</li><li>Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryos+and+young+larvae.">In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).</li><li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification.">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li><li>Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+genetic+tools+for+studying+vertebrate+development.">Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development.</a> Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).</li><li>Cunningham, R. L., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry+for+zebrafish+larvae.">Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+5-HT(2C)+receptors+regulate+anxiety-like+behavior.">Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior.</a> Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).</li><li>Ferguson, J. L., Shive, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+immunofluorescence+and+immunohistochemistry+on+cryosectioned+zebrafish+embryos.">Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).</li><li>Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunohistochemistry+in+zebrafish+embryos+and+larvae.">Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).</li><li>Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+whole-mount+immunohistochemistry+of+zebrafish+(Danio+rerio)+embryos+and+larvae+protocol.">General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).</li><li>O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Garbage+in,+garbage+out:+a+critical+evaluation+of+strategies+used+for+validation+of+immunohistochemical+biomarkers.">Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers.</a> Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).</li></ol>

이 프로토콜은 제브라피쉬 배아에 대한 colocalization 실험에서 중요한 단계인 현장 혼성화와 면역조직화학의 조합을 제안합니다. 이 방법은 하나의 mRNA와 하나의 단백질을 동시에 분석하는 쉽고 효율적인 방법입니다. 제브라피쉬 배아에 대해 제자리 하이브리드화 및 항체 염색을 수행했습니다. 이전에 발표된 여러 프로토콜과 대조적으로14,15,16<...

제브라피쉬는 발달 및 유전학 연구를 위한 강력한 척추동물 모델입니다 1,2. 제브라피쉬와 인간은 높은 유전적 상동성(유전자의 70%가 인간 게놈과 공유됨)을 공유하여 인간 질병의 모델로 사용할 수 있습니다3. 제브라피쉬에서는 두 유전자의 발현 패턴과 공간적 관계를 감지하는 것이 일반적입니다. 면역조직화학(Immunohistochemistry)은 1941년에 FITC 표지 항체를 적용하여 감염된 조직에서 병원체를 검출하기 위해 처음 사용되었다4. 조직 섹션의 표적 단백질은 먼저 1차 항체로 표지되고, 그 다음에는 1차 항체의 숙주 종인 면역글로불린에 대한 2차 항체로 표지됩니다. 항체 염색은 단백질의 국소화를 검출하는 강력한 접근 방식으로, 세포 내 수준에서 높은 광학 분해능을 제공합니다. 그러나 제브라피쉬에서 사용할 수 있는 항체의 수는 매우 제한적입니다. 최근 연구에 따르면 약 112,000 개의 항체가 생쥐에 상업적으로 이용 가능합니다. 그러나 Zebrafish5에서 신뢰할 수 있는 것으로 입증된 항체는 거의 없습니다.
대신, 제브라피쉬에서 in situ 하이브리드화는 유전자 발현 패턴 분석에 널리 적용되었습니다. 이 방법은 1980년대초파리 배아의 유전자 발현을 평가하기 위해 처음 사용되었으며, 6,7, 그 이후로 이 기술은 지속적으로 개발되고 개선되었습니다. 초기에, 방사성 표지 DNA 프로브는 mRNA 전사체를 검출하기 위해 사용되었다; 그러나 공간 해상도는 상대적으로 낮았고 방사능으로 인한 잠재적인 건강 위험이 있었습니다. 그 후, 현장 하이브리드화는 디곡시제닌(DIG) 또는 플루오레세인(Fluo)으로 표지된 RNA 프로브에 의존하며, 이는 알칼리성 포스파타제(AP)에 접합되거나 형광 티라마이드 신호 증폭(TSA)에 의해 검출됩니다8,9. TSA가 2개 또는 3개의 유전자를 검출하는 데 사용되었지만 RNA 프로브의 DIG 라벨링 및 antiDIG AP 접합 항체는 여전히 고감도, 안정적이며 현장 혼성화를 위해 널리 사용되는 접근 방식입니다. 따라서 DIG 표지된 in situ 프로브와 결합된 상용화된 항체는 단백질 국소화 및 한 유전자의 발현에 대한 통찰력을 제공하는 데 유용합니다.
전체 마운트 배아는 낮은 광학 해상도로 인해 유전자 간의 공간적 관계를 밝힐 수 없지만, 제브라피쉬 배아는 작고 투명합니다10. 따라서 세포 내 수준에서 유전자의 발현 패턴을 분석하기 위해서는 절편이 필요합니다. Cryosectioning은 수행하기 쉽고 항원을 효과적으로 보존할 수 있기 때문에 제브라피쉬에서 널리 사용되었습니다. 따라서 제브라피쉬 냉동절편의 면역조직화학과 결합된 현장 혼성화는 두 유전자의 발현 패턴을 분석하는 강력한 방법을 제공합니다. 제브라피쉬11에 제자리 혼성화와 면역조직화학의 조합이 적용되었습니다. 그러나, 프로테이나제 K 처리는 항원 완전성을 희생시키면서 프로브 침투를 향상시키기 위해 사용되었다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 이 프로토콜은 항원 회수를 유도하기 위해 가열을 사용한다. 이 프로토콜은 다양한 두께의 다른 단계 및 조직 절편(14μm 머리 절편 및 20μm 척수 절편)의 배아에 적용할 수 있을 뿐만 아니라 두부와 척수를 포함한 두 기관에서 발현되는 유전자를 사용하여 검증되었습니다.
이 기사에서는 cryosections에서 제브라피쉬 배아에서 in situ hybridization과 항체 염색을 결합하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 다양성은 두 개의 서로 다른 뉴런에 대한 in situ 하이브리드화 프로브를 포함하여 다수의 in situ 하이브리드 화-면역조직화학 조합을 사용하여 입증됩니다. 이 방법은 서로 다른 영역과 다른 연령의 배아에서 mRNA와 단백질을 검출하는 데 적합하며 두 유전자의 발현 패턴을 검출하는 데 적합합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin AP Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM purple</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate buffer</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>IH0305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm</td>
			<td>Head Biotechnology</td>
			<td>H4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated Water</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B501005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera, fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NI-SSR 931479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 embryo medium</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>542858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYB</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>preHYB plus 50 &#181;g/mL heparin sodium salt, 100 &#181;g/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical wet box</td>
			<td>Mkbio</td>
			<td>MH10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile leica blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>116481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>M859248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTMT</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ADI-950-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4%</td>
			<td>Abbexa</td>
			<td>abx082483</td>
			<td>made in lab in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1x PBS plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylthiourea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103-85-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (10x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>preHYB</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1092766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R3629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5 mL tubes</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.2x SSC plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1x SSC plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish</td>
			<td>Laboratory Animal Center of Nantong University</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization combined with immunohistochemistry in cryosectioned zebrafish embryos

척추 동물로서 제브라 피쉬는 생물학적 연구에 널리 사용되었습니다. 제브라피쉬와 인간은 높은 유전적 상동성을 공유하여 인간 질병의 모델로 사용할 수 있습니다. 유전자 기능 연구는 유전자 발현 패턴의 검출을 기반으로 합니다. 면역조직화학은 단백질 발현을 분석하는 강력한 방법을 제공하지만, 제브라피쉬에서 상업적으로 이용 가능한 항체의 수가 제한되어 있어 코스테인의 적용이 제한됩니다. 제브라피쉬 배아에서 mRNA 발현을 검출하기 위해 제자리 하이브리드화( in situ hybridization)가 널리 사용됩니다. 이 프로토콜은 제브라피쉬 배아 섹션에 대한 현장 혼성화와 면역조직화학을 결합하여 이미지를 얻는 방법을 설명합니다. 저온 절개 전에 제자리 하이브리드화를 수행한 후 항체 염색을 수행했습니다. 면역조직화학 및 단일 cryosection의 이미징은 in situ hybridization 후에 수행되었습니다. 이 프로토콜은 먼저 현장 전사체 검출에 의해 두 유전자의 발현 패턴을 밝히는 데 도움이 되며, 그 다음에는 동일한 섹션의 단백질에 대한 면역조직화학에 의해 도움이 됩니다.

이 프로토콜은 하나의 mRNA와 하나의 단백질의 발현 패턴을 동시에 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 1은 실험 워크플로를 보여줍니다. 5-HT2C 수용체는 신경전달물질인 세로토닌(5-hydroxytryptamine, 5-HT)에 의해 결합된 5-HT 수용체의 아형이다. 중추신경계(CNS)에 널리 분포되어 있으며 식욕, 기분, 불안, 생식 행동 등 다양한 뇌 기능을 크게 조절할 수 있다13. CN...

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In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

이 프로토콜은 제브라피쉬 배아 절편의 현장 혼성화와 면역조직화학을 결합하여 이미지를 얻는 방법을 설명합니다. 저온 절개 전에 제자리 하이브리드화를 수행한 후 항체 염색을 수행했습니다. 항체가 부족한 경우 제브라피쉬에서 두 유전자의 발현 패턴을 감지하는 것이 유용합니다.

현장 Cryosectioned Zebrafish 배아에서 면역조직화학과 결합된 혼성화

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

이 프로토콜은 in situ hybridization과 면역조직화학의 조합을 사용하며, 하나의 mRNA와 하나의 단백질을 동시에 분석하는 쉽고 효율적인 방법으로 사용됩니다. 이 프로토콜은 다른 단계의 배아, 다양한 두께의 조직 절편 및 다른 장기에 적용할 수 있습니다. 시작하려면 섭씨 4도에서 12-14 시간 동안 밤새 섭씨 4 밀리리터의 미세 분리기 튜브에 0.5-1 밀리리터의 신선한 4 % 파라 포름 알데히드로 약 10 개의 배아를 고정시킵니다.실온에서 각각 5분 동안 PBST에서 25, 50 및 75% 메탄올로 연속적으로 세척하여 배아를 점진적으로 탈수합니다. 그런 다음 배아를 실온에서 5분 동안 100% 메탄올로 세척합니다. 섭씨 영하 20도에서 100% 메탄올로 배아를 적어도 하룻밤 동안, 12-14시간 동안 배양합니다.실온에서 각각 5분 동안 PBST에서 75, 50 및 25% 메탄올로 연속적으로 세척하여 배아를 점진적으로 재수화합니다. 다시, 배아를 실온에서 각각 5분 동안 PBST로 3회 세척한다. 실온에서 PBST에서 밀리리터당 10마이크로그램의 프로테이나제 K로 배아를 소화하고 5분 동안 PBST로 배아를 세 번 세척합니다.그런 다음 세척된 배아를 실온에서 4% 파라포름알데히드에 15분 동안 다시 고정합니다. 다시, 배아를 PBST로 세 번 세척하면서 각 세척 동안 5분 동안 배양합니다. 배아를 사전 혼성화하기 위해, 섭씨 65도의 사전 혼성화 용액에서 5분 동안 배양한다.이어서, 예비-하이브리드화 용액을 하이브리드화 용액으로 교체하고, 적어도 4시간 동안 프리하이브리드화한다. 배아에 추가하기 전에 섭씨 95도에서 5분 동안 하이브리드화 용액에서 프로브를 가열합니다. 배아가 공기와 접촉하지 않도록 가능한 한 많은 사전 혼성화 용액을 제거하십시오.배아가 들어 있는 튜브에 예열된 프로브를 하이브리드화 용액에 넣고 프로브가 섭씨 50도에서 14-12시간 동안 하룻밤 동안 하이브리드화되도록 합니다. 다음날 피펫으로 프로브 용액을 흡인하고 섭씨 영하 20도의 튜브에 보관하여 여러 번 재사용할 수 있도록 합니다. 배아를 100% 하이브리디제이션 용액으로 세척한 후 섭씨 65도에서 15분 동안 SSCT의 2배 농도로 75, 50, 25% 하이브리디제이션 용액으로 순차적으로 세척합니다.그 후, 섭씨 65도에서 15분 동안 SSCT 농도의 0.2배로 배아를 2회 세척한다. 실온에서 MABT에서 10 분 동안 배아를 두 번 씻으십시오. 하이브리드화되고 세척된 배아를 실온에서 최소 2시간 동안 차단하고 2% 차단 용액-1로 차단합니다.새로운 2% 차단 용액-1에서 차단 용액-1을 antidigoxigenin 알칼리성 포스파타제로 교체하고 섭씨 4도에서 12-14시간 동안 밤새 흔들어줍니다. 그런 다음 실온에서 30분 동안 MABT에서 배아를 4회 세척합니다. 다시 말하지만, NTMT에서 배아를 두 번 씻고 피펫을 사용하여 배아에서 가능한 한 많은 NTMT를 제거합니다.BM 보라색 알칼리성 포스파타제 기질로 교체하고 어둠 속에서 실온에서 배아를 염색합니다. 얼룩이 생기면 NTMT로 짧게 두 번 헹구어 반응을 멈춥니다. in situ 하이브리드화 후, 배아를 PBST로 20분 동안 세 번 헹굽니다.섭씨 4도에서 12-14시간 동안 PBS의 5% 자당에 배아를 담그십시오. 그런 다음 배아를 덮는 용액을 PBS에서 15 % 자당으로 바꾸고 섭씨 4도에서 12-16 시간 동안 밤새 배양합니다. 다시 말하지만, 배아를 덮는 용액을 PBS에서 30 % 자당으로 바꾸고 섭씨 4도에서 1-2 일 동안 배양하십시오.배아를 조직을 위한 새로운 cryomold로 옮기고 기포 형성을 피하면서 최적의 절단 온도 매체로 부드럽게 채웁니다. 다음으로, 저온 유지 장치를 사용하여 시편을 12-20 마이크로 미터 두께의 섹션으로 자르고 섹션을 유리 슬라이드로 신속하게 옮깁니다. 샘플이 실온에 도달하도록 하고 후속 사용을 위해 섭씨 영하 80도의 밀봉된 슬라이드 상자에 섹션을 보관합니다.절편을 포함하는 슬라이드를 PBS로 5분 동안 세척한다. 그런 다음 슬라이드를 버퍼에 넣고 용액을 약 20분 동안 가열하여 끓는 온도 근처를 유지합니다. 여분의 용액을 배출하고 티슈 조각으로 각 섹션 주변을 조심스럽게 건조시킵니다.그런 다음 발수성 펜으로 섹션 주위에 원을 그려 소수성 장벽을 형성하고 실온에서 차단 용액-2에서 2시간 동안 섹션을 차단합니다. 슬라이드 당 1차 항체 용액을 피펫팅하고 밤새 섭씨 4도의 면역조직화학 습윤 상자에서 슬라이드를 배양합니다. 슬라이드를 PBS로 3회 세척하면서 각 세척 동안 10분 동안 인큐베이션하고, 과량의 PBS를 배출한다.이어서, 적절한 2차 항체와 함께 슬라이드를 PBS에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 다시, 슬라이드를 PBS로 3회 세척하면서 각 세척 동안 10분 동안 인큐베이션하고, 과량의 PBS를 배출한다. 그런 다음 장착 매체를 슬라이드에 피펫팅하고 슬라이드 커버슬립으로 장착합니다.중추 신경계에서 5-HT2C 수용체의 발현은 형질전환 foxP2 egfp-caax 라인에서 검출되었습니다. 5-HT2C의 동시 발현은 fluorescein green fluorescent protein에 의해 표지 된 foxP2 뉴런과 함께 형질 전환 라인에서 관찰되었다. 제브라피쉬 척수와 운동 뉴런의 징크-핑거 전사 인자인 insm1a의 발현이 형질전환 계통에서 검출되었습니다.insm1a의 동시 발현은 플루오레세인 녹색 형광 단백질에 의해 표지된 hb9 뉴런과 함께 형질전환 라인에서 관찰되었습니다. Zebrafish는 갓 준비한 파라포름알데히드로 고정해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

더블 형광 현장에서</em신선한 두뇌 섹션> 하이브 리다이 제이션

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

연구

신경과학

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Lipophilic 염료를 결합, 현장에서 하이브리드화, Immunohistochemistry, 그리고 조직학

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

형광에 의한 신경 조직의 영구 DNA 바이러스의 게놈 및 성적 증명서의 검출 현장에서 하이브리드 면역 염색과 결합

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

이후 Wholemount을위한 완벽한 척수 손상 및 뇌 해부 프로토콜<em&gt; 제자리에서</em&gt; 애벌레 바다 장어의 하이브리드

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

미세 아교 세포와 신경 세포에 대한 예 염색 : 저온 절단 된 쥐의 뇌 조직에서 면역 조직 화학에 대한 입문서

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

고해상도를 사용하여 뇌 섹션에서 Axonally 지역화 된 mRNA를 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

빠른<em&gt; 현장에서</em세로토닌 증후군 쥐의 파라 포름 알데히드 - 접두사 뇌에 올리고 뉴클레오티드 프로브를 사용하여&gt; 하이브리드

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

더블 형광 결합<em&gt; 현장에서</em&gt; 마우스 뇌 섹션에서 세 가지 유전자의 발현의 검출을위한 Immunolabelling와 하이브리드

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

RNA에 의한 Locust Antenna 내의 악취 수용체 유전자의 국산화<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 화

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...