Name: in situ hybridization combined with immunohistochemistry in cryosectioned zebrafish embryos
Uploaded: 2022-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) og Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).

Alle dyreprotokoller ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Nantong University (nr. S20191210-402).
1. Innsamling av sebrafiskembryoer
<ol><li>Sett opp et par sebrafisk i avlstanker kvelden før eggene skal hentes, den ene en transgen sebrafisk og den andre en AB villtype sebrafisk (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB villtype eller Tg (hb9:egfp) X AB villtype) (se materialfortegnelsen). Bruk en diagonal pla...

<ol>
	<li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li><li>Chen, E., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+genomics+research+model.">Zebrafish as a genomics research model.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).</li><li>Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: <a target="_blank" href="https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it">https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it</a> (2018)</li><li>Akam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+location+of+ultrabithorax+transcripts+in+Drosophila+tissue+sections.">The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections.</a> EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).</li><li>Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+in+situ+hybridization+method+for+the+detection+of+cellular+RNAs+in+Drosophila+tissue+sections+and+its+application+for+localizing+transcripts+of+the+homeotic+Antennapedia+gene+complex.">An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex.</a> EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).</li><li>Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryos+and+young+larvae.">In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).</li><li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification.">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li><li>Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+genetic+tools+for+studying+vertebrate+development.">Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development.</a> Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).</li><li>Cunningham, R. L., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry+for+zebrafish+larvae.">Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+5-HT(2C)+receptors+regulate+anxiety-like+behavior.">Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior.</a> Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).</li><li>Ferguson, J. L., Shive, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+immunofluorescence+and+immunohistochemistry+on+cryosectioned+zebrafish+embryos.">Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).</li><li>Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunohistochemistry+in+zebrafish+embryos+and+larvae.">Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).</li><li>Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+whole-mount+immunohistochemistry+of+zebrafish+(Danio+rerio)+embryos+and+larvae+protocol.">General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).</li><li>O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Garbage+in,+garbage+out:+a+critical+evaluation+of+strategies+used+for+validation+of+immunohistochemical+biomarkers.">Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers.</a> Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).</li></ol>

Denne protokollen foreslår en kombinasjon av in situ hybridisering og immunhistokjemi, et viktig skritt i samlokaliseringsforsøkene på sebrafiskembryoer. Denne metoden fungerer som en enkel og effektiv måte å samtidig analysere ett mRNA og ett protein. In situ hybridisering og antistofffarging ble utført på sebrafiskembryoer. I motsetning til flere protokoller publisert tidligere14,15,16, ble immunfluorescens og im...

Sebrafisken er en kraftig virveldyrmodell for studier av utvikling og genetikk 1,2. Sebrafisk og mennesker deler høy genetisk homologi (70% av genene deles med det menneskelige genomet), noe som gjør det mulig å bruke det som en modell for menneskelige sykdommer3. Hos sebrafisk er det ganske vanlig å oppdage uttrykksmønstrene til to gener og deres romlige forhold. Immunhistokjemi ble først brukt i 1941 for å oppdage patogener i infisert vev ved å bruke FITC-merkede antistoffer4. Målproteinet i vevsseksjonen merkes først med et primært antistoff, og seksjonen blir deretter merket med et sekundært antistoff mot det primære antistoffets vertsart immunoglobulin. Antistofffarging er en robust tilnærming for å oppdage lokalisering av proteiner, som gir høy optisk oppløsning på intracellulært nivå. Antallet tilgjengelige antistoffer er imidlertid svært begrenset hos sebrafisk. En fersk studie viser at omtrent 112 000 antistoffer er kommersielt tilgjengelige for mus; Imidlertid har svært få antistoffer vist seg å være pålitelige i sebrafisk5.
I stedet, i sebrafisk, har in situ hybridisering blitt mye brukt for analyse av genuttrykksmønster. Denne metoden ble først brukt til å vurdere genuttrykk i Drosophila-embryoer på 1980-tallet6,7, og siden da har denne teknologien blitt kontinuerlig utviklet og forbedret. I utgangspunktet ble radiomerkede DNA-prober brukt til å oppdage mRNA-transkripter; Den romlige oppløsningen var imidlertid relativt lav, og det var potensielle helserisikoer forårsaket av radioaktiviteten. Deretter er in situ-hybridisering avhengig av RNA-probene merket med digoksigenin (DIG) eller fluorescein (Fluo), som er konjugert til alkalisk fosfatase (AP) eller detektert ved fluorescerende tyramidsignalforsterkning (TSA) 8,9. Selv om TSA har blitt brukt til å oppdage to eller tre gener, er DIG-merking av RNA-prober og antiDIG AP-konjugert antistoff fortsatt svært følsomme, stabile og mye brukte tilnærminger for in situ hybridisering. Derfor er kommersialiserte antistoffer kombinert med DIG-merkede in situ-sonder nyttige for å gi innsikt i proteinlokalisering og ekspresjon av ett gen.
Helmonterte embryoer kan ikke avsløre det romlige forholdet mellom gener på grunn av den lave optiske oppløsningen, selv om sebrafiskembryoer er små og gjennomsiktige10. Derfor er seksjonering nødvendig for å analysere ekspresjonsmønstrene til gener på intracellulært nivå. Kryoseksjonering har vært mye brukt i sebrafisk, da det er lett å utføre og effektivt kan bevare antigenet. Derfor tilbyr in situ-hybridisering kombinert med immunhistokjemi i sebrafiskkryoseksjoner en kraftig måte å analysere uttrykksmønstrene til to gener på. En kombinasjon av in situ hybridisering og immunhistokjemi er anvendt på sebrafisk11. Imidlertid ble proteinase K-behandling brukt til å forbedre sondepenetrasjonen på bekostning av antigenintegritet. For å overvinne denne begrensningen bruker denne protokollen oppvarming for å indusere antigeninnhenting. Denne protokollen gjelder ikke bare embryoer av forskjellige stadier og vevsseksjoner av forskjellige tykkelser (14 μm hodeseksjoner og 20 μm ryggmargsseksjoner), men den har også blitt verifisert ved å bruke gener uttrykt i to organer, inkludert hodet og ryggmargen.
Denne artikkelen vil beskrive hvordan man kombinerer in situ hybridisering og antistofffarging i sebrafiskembryoer i kryoseksjoner. Allsidigheten til denne protokollen er demonstrert ved å bruke en rekke in situ hybridisering-immunhistokjemi kombinasjoner, inkludert in situ hybridiseringsprober for to forskjellige nevroner. Denne metoden er egnet for å oppdage mRNA og protein i forskjellige regioner og embryoer av forskjellige aldre, samt uttrykksmønstrene til to gener.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin AP Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM purple</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate buffer</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>IH0305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm</td>
			<td>Head Biotechnology</td>
			<td>H4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated Water</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B501005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera, fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NI-SSR 931479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 embryo medium</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>542858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYB</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>preHYB plus 50 &#181;g/mL heparin sodium salt, 100 &#181;g/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical wet box</td>
			<td>Mkbio</td>
			<td>MH10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile leica blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>116481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>M859248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTMT</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ADI-950-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4%</td>
			<td>Abbexa</td>
			<td>abx082483</td>
			<td>made in lab in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1x PBS plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylthiourea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103-85-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (10x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>preHYB</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1092766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R3629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5 mL tubes</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.2x SSC plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1x SSC plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish</td>
			<td>Laboratory Animal Center of Nantong University</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization combined with immunohistochemistry in cryosectioned zebrafish embryos

Som virveldyr har sebrafisken vært mye brukt i biologiske studier. Sebrafisk og mennesker deler høy genetisk homologi, noe som gjør det mulig å bruke det som en modell for menneskelige sykdommer. Genfunksjonsstudie er basert på påvisning av genuttrykksmønstre. Selv om immunhistokjemi tilbyr en kraftig måte å analysere proteinuttrykk på, begrenser det begrensede antallet kommersielt tilgjengelige antistoffer i sebrafisk anvendelsen av costaining. In situ hybridisering er mye brukt i sebrafiskembryoer for å oppdage mRNA-uttrykk. Denne protokollen beskriver hvordan man kan ta bilder ved å kombinere in situ hybridisering og immunhistokjemi for sebrafiskembryoseksjoner. In situ hybridisering ble utført før kryoseksjonering, etterfulgt av antistofffarging. Immunhistokjemi og avbildning av et enkelt kryosnitt ble utført etter in situ hybridisering. Protokollen er nyttig for å avdekke ekspresjonsmønsteret til to gener, først ved in situ transkriptdeteksjon og deretter ved immunhistokjemi mot et protein i samme seksjon.

Denne protokollen kan brukes til samtidig å undersøke uttrykksmønsteret til ett mRNA og ett protein. Figur 1 viser den eksperimentelle arbeidsflyten. 5-HT2C-reseptoren er en subtype av 5-HT-reseptoren bundet av nevrotransmitteren serotonin (5-hydroksytryptamin, 5-HT). Det er utbredt i sentralnervesystemet (CNS) og kan betydelig regulere en rekke hjernefunksjoner, inkludert appetitt, humør, angst og reproduktiv oppførsel13. Ekspresjonen av 5-HT2C i CNS ble detekte...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos at JoVE.com

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

Denne protokollen beskriver hvordan man kan ta bilder ved å kombinere in situ hybridisering og immunhistokjemi av sebrafiskens embryonale seksjoner. In situ hybridisering ble utført før kryoseksjonering, etterfulgt av antistofffarging. Det er nyttig å påvise uttrykksmønstre av to gener hos sebrafisk hvis det er mangel på antistoffer.

In situ Hybridisering kombinert med immunhistokjemi i kryoseksjonerte sebrafiskembryoer

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

Denne protokollen bruker en kombinasjon av in situ hybridisering og immunhistokjemi, og det fungerer som en enkel og effektiv måte å samtidig analysere ett mRNA og ett protein. Denne protokollen gjelder for embryoer på forskjellige stadier, vevseksjoner av forskjellig tykkelse og forskjellige organer. For å begynne, fikser omtrent 10 embryoer med 0,5 til 1 milliliter fersk 4% paraformaldehyd i et 1,5 milliliter mikrofugerør ved fire grader Celsius over natten i 12 til 14 timer.Dehydrer embryoene gradvis ved å vaske med 25, 50 og 75% metanol i PBST suksessivt i fem minutter hver ved romtemperatur. Vask deretter embryoene i 100% metanol i fem minutter ved romtemperatur. Inkuber embryoene i 100% metanol ved minus 20 grader Celsius i minst over natten, i 12 til 14 timer.Rehydrer embryoene gradvis ved å vaske med 75, 50 og 25% metanol i PBST suksessivt i fem minutter hver ved romtemperatur. Igjen, vask embryoet tre ganger med PBST i fem minutter hver ved romtemperatur. Fordøy embryoene med 10 mikrogram per milliliter proteinase K i PBST ved romtemperatur, og vask embryoene tre ganger med PBST i fem minutter.Deretter refikser du de vasket embryoene i 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur. Igjen, vask embryoet tre ganger med PBST mens du ruger i fem minutter under hver vask. For prehybridisering av embryoene, inkuber dem i pre-hybridiseringsløsning ved 65 grader Celsius i fem minutter.Deretter erstatter du prehybridiseringsløsningen med hybridiseringsløsningen og prehybridiserer i minst fire timer. Varm sonden i hybridiseringsløsningen i fem minutter ved 95 grader Celsius før du legger til embryoene. Fjern så mye pre-hybridiseringsløsning som mulig uten å la embryoene komme i kontakt med luften.Til røret som inneholder embryoene, tilsett forvarmet sonde i hybridiseringsløsningen og la sonden hybridisere over natten i 12 til 14 timer ved 50 til 70 grader Celsius. Neste dag, aspirer sondeløsningen med en pipette og oppbevar den i et rør ved minus 20 grader Celsius, slik at den kan gjenbrukes mange ganger. Vask embryoene med 100% hybridiseringsløsning etterfulgt av sekvensiell vask med 75, 50 og 25% hybridiseringsløsning i to ganger konsentrasjonen av SSCT i 15 minutter ved 65 grader Celsius.Vask deretter embryoene i to ganger og 0,2 ganger konsentrasjonen av SSCT i 15 minutter ved 65 grader Celsius. Vask embryoene to ganger i 10 minutter i MABT ved romtemperatur. Blokker hybridiserte og vasket embryoer i minst to timer ved romtemperatur, med 2% blokkerende løsning-1.Bytt ut blokkeringsløsningen-1 med antidigoksigenin alkalisk fosfatase i en frisk 2% blokkerende løsning-1 og rist over natten i 12 til 14 timer ved fire grader Celsius. Vask deretter embryoene fire ganger i MABT i 30 minutter ved romtemperatur. Igjen, vask embryoene to ganger i NTMT og fjern så mye NTMT som mulig fra embryoene ved hjelp av en pipette.Bytt ut med BM lilla alkalisk fosfatasesubstrat og flekk embryoene ved romtemperatur i mørket. Når flekken har utviklet seg, stopp reaksjonen ved å skylle kort to ganger med NTMT. Etter in situ hybridisering, skyll embryoene med PBST tre ganger i 20 minutter.Fordyp embryoene i 5% sukrose i PBS over natten i 12 til 14 timer ved fire grader Celsius. Bytt deretter løsningen som dekker embryoene til 15% sukrose i PBS og inkuber over natten i 12 til 16 timer ved fire grader Celsius. Igjen, endre løsningen som dekker embryoene til 30% sukrose i PBS og inkuber i en til to dager ved fire grader Celsius.Overfør embryoene til en ny kryomold for vev og fyll den forsiktig med optimalt skjæretemperaturmedium samtidig som du unngår dannelse av bobler. Deretter kutter du prøvene i 12 til 20 mikrometer tykke seksjoner ved hjelp av en kryostat og overfører raskt seksjonene til glassglass. La prøvene nå romtemperatur og oppbevar seksjonene i en forseglet glideboks ved minus 80 grader Celsius for senere bruk.Vask lysbildene som inneholder seksjonene med PBS i fem minutter. Plasser deretter lysbildene i bufferen og varm opp løsningen i ca. 20 minutter for å holde den nær koketemperaturen. Tøm overflødig løsning og tørk forsiktig området rundt hver seksjon med et stykke vev.Deretter tegner du en sirkel rundt seksjonen med en vannavvisende penn for å danne en hydrofob barriere og blokkerer seksjonen i to timer ved blokkeringsløsning-2 ved romtemperatur. Pipette primær antistoffløsning per lysbilde og inkuber lysbildene i en immunhistokjemisk våtboks ved fire grader Celsius over natten. Vask lysbildene tre ganger med PBS mens du ruger i 10 minutter under hver vask, og tøm overflødig PBS.Inkuber deretter lysbildene med passende sekundært antistoff i en time ved romtemperatur i PBS. Igjen, vask lysbildene tre ganger med PBS mens du ruger i 10 minutter under hver vask, og tøm overflødig PBS. Deretter pipetterer du monteringsmediet på lysbildet og monteres med et glidedeksel.Ekspresjonen av 5-HT2C-reseptor i sentralnervesystemet ble påvist i den transgene foxP2 egfp-caax-linjen. Samtidig ekspresjon av 5-HT2C ble observert i den transgene linjen sammen med foxP2-nevroner, som ble merket av fluoresceingrønt fluorescerende protein. Ekspresjonen av insm1a, en sink-finger transkripsjonsfaktor i sebrafiskens ryggmarg og motornevroner, ble påvist i den transgene linjen.Samtidig ekspresjon av insm1a ble observert i den transgene linjen sammen med hb9-nevroner, som ble merket av fluoresceingrønt fluorescerende protein. Sebrafisk må festes med nylaget paraformaldehyd.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Påvisning av Genome og transkripsjoner av en vedvarende DNA virus i nerve vev ved Fluorescent In situ Hybridisering Kombinert med Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Komplett ryggmargsskade og Brain Dissection Protokoll for Følgende Wholemount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i Larve Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Primer for Immunhistokjemi på Cryosectioned Rat hjernevev: Eksempel Farging for Microglia og Nevroner

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Påvisning av Axonally Lokalisert mRNAs i hjernedelene med høy oppløsning<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapid<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering bruker oligonukleotidprober på Paraformaldehyde-prefiks Brain of Rats med serotonergt syndrom

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Utnytte Kombinert Metoder for å definere rollen til plasmamembranen Levering Under Axon Forgrening og neuronal morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Kombinere Double Fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering med immunomerking for Påvisning av Expression of Three Gener i musehjerne §§

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Lokalisering av luktningsmiddelreceptorgener i Locust Antenna av RNA<em&gt; I situ</em&gt; Hybridisering

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...