Name: in situ hybridization combined with immunohistochemistry in cryosectioned zebrafish embryos
Uploaded: 2022-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), pela Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) e pela Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).

Todos os protocolos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Nantong (nº S20191210-402).
1. Coleta de embriões de peixe-zebra
<ol><li>Configure um par de peixes-zebra em tanques de reprodução na noite anterior à coleta dos ovos, um peixe-zebra transgênico e o outro um peixe-zebra selvagem AB (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB wild-type ou Tg (hb9:egfp) X AB wild-type) (veja a Tabel...

<ol>
	<li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li><li>Chen, E., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+genomics+research+model.">Zebrafish as a genomics research model.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).</li><li>Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: <a target="_blank" href="https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it">https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it</a> (2018)</li><li>Akam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+location+of+ultrabithorax+transcripts+in+Drosophila+tissue+sections.">The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections.</a> EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).</li><li>Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+in+situ+hybridization+method+for+the+detection+of+cellular+RNAs+in+Drosophila+tissue+sections+and+its+application+for+localizing+transcripts+of+the+homeotic+Antennapedia+gene+complex.">An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex.</a> EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).</li><li>Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryos+and+young+larvae.">In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).</li><li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification.">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li><li>Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+genetic+tools+for+studying+vertebrate+development.">Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development.</a> Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).</li><li>Cunningham, R. L., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry+for+zebrafish+larvae.">Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+5-HT(2C)+receptors+regulate+anxiety-like+behavior.">Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior.</a> Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).</li><li>Ferguson, J. L., Shive, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+immunofluorescence+and+immunohistochemistry+on+cryosectioned+zebrafish+embryos.">Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).</li><li>Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunohistochemistry+in+zebrafish+embryos+and+larvae.">Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).</li><li>Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+whole-mount+immunohistochemistry+of+zebrafish+(Danio+rerio)+embryos+and+larvae+protocol.">General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).</li><li>O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Garbage+in,+garbage+out:+a+critical+evaluation+of+strategies+used+for+validation+of+immunohistochemical+biomarkers.">Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers.</a> Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).</li></ol>

Este protocolo propõe uma combinação de hibridização in situ e imunohistoquímica, um passo importante nos experimentos de colocalização em embriões de zebrafish. Este método serve como uma maneira fácil e eficiente de analisar simultaneamente um RNAm e uma proteína. Hibridização in situ e coloração de anticorpos foram realizadas em embriões de zebrafish. Em contraste com vários protocolos publicadosanteriormente14,15,16,<sup cl...

O zebrafish é um poderoso modelo de vertebrado para estudos de desenvolvimento egenética1,2. Zebrafish e humanos compartilham alta homologia genética (70% dos genes são compartilhados com o genoma humano), o que permite seu uso como modelo para doenças humanas3. No peixe-zebra, é bastante comum detectar os padrões de expressão de dois genes e sua relação espacial. A imuno-histoquímica foi utilizada pela primeira vez em 1941 para detectar patógenos em tecidos infectados por meio da aplicação de anticorpos marcados com FITC4. A proteína-alvo na seção de tecido é primeiramente marcada com um anticorpo primário, e a seção é então marcada com um anticorpo secundário contra a imunoglobulina da espécie hospedeira do anticorpo primário. A coloração de anticorpos é uma abordagem robusta para detectar a localização de proteínas, que oferece alta resolução óptica em nível intracelular. No entanto, o número de anticorpos disponíveis é muito limitado em peixes-zebra. Um estudo recente mostra que aproximadamente 112.000 anticorpos estão comercialmente disponíveis para camundongos; no entanto, muito poucos anticorpos demonstraram ser confiáveis em zebrafish5.
Em vez disso, em peixes-zebra, a hibridização in situ tem sido amplamente aplicada para análise de padrões de expressão gênica. Esse método foi utilizado pela primeira vez para avaliar a expressão gênica em embriões de Drosophila na década de 19806,7 e, desde então, essa tecnologia vem sendo continuamente desenvolvida e aprimorada. Inicialmente, sondas de DNA radiomarcadas foram usadas para detectar transcritos de RNAm; no entanto, a resolução espacial foi relativamente baixa, e houve riscos potenciais à saúde causados pela radioatividade. Posteriormente, a hibridização in situ depende das sondas de RNA marcadas com digoxigenina (DIG) ou fluoresceína (Fluo), que são conjugadas à fosfatase alcalina (FA) ou detectadas por amplificação fluorescente do sinal da tiramida (TSA)8,9. Embora a TSA tenha sido usada para detectar dois ou três genes, a marcação DIG de sondas de RNA e o anticorpo conjugado antiDIG AP ainda são abordagens altamente sensíveis, estáveis e amplamente utilizadas para hibridização in situ. Portanto, anticorpos comercializados combinados com sondas in situ marcadas com DIG são úteis para fornecer informações sobre a localização e expressão de proteínas de um gene.
Embriões de montagem total não podem revelar a relação espacial entre genes devido à baixa resolução óptica, embora os embriões de peixe-zebra sejam pequenos e transparentes10. Assim, o corte é necessário para analisar os padrões de expressão de genes em nível intracelular. A criossecção tem sido amplamente utilizada em peixes-zebra, pois é de fácil execução e pode efetivamente preservar o antígeno. Portanto, a hibridização in situ combinada com imunohistoquímica em criossecções de peixe-zebra oferece uma maneira poderosa de analisar os padrões de expressão de dois genes. Uma combinação de hibridização in situ e imunohistoquímica foi aplicada ao zebrafish11. No entanto, o tratamento com proteinase K foi usado para aumentar a penetração da sonda em detrimento da integridade do antígeno. Para superar essa limitação, este protocolo utiliza o aquecimento para induzir a recuperação antigênica. Este protocolo não só é aplicável a embriões de diferentes estágios e cortes de tecidos de várias espessuras (cortes de cabeça de 14 μm e cortes medulares de 20 μm), mas também foi verificado usando genes expressos em dois órgãos, incluindo a cabeça e a medula espinhal.
Este artigo descreverá como combinar hibridização in situ e coloração de anticorpos em embriões de zebrafish em criossecções. A versatilidade deste protocolo é demonstrada pelo uso de várias combinações de hibridização in situ-imunohistoquímica, incluindo sondas de hibridização in situ para dois neurônios diferentes. Este método é adequado para detectar mRNA e proteína em diferentes regiões e embriões de diferentes idades, bem como os padrões de expressão de dois genes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin AP Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM purple</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate buffer</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>IH0305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm</td>
			<td>Head Biotechnology</td>
			<td>H4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated Water</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B501005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera, fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NI-SSR 931479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 embryo medium</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>542858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYB</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>preHYB plus 50 &#181;g/mL heparin sodium salt, 100 &#181;g/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical wet box</td>
			<td>Mkbio</td>
			<td>MH10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile leica blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>116481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>M859248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTMT</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ADI-950-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4%</td>
			<td>Abbexa</td>
			<td>abx082483</td>
			<td>made in lab in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1x PBS plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylthiourea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103-85-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (10x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>preHYB</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1092766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R3629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5 mL tubes</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.2x SSC plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1x SSC plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish</td>
			<td>Laboratory Animal Center of Nantong University</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization combined with immunohistochemistry in cryosectioned zebrafish embryos

Como vertebrado, o zebrafish tem sido amplamente utilizado em estudos biológicos. Zebrafish e humanos compartilham alta homologia genética, o que permite seu uso como modelo para doenças humanas. O estudo da função gênica baseia-se na detecção de padrões de expressão gênica. Embora a imunohistoquímica ofereça uma maneira poderosa de avaliar a expressão de proteínas, o número limitado de anticorpos comercialmente disponíveis em zebrafish restringe a aplicação de costaína. A hibridização in situ é amplamente utilizada em embriões de peixe-zebra para detectar a expressão de RNAm. Este protocolo descreve como obter imagens combinando hibridização in situ e imunohistoquímica para cortes de embriões de peixe-zebra. A hibridização in situ foi realizada antes da criossecção, seguida da coloração de anticorpos. A imuno-histoquímica e a obtenção de imagens de uma única criossecção foram realizadas após hibridização in situ . O protocolo é útil para desvendar o padrão de expressão de dois genes, primeiro pela detecção in situ do transcrito e depois pela imunohistoquímica contra uma proteína na mesma seção.

Este protocolo pode ser usado para examinar simultaneamente o padrão de expressão de um RNAm e uma proteína. A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho experimental. O receptor 5-HT2C é um subtipo do receptor 5-HT ligado pelo neurotransmissor serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT). É amplamente distribuída no sistema nervoso central (SNC) e pode regular significativamente uma variedade de funções cerebrais, incluindo apetite, humor, ansiedade e comportamento reprodutivo1...

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In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

Este protocolo descreve como obter imagens combinando hibridização in situ e imunohistoquímica de cortes embrionários de zebrafish. A hibridização in situ foi realizada antes da criossecção, seguida da coloração de anticorpos. É útil detectar os padrões de expressão de dois genes em peixes-zebra se houver escassez de anticorpos.

In situ Hibridização Combinada com Imunohistoquímica em Embriões de Zebrafish Crioseccionados

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

Este protocolo utiliza uma combinação de hibridização in situ e imunohistoquímica, e serve como uma maneira fácil e eficiente de analisar simultaneamente um RNAm e uma proteína. Este protocolo é aplicável a embriões em diferentes estágios, cortes de tecidos de várias espessuras e diferentes órgãos. Para começar, fixe aproximadamente 10 embriões com 0,5 a 1 mililitro de paraformaldeído fresco a 4% em um tubo de microfuga de 1,5 mililitro a quatro graus Celsius durante a noite por 12 a 14 horas.Desidratar gradualmente os embriões lavando com 25, 50 e 75% de metanol em PBST sucessivamente por cinco minutos cada um à temperatura ambiente. Em seguida, lavar os embriões em metanol a 100% por cinco minutos à temperatura ambiente. Incubar os embriões em metanol a 100% a menos 20 graus Celsius durante pelo menos durante a noite, durante 12 a 14 horas.Reidratar gradualmente os embriões lavando com 75, 50 e 25% de metanol em PBST sucessivamente por cinco minutos cada um à temperatura ambiente. Novamente, lave o embrião três vezes com PBST por cinco minutos cada em temperatura ambiente. Digerir os embriões com 10 microgramas por mililitro de proteinase K em PBST à temperatura ambiente e lavar os embriões três vezes com PBST durante cinco minutos.Em seguida, refixar os embriões lavados em paraformaldeído a 4% por 15 minutos à temperatura ambiente. Novamente, lave o embrião três vezes com PBST enquanto incuba por cinco minutos durante cada lavagem. Para pré-hibridização dos embriões, incubá-los em solução de pré-hibridização a 65 graus Celsius por cinco minutos.Em seguida, substitua a solução de pré-hibridização pela solução de hibridização e pré-hibridize por pelo menos quatro horas. Aqueça a sonda na solução de hibridização por cinco minutos a 95 graus Celsius antes de adicionar aos embriões. Remova o máximo possível de solução de pré-hibridização sem deixar os embriões entrarem em contato com o ar.Ao tubo que contém os embriões, adicione a sonda pré-aquecida na solução de hibridização e deixe a sonda hibridizar durante a noite por 12 a 14 horas a 50 a 70 graus Celsius. No dia seguinte, aspirar a solução da sonda com uma pipeta e armazená-la em um tubo a menos 20 graus Celsius para que possa ser reutilizada muitas vezes. Lavar os embriões com solução de hibridização a 100% seguida de lavagem sequencial com solução de hibridização a 75, 50 e 25% em duas vezes a concentração de SSCT durante 15 minutos a 65 graus Celsius.Em seguida, lave os embriões em duas vezes e 0,2 vezes a concentração de SSCT por 15 minutos a 65 graus Celsius. Lavar os embriões duas vezes por 10 minutos em MABT à temperatura ambiente. Bloquear os embriões hibridizados e lavados por pelo menos duas horas à temperatura ambiente, com solução de bloqueio a 2%-1.Substitua a solução de bloqueio-1 por fosfatase alcalina antidigoxigenina em uma solução de bloqueio a 2%-1 fresca e agite durante a noite por 12 a 14 horas a quatro graus Celsius. Em seguida, lavar os embriões quatro vezes em MABT por 30 minutos em temperatura ambiente. Novamente, lave os embriões duas vezes em NTMT e remova o máximo possível de NTMT dos embriões usando uma pipeta.Substitua pelo substrato de fosfatase alcalina roxa BM e core os embriões à temperatura ambiente no escuro. Uma vez que a mancha tenha se desenvolvido, pare a reação enxaguando brevemente duas vezes com NTMT. Após hibridização in situ, enxaguar os embriões com PBST três vezes por 20 minutos.Imergir os embriões em sacarose a 5% em PBS durante a noite por 12 a 14 horas a quatro graus Celsius. Em seguida, troque a solução que cobre os embriões para 15% de sacarose em PBS e incube durante a noite por 12 a 16 horas a quatro graus Celsius. Novamente, troque a solução que cobre os embriões para 30% de sacarose em PBS e incube por um a dois dias a quatro graus Celsius.Transfira os embriões para um novo criomold para tecido e preencha-o suavemente com meio de temperatura de corte ideal, evitando a formação de bolhas. Em seguida, corte os corpos de prova em seções de 12 a 20 micrômetros de espessura usando um criostato e transfira rapidamente as seções para lâminas de vidro. Permitir que as amostras atinjam a temperatura ambiente e armazenar as secções numa caixa deslizante selada a menos 80 graus Celsius para utilização subsequente.Lave as lâminas contendo as seções com PBS por cinco minutos. Em seguida, coloque as lâminas no tampão e aqueça a solução por aproximadamente 20 minutos para mantê-la próxima à temperatura de ebulição. Escorra o excesso de solução e seque cuidadosamente a área ao redor de cada seção com um pedaço de tecido.Em seguida, desenhe um círculo ao redor da seção com uma caneta hidrorrepelente para formar uma barreira hidrofóbica e bloqueie a seção por duas horas em solução de bloqueio-2 à temperatura ambiente. Pipetar a solução de anticorpos primários por lâmina e incubar as lâminas em uma caixa úmida imunohistoquímica a quatro graus Celsius durante a noite. Lave as lâminas três vezes com PBS enquanto incuba por 10 minutos durante cada lavagem e escorra o excesso de PBS.Em seguida, incubar as lâminas com o anticorpo secundário apropriado por uma hora à temperatura ambiente em PBS. Novamente, lave as lâminas três vezes com PBS enquanto incuba por 10 minutos durante cada lavagem e escorra o excesso de PBS. Posteriormente, pipete o meio de montagem na corrediça e monte com uma tampa deslizante.A expressão do receptor 5-HT2C no sistema nervoso central foi detectada na linhagem transgênica foxP2 egfp-caax. A expressão simultânea de 5-HT2C foi observada na linhagem transgênica juntamente com os neurônios foxP2, os quais foram marcados pela proteína fluorescente verde fluoresceína. A expressão de insm1a, um fator de transcrição zinco-dedo na medula espinhal e neurônios motores do peixe-zebra, foi detectada na linhagem transgênica.A expressão simultânea de insm1a foi observada na linhagem transgênica juntamente com os neurônios hb9, os quais foram marcados pela proteína fluorescente verde fluoresceína. O peixe-zebra deve ser fixado com paraformaldeído preparado na hora.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Fluorescência dupla In situ Hibridação nas Seções cérebro fresco

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Neurociência

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combinando corante lipofílico, In situ Hibridação, imunohistoquímica e histologia

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

A detecção do genoma e Transcrições de um vírus DNA persistente em tecidos neuronais por fluorescentes Em situ Hibridização Combinado com Imunocoloração

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Spinal Cord Injury completo e Cérebro Dissection Protocolo para Wholemount Subsequente<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização em larval da lampreia de mar

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Primer para imunohistoquímica em tecido criosseccionada cérebro de um rato: Exemplo de coloração para Microglia e Neurônios

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detecção de Axonally localizada mRNAs em seções do cérebro Usando de alta resolução<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rápido<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação usando sondas Oligonucleotide no cérebro prefixado-paraformaldeído de ratos com síndrome serotoninérgica

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Utilizando metodologias combinadas para definir o papel do Plasma Membrane entrega durante Axon Ramificação e Neuronal morfogênese

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Combinando Duplo Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com imunomarcação para a detecção da expressão de três genes em secções do cérebro do rato

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localização de Genes de Receptor de Odorantes em Antenas de Locustídeo por RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridação

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...