Name: in situ hybridization combined with immunohistochemistry in cryosectioned zebrafish embryos
Uploaded: 2022-03-03T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencia y Tecnología de Nantong de China (MS12019011), la Fundación de Ciencia y Tecnología de Nantong de China (JC2021058) y la Fundación de Ciencias Naturales de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (21KJB180009).

Todos los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Nantong (No. S20191210-402).
1. Recolección de embriones de pez cebra
<ol><li>Coloque un par de peces cebra en tanques de reproducción la noche antes de que se recolecten los huevos, uno un pez cebra transgénico y el otro un pez cebra de tipo salvaje AB (Tg (foxP2: egfp-caax) X AB tipo salvaje o Tg (hb9: egfp) X AB ti...

<ol>
	<li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li><li>Chen, E., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+genomics+research+model.">Zebrafish as a genomics research model.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).</li><li>Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: <a target="_blank" href="https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it">https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it</a> (2018)</li><li>Akam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+location+of+ultrabithorax+transcripts+in+Drosophila+tissue+sections.">The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections.</a> EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).</li><li>Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+in+situ+hybridization+method+for+the+detection+of+cellular+RNAs+in+Drosophila+tissue+sections+and+its+application+for+localizing+transcripts+of+the+homeotic+Antennapedia+gene+complex.">An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex.</a> EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).</li><li>Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryos+and+young+larvae.">In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).</li><li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification.">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li><li>Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+genetic+tools+for+studying+vertebrate+development.">Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development.</a> Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).</li><li>Cunningham, R. L., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry+for+zebrafish+larvae.">Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+5-HT(2C)+receptors+regulate+anxiety-like+behavior.">Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior.</a> Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).</li><li>Ferguson, J. L., Shive, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+immunofluorescence+and+immunohistochemistry+on+cryosectioned+zebrafish+embryos.">Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).</li><li>Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunohistochemistry+in+zebrafish+embryos+and+larvae.">Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).</li><li>Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+whole-mount+immunohistochemistry+of+zebrafish+(Danio+rerio)+embryos+and+larvae+protocol.">General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).</li><li>O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Garbage+in,+garbage+out:+a+critical+evaluation+of+strategies+used+for+validation+of+immunohistochemical+biomarkers.">Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers.</a> Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).</li></ol>

Este protocolo propone una combinación de hibridación in situ e inmunohistoquímica, un paso importante en los experimentos de colocalización en embriones de pez cebra. Este método sirve como una forma fácil y eficiente de analizar simultáneamente un ARNm y una proteína. La hibridación in situ y la tinción de anticuerpos se realizaron en embriones de pez cebra. En contraste con varios protocolos publicados anteriormente14,15,16,<sup cla...

El pez cebra es un poderoso modelo vertebrado para estudios de desarrollo y genética 1,2. El pez cebra y los humanos comparten una alta homología genética (el 70% de los genes son compartidos con el genoma humano), lo que permite su uso como modelo para enfermedades humanas3. En el pez cebra, es bastante común detectar los patrones de expresión de dos genes y su relación espacial. La inmunohistoquímica se utilizó por primera vez en 1941 para detectar patógenos en tejidos infectados mediante la aplicación de anticuerpos marcados con FITC4. La proteína diana en la sección de tejido se marca primero con un anticuerpo primario, y la sección se marca con un anticuerpo secundario contra la inmunoglobulina de la especie huésped del anticuerpo primario. La tinción de anticuerpos es un enfoque robusto para detectar la localización de proteínas, que ofrece una alta resolución óptica a nivel intracelular. Sin embargo, el número de anticuerpos disponibles es muy limitado en el pez cebra. Un estudio reciente muestra que aproximadamente 112,000 anticuerpos están disponibles comercialmente para ratones; Sin embargo, se ha demostrado que muy pocos anticuerpos son confiables en el pez cebra5.
En cambio, en el pez cebra, la hibridación in situ se ha aplicado ampliamente para el análisis de patrones de expresión génica. Este método se utilizó por primera vez para evaluar la expresión génica en embriones de Drosophila en la década de 19806,7, y desde entonces, esta tecnología se ha desarrollado y mejorado continuamente. Inicialmente, se utilizaron sondas de ADN radiomarcadas para detectar transcripciones de ARNm; Sin embargo, la resolución espacial era relativamente baja y había riesgos potenciales para la salud causados por la radiactividad. Posteriormente, la hibridación in situ se basa en las sondas de ARN marcadas con digoxigenina (DIG) o fluoresceína (Fluo), que se conjugan con fosfatasa alcalina (AP) o se detectan mediante amplificación de señal de tiramida fluorescente (TSA)8,9. Aunque TSA se ha utilizado para detectar dos o tres genes, el marcado DIG de sondas de ARN y el anticuerpo conjugado antiDIG AP siguen siendo enfoques altamente sensibles, estables y ampliamente utilizados para la hibridación in situ. Por lo tanto, los anticuerpos comercializados combinados con sondas in situ marcadas con DIG son útiles para proporcionar información sobre la localización de proteínas y la expresión de un gen.
Los embriones de montaje entero no pueden revelar la relación espacial entre los genes debido a la baja resolución óptica, a pesar de que los embriones de pez cebra son pequeños y transparentes10. Por lo tanto, la sección es necesaria para analizar los patrones de expresión de los genes a nivel intracelular. La criosección ha sido ampliamente utilizada en el pez cebra, ya que es fácil de realizar y puede preservar eficazmente el antígeno. Por lo tanto, la hibridación in situ combinada con inmunohistoquímica en criosecciones de pez cebra ofrece una forma poderosa de analizar los patrones de expresión de dos genes. Se ha aplicado una combinación de hibridación in situ e inmunohistoquímica al pez cebra11. Sin embargo, el tratamiento con proteinasa K se utilizó para mejorar la penetración de la sonda a expensas de la integridad del antígeno. Para superar esta limitación, este protocolo utiliza el calentamiento para inducir la recuperación de antígenos. Este protocolo no solo es aplicable a embriones de diferentes estadios y secciones de tejido de diversos grosores (secciones de cabeza de 14 μm y secciones de médula espinal de 20 μm), sino que también se ha verificado mediante el uso de genes expresados en dos órganos, incluyendo la cabeza y la médula espinal.
Este artículo describirá cómo combinar la hibridación in situ y la tinción de anticuerpos en embriones de pez cebra en criosecciones. La versatilidad de este protocolo se demuestra mediante el uso de una serie de combinaciones de hibridación-inmunohistoquímica in situ, incluidas las sondas de hibridación in situ para dos neuronas diferentes. Este método es adecuado para detectar ARNm y proteínas en diferentes regiones y embriones de diferentes edades, así como los patrones de expresión de dos genes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin AP Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM purple</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate buffer</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>IH0305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm</td>
			<td>Head Biotechnology</td>
			<td>H4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated Water</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B501005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera, fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NI-SSR 931479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 embryo medium</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>542858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYB</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>preHYB plus 50 &#181;g/mL heparin sodium salt, 100 &#181;g/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical wet box</td>
			<td>Mkbio</td>
			<td>MH10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile leica blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>116481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>M859248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTMT</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ADI-950-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4%</td>
			<td>Abbexa</td>
			<td>abx082483</td>
			<td>made in lab in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1x PBS plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylthiourea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103-85-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (10x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>preHYB</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1092766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R3629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5 mL tubes</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.2x SSC plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1x SSC plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish</td>
			<td>Laboratory Animal Center of Nantong University</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization combined with immunohistochemistry in cryosectioned zebrafish embryos

Como vertebrado, el pez cebra ha sido ampliamente utilizado en estudios biológicos. El pez cebra y los humanos comparten una alta homología genética, lo que permite su uso como modelo para enfermedades humanas. El estudio de la función génica se basa en la detección de patrones de expresión génica. Aunque la inmunohistoquímica ofrece una forma poderosa de evaluar la expresión de proteínas, el número limitado de anticuerpos disponibles comercialmente en el pez cebra restringe la aplicación de costaining. La hibridación in situ es ampliamente utilizada en embriones de pez cebra para detectar la expresión de ARNm. Este protocolo describe cómo obtener imágenes combinando hibridación in situ e inmunohistoquímica para secciones de embriones de pez cebra. La hibridación in situ se realizó antes de la criosección, seguida de tinción de anticuerpos. La inmunohistoquímica y la imagen de una sola criosección se realizaron después de la hibridación in situ . El protocolo es útil para desentrañar el patrón de expresión de dos genes, primero mediante la detección de transcripción in situ y luego mediante inmunohistoquímica contra una proteína en la misma sección.

Este protocolo se puede utilizar para examinar simultáneamente el patrón de expresión de un ARNm y una proteína. La figura 1 muestra el flujo de trabajo experimental. El receptor 5-HT2C es un subtipo del receptor 5-HT unido por el neurotransmisor serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT). Está ampliamente distribuida en el sistema nervioso central (SNC) y puede regular significativamente una variedad de funciones cerebrales, incluyendo el apetito, el estado de ánimo, la ansiedad y el comp...

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In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

Este protocolo describe cómo obtener imágenes combinando hibridación in situ e inmunohistoquímica de secciones embrionarias de pez cebra. La hibridación in situ se realizó antes de la criosección, seguida de tinción de anticuerpos. Es útil detectar los patrones de expresión de dos genes en el pez cebra si hay escasez de anticuerpos.

In situ Hibridación combinada con inmunohistoquímica en embriones crioseccionados de pez cebra

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

Este protocolo utiliza una combinación de hibridación in situ e inmunohistoquímica, y sirve como una forma fácil y eficiente de analizar simultáneamente un ARNm y una proteína. Este protocolo es aplicable a embriones en diferentes etapas, secciones de tejido de varios grosores y diferentes órganos. Para comenzar, fije aproximadamente 10 embriones con 0.5 a 1 mililitro de paraformaldehído fresco al 4% en un tubo de microfuga de 1.5 mililitros a cuatro grados centígrados durante la noche durante 12 a 14 horas.Deshidrate gradualmente los embriones lavando con 25, 50 y 75% de metanol en PBST sucesivamente durante cinco minutos cada uno a temperatura ambiente. Luego, lave los embriones en 100% metanol durante cinco minutos a temperatura ambiente. Incubar los embriones en 100% de metanol a menos 20 grados centígrados durante al menos toda la noche, durante 12 a 14 horas.Rehidrate gradualmente los embriones lavándolos con 75, 50 y 25% de metanol en PBST sucesivamente durante cinco minutos cada uno a temperatura ambiente. Una vez más, lave el embrión tres veces con PBST durante cinco minutos cada uno a temperatura ambiente. Digiera los embriones con 10 microgramos por mililitro de proteinasa K en PBST a temperatura ambiente, y lave los embriones tres veces con PBST durante cinco minutos.Luego, vuelva a fijar los embriones lavados en paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Una vez más, lave el embrión tres veces con PBST mientras incuba durante cinco minutos durante cada lavado. Para la hibridación previa de los embriones, incubarlos en una solución de prehibridación a 65 grados centígrados durante cinco minutos.Luego, reemplace la solución de prehibridación con la solución de hibridación y prehibridar durante al menos cuatro horas. Caliente la sonda en la solución de hibridación durante cinco minutos a 95 grados centígrados antes de agregarla a los embriones. Retire la mayor cantidad posible de solución de prehibridación sin dejar que los embriones entren en contacto con el aire.Al tubo que contiene los embriones, agregue una sonda precalentada en la solución de hibridación y permita que la sonda hibrida durante la noche durante 12 a 14 horas a 50 a 70 grados centígrados. Al día siguiente, aspire la solución de la sonda con una pipeta y guárdela en un tubo a menos 20 grados centígrados para que pueda reutilizarse muchas veces. Lave los embriones con solución de hibridación al 100% seguida de lavado secuencial con solución de hibridación al 75, 50% y 25% en el doble de la concentración de SSCT durante 15 minutos a 65 grados centígrados.Luego, lave los embriones dos veces y 0.2 veces la concentración de SSCT durante 15 minutos a 65 grados centígrados. Lave los embriones dos veces durante 10 minutos en MABT a temperatura ambiente. Bloquear los embriones hibridados y lavados durante al menos dos horas a temperatura ambiente, con solución bloqueante al 2%-1.Reemplace la solución de bloqueo-1 con fosfatasa alcalina antidigoxigenina en una solución fresca de bloqueo al 2%-1 y agite durante la noche durante 12 a 14 horas a cuatro grados centígrados. Luego, lave los embriones cuatro veces en MABT durante 30 minutos a temperatura ambiente. Una vez más, lave los embriones dos veces en NTMT y retire la mayor cantidad posible de NTMT de los embriones con una pipeta.Reemplace con sustrato de fosfatasa alcalina púrpura BM y tiñe los embriones a temperatura ambiente en la oscuridad. Una vez que se haya desarrollado la mancha, detenga la reacción enjuagando brevemente dos veces con NTMT. Después de la hibridación in situ, enjuague los embriones con PBST tres veces durante 20 minutos.Sumerja los embriones en sacarosa al 5% en PBS durante la noche durante 12 a 14 horas a cuatro grados centígrados. Luego, cambie la solución que cubre los embriones a 15% de sacarosa en PBS e incube durante la noche durante 12 a 16 horas a cuatro grados centígrados. Nuevamente, cambie la solución que cubre los embriones a 30% de sacarosa en PBS e incube durante uno o dos días a cuatro grados centígrados.Transfiera los embriones a un nuevo criomold para tejido y llénelo suavemente con un medio de temperatura de corte óptimo evitando la formación de burbujas. A continuación, corte las muestras en secciones de 12 a 20 micrómetros de espesor con un criostato y transfiera rápidamente las secciones a portaobjetos de vidrio. Permita que las muestras alcancen la temperatura ambiente y guarde las secciones en una caja portaobjetos sellada a menos 80 grados centígrados para su uso posterior.Lave las diapositivas que contienen las secciones con PBS durante cinco minutos. Luego, coloque los portaobjetos en el tampón y caliente la solución durante aproximadamente 20 minutos para mantenerla cerca de la temperatura de ebullición. Drene el exceso de solución y seque cuidadosamente el área alrededor de cada sección con un trozo de tejido.Luego, dibuje un círculo alrededor de la sección con una pluma repelente al agua para formar una barrera hidrófoba y bloquee la sección durante dos horas bloqueando la solución-2 a temperatura ambiente. Pipetear la solución de anticuerpos primarios por portaobjetos e incubar los portaobjetos en una caja húmeda inmunohistoquímica a cuatro grados centígrados durante la noche. Lave los portaobjetos tres veces con PBS mientras incuba durante 10 minutos durante cada lavado, y drene el exceso de PBS.Luego, incubar los portaobjetos con el anticuerpo secundario apropiado durante una hora a temperatura ambiente en PBS. Nuevamente, lave las diapositivas tres veces con PBS mientras incuba durante 10 minutos durante cada lavado y drene el exceso de PBS. Posteriormente, pipete el medio de montaje en la corredera y móntelo con un cubreobjetos deslizante.La expresión del receptor 5-HT2C en el sistema nervioso central se detectó en la línea transgénica foxP2 egfp-caax. La expresión simultánea de 5-HT2C se observó en la línea transgénica junto con las neuronas foxP2, que fueron marcadas por la proteína fluorescente verde fluoresceína. La expresión de insm1a, un factor de transcripción de dedos de zinc en la médula espinal y las neuronas motoras del pez cebra, se detectó en la línea transgénica.La expresión simultánea de insm1a se observó en la línea transgénica junto con las neuronas hb9, que fueron marcadas por la proteína fluorescente verde fluoresceína. El pez cebra debe fijarse con paraformaldehído recién preparado.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Doble fluorescencia In situ La hibridación en las secciones del cerebro fresco

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Investigación

Neurociencias

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

La combinación de colorantes lipofílicos, In situ</emHibridación>, inmunohistoquímica y la histología

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Detección del genoma y transcripciones de un virus ADN persistente en los tejidos neuronales por Fluorescente In situ La hibridación Combinado con inmunotinción

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lesiones de la Médula Espinal completo y Protocolo Disección del cerebro por Wholemount posterior<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en larvas lamprea de mar

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Primer para inmunohistoquímica en el tejido cryosectioned cerebro de rata: Ejemplo de tinción de microglía y neuronas

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

La detección de ARNm axón localizado en las secciones cerebrales Uso de alta resolución<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rápido<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación usando sondas de oligonucleótidos en Cerebro paraformaldehído-prefijo de ratas con síndrome de serotonina

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Utilizando metodologías combinadas para definir el papel de la membrana plasmática de entrega Durante Axon ramas y morfogénesis neuronal

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

La combinación de doble fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación con Immunolabelling para la detección de la expresión de tres genes en las secciones de cerebro de ratón

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localización de Genes Receptor Odorante en Antenas Locustinas por RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridación

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...