Name: in situ hybridization combined with immunohistochemistry in cryosectioned zebrafish embryos
Uploaded: 2022-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) och Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).

Alla djurprotokoll godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Nantong University (nr S20191210-402).
1. Insamling av zebrafiskembryon
<ol><li>Sätt upp ett par zebrafiskar i avelstankar kvällen innan äggen ska samlas in, den ena en transgen zebrafisk och den andra en AB vildtyp zebrafisk (Tg (foxP2: egfp-caax) X AB vildtyp eller Tg (hb9: egfp) X AB vildtyp) (se materialtabellen). Använd en diagonal pl...

<ol>
	<li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li><li>Chen, E., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+genomics+research+model.">Zebrafish as a genomics research model.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).</li><li>Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: <a target="_blank" href="https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it">https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it</a> (2018)</li><li>Akam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+location+of+ultrabithorax+transcripts+in+Drosophila+tissue+sections.">The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections.</a> EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).</li><li>Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+in+situ+hybridization+method+for+the+detection+of+cellular+RNAs+in+Drosophila+tissue+sections+and+its+application+for+localizing+transcripts+of+the+homeotic+Antennapedia+gene+complex.">An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex.</a> EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).</li><li>Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryos+and+young+larvae.">In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).</li><li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification.">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li><li>Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+genetic+tools+for+studying+vertebrate+development.">Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development.</a> Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).</li><li>Cunningham, R. L., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry+for+zebrafish+larvae.">Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+5-HT(2C)+receptors+regulate+anxiety-like+behavior.">Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior.</a> Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).</li><li>Ferguson, J. L., Shive, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+immunofluorescence+and+immunohistochemistry+on+cryosectioned+zebrafish+embryos.">Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).</li><li>Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunohistochemistry+in+zebrafish+embryos+and+larvae.">Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).</li><li>Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+whole-mount+immunohistochemistry+of+zebrafish+(Danio+rerio)+embryos+and+larvae+protocol.">General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).</li><li>O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Garbage+in,+garbage+out:+a+critical+evaluation+of+strategies+used+for+validation+of+immunohistochemical+biomarkers.">Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers.</a> Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).</li></ol>

Detta protokoll föreslår en kombination av in situ-hybridisering och immunhistokemi, ett viktigt steg i samlokaliseringsexperimenten på zebrafiskembryon. Denna metod fungerar som ett enkelt och effektivt sätt att samtidigt analysera ett mRNA och ett protein. In situ-hybridisering och antikroppsfärgning utfördes på zebrafiskembryon. I motsats till flera protokoll publicerade tidigare14,15,16 användes imm...

Zebrafisken är en kraftfull ryggradsdjurmodell för studier av utveckling och genetik 1,2. Zebrafisk och människor delar hög genetisk homologi (70% av generna delas med det mänskliga genomet), vilket möjliggör användning som modell för mänskliga sjukdomar3. I zebrafisk är det ganska vanligt att upptäcka uttrycksmönstren för två gener och deras rumsliga förhållande. Immunohistokemi användes först 1941 för att detektera patogener i infekterade vävnader genom att applicera FITC-märkta antikroppar4. Målproteinet i vävnadssektionen märks först med en primär antikropp, och sektionen märks sedan med en sekundär antikropp mot den primära antikroppens värdart immunglobulin. Antikroppsfärgning är ett robust tillvägagångssätt för att detektera lokalisering av proteiner, vilket ger hög optisk upplösning på intracellulär nivå. Antalet tillgängliga antikroppar är dock mycket begränsat hos zebrafiskar. En nyligen genomförd studie visar att cirka 112 000 antikroppar är kommersiellt tillgängliga för möss; Mycket få antikroppar har dock visat sig vara tillförlitliga i zebrafisk5.
Istället har in situ-hybridisering i zebrafisk använts i stor utsträckning för analys av genuttrycksmönster. Denna metod användes först för att bedöma genuttryck i Drosophila-embryon på 1980-talet6,7, och sedan dess har denna teknik kontinuerligt utvecklats och förbättrats. Ursprungligen användes radiomärkta DNA-sonder för att detektera mRNA-transkript; Den rumsliga upplösningen var dock relativt låg och det fanns potentiella hälsorisker orsakade av radioaktiviteten. Därefter förlitar sig in situ-hybridisering på RNA-sonderna märkta med digoxigenin (DIG) eller fluorescein (Fluo), vilka är konjugerade till alkaliskt fosfatas (AP) eller detekteras genom fluorescerande tyramidsignalförstärkning (TSA)8,9. Även om TSA har använts för att detektera två eller tre gener, är DIG-märkning av RNA-sonder och antiDIG AP-konjugerade antikroppar fortfarande mycket känsliga, stabila och allmänt använda metoder för in situ-hybridisering. Därför är kommersialiserade antikroppar i kombination med DIG-märkta in situ-sonder användbara för att ge insikt i proteinlokalisering och uttryck av en gen.
Helmonterade embryon kan inte avslöja det rumsliga förhållandet mellan gener på grund av den låga optiska upplösningen, även om zebrafiskembryon är små och transparenta10. Därför är sektionering nödvändig för att analysera uttrycksmönster av gener på intracellulär nivå. Kryosektion har använts i stor utsträckning i zebrafisk eftersom det är lätt att utföra och effektivt kan bevara antigenet. Därför erbjuder in situ-hybridisering i kombination med immunhistokemi i zebrafiskkryosektioner ett kraftfullt sätt att analysera uttrycksmönstren för två gener. En kombination av in situ-hybridisering och immunhistokemi har applicerats på zebrafisk11. Proteinas K-behandling användes emellertid för att förbättra sondpenetrationen på bekostnad av antigenintegriteten. För att övervinna denna begränsning använder detta protokoll uppvärmning för att inducera antigenhämtning. Detta protokoll är inte bara tillämpligt på embryon i olika stadier och vävnadssektioner av olika tjocklek (14 μm huvudsektioner och 20 μm ryggmärgssektioner), men det har också verifierats genom att använda gener uttryckta i två organ, inklusive huvudet och ryggmärgen.
Denna artikel kommer att beskriva hur man kombinerar in situ hybridisering och antikroppsfärgning i zebrafiskembryon i kryosektioner. Mångsidigheten hos detta protokoll demonstreras genom att använda ett antal in situ hybridisering-immunhistokemiska kombinationer, inklusive in situ-hybridiseringsprober för två olika neuroner. Denna metod är lämplig för detektion av mRNA och protein i olika regioner och embryon av olika åldrar, liksom uttrycksmönstren för två gener.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin AP Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM purple</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate buffer</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>IH0305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm</td>
			<td>Head Biotechnology</td>
			<td>H4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated Water</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B501005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera, fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NI-SSR 931479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 embryo medium</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>542858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYB</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>preHYB plus 50 &#181;g/mL heparin sodium salt, 100 &#181;g/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical wet box</td>
			<td>Mkbio</td>
			<td>MH10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile leica blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>116481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>M859248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTMT</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ADI-950-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4%</td>
			<td>Abbexa</td>
			<td>abx082483</td>
			<td>made in lab in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1x PBS plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylthiourea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103-85-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (10x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>preHYB</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1092766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R3629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5 mL tubes</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.2x SSC plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (1x)</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1x SSC plus 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish</td>
			<td>Laboratory Animal Center of Nantong University</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization combined with immunohistochemistry in cryosectioned zebrafish embryos

Som ryggradsdjur har zebrafisken använts i stor utsträckning i biologiska studier. Zebrafisk och människor delar hög genetisk homologi, vilket möjliggör användning som modell för mänskliga sjukdomar. Genfunktionsstudien baseras på detektion av genuttrycksmönster. Även om immunhistokemi erbjuder ett kraftfullt sätt att analysera proteinuttryck, begränsar det begränsade antalet kommersiellt tillgängliga antikroppar i zebrafisk tillämpningen av costaining. In situ-hybridisering används ofta i zebrafiskembryon för att detektera mRNA-uttryck. Detta protokoll beskriver hur man får bilder genom att kombinera in situ hybridisering och immunhistokemi för zebrafiskembryosektioner. In situ-hybridisering utfördes före kryosektion, följt av antikroppsfärgning. Immunhistokemi och avbildning av en enda kryosektion utfördes efter in situ-hybridisering. Protokollet är till hjälp för att reda ut uttrycksmönstret för två gener, först genom in situ-transkriptdetektion och sedan genom immunhistokemi mot ett protein i samma sektion.

Detta protokoll kan användas för att samtidigt undersöka uttrycksmönstret för ett mRNA och ett protein. Bild 1 visar det experimentella arbetsflödet. 5-HT2C-receptorn är en subtyp av 5-HT-receptorn bunden av neurotransmittorn serotonin (5-hydroxytryptamin, 5-HT). Det distribueras i stor utsträckning i centrala nervsystemet (CNS) och kan avsevärt reglera en mängd olika hjärnfunktioner, inklusive aptit, humör, ångest och reproduktivt beteende13. Uttrycket a...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos at JoVE.com

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

Detta protokoll beskriver hur man får bilder genom att kombinera in situ hybridisering och immunhistokemi av zebrafisk embryonala sektioner. In situ-hybridisering utfördes före kryosektion, följt av antikroppsfärgning. Det är användbart att detektera uttrycksmönstren för två gener i zebrafisk om det finns en brist på antikroppar.

In situ Hybridisering kombinerad med immunhistokemi i kryosektionerade zebrafiskembryon

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

Detta protokoll använder en kombination av in situ-hybridisering och immunhistokemi, och det fungerar som ett enkelt och effektivt sätt att samtidigt analysera ett mRNA och ett protein. Detta protokoll är tillämpligt på embryon i olika stadier, vävnadssektioner av olika tjocklek och olika organ. För att börja, fixa cirka 10 embryon med 0,5 till 1 ml färsk 4% paraformaldehyd i ett 1,5 ml mikrofugerör vid fyra grader Celsius över natten i 12 till 14 timmar.Dehydrera embryona gradvis genom att tvätta med 25, 50 och 75% metanol i PBST successivt i fem minuter vardera vid rumstemperatur. Tvätta sedan embryon i 100% metanol i fem minuter vid rumstemperatur. Inkubera embryona i 100% metanol vid minus 20 grader Celsius i minst över natten, i 12 till 14 timmar.Rehydrera embryona gradvis genom att tvätta med 75, 50 och 25% metanol i PBST successivt i fem minuter vardera vid rumstemperatur. Återigen, tvätta embryot tre gånger med PBST i fem minuter vardera vid rumstemperatur. Smält embryona med 10 mikrogram per milliliter proteinas K i PBST vid rumstemperatur och tvätta embryona tre gånger med PBST i fem minuter.Fixa sedan de tvättade embryona i 4% paraformaldehyd i 15 minuter vid rumstemperatur. Tvätta embryot tre gånger med PBST medan du inkuberar i fem minuter under varje tvätt. För prehybridisering av embryon, inkubera dem i prehybridiseringslösning vid 65 grader Celsius i fem minuter.Byt sedan ut förhybridiseringslösningen med hybridiseringslösningen och förhybridisera i minst fyra timmar. Värm sonden i hybridiseringslösningen i fem minuter vid 95 grader Celsius innan du lägger till embryonerna. Ta bort så mycket förhybridiseringslösning som möjligt utan att låta embryon komma i kontakt med luften.Till röret som innehåller embryon, tillsätt förvärmd sond i hybridiseringslösningen och låt sonden hybridisera över natten i 12 till 14 timmar vid 50 till 70 grader Celsius. Nästa dag, aspirera sondlösningen med en pipett och förvara den i ett rör vid minus 20 grader Celsius så att den kan återanvändas många gånger. Tvätta embryona med 100% hybridiseringslösning följt av sekventiell tvättning med 75, 50 och 25% hybridiseringslösning i två gånger koncentrationen av SSCT i 15 minuter vid 65 grader Celsius.Tvätta sedan embryona två gånger och 0,2 gånger koncentrationen av SSCT i 15 minuter vid 65 grader Celsius. Tvätta embryona två gånger i 10 minuter i MABT vid rumstemperatur. Blockera de hybridiserade och tvättade embryona i minst två timmar vid rumstemperatur, med 2% blockerande lösning-1.Byt ut blockeringslösningen-1 med antidigoxigenin alkaliskt fosfatas i en ny 2% blockerande lösning-1 och skaka över natten i 12 till 14 timmar vid fyra grader Celsius. Tvätta sedan embryona fyra gånger i MABT i 30 minuter vid rumstemperatur. Återigen, tvätta embryon två gånger i NTMT och ta bort så mycket NTMT som möjligt från embryon med en pipett.Byt ut med BM lila alkaliskt fosfatassubstrat och färga embryon vid rumstemperatur i mörkret. När fläcken har utvecklats, stoppa reaktionen genom att skölja kort två gånger med NTMT. Efter in situ-hybridisering, skölj embryona med PBST tre gånger i 20 minuter.Sänk ner embryona i 5% sackaros i PBS över natten i 12 till 14 timmar vid fyra grader Celsius. Byt sedan lösningen som täcker embryona till 15% sackaros i PBS och inkubera över natten i 12 till 16 timmar vid fyra grader Celsius. Återigen, byt lösningen som täcker embryon till 30% sackaros i PBS och inkubera i en till två dagar vid fyra grader Celsius.Överför embryona till en ny kryomol för vävnad och fyll den försiktigt med optimalt skärtemperaturmedium samtidigt som man undviker bildning av bubblor. Skär sedan proverna i 12 till 20 mikrometer tjocka sektioner med en kryostat och överför snabbt sektionerna till glasskivor. Låt proverna nå rumstemperatur och förvara sektionerna i en förseglad bildlåda vid minus 80 grader Celsius för efterföljande användning.Tvätta bilderna som innehåller sektionerna med PBS i fem minuter. Placera sedan objektglasen i bufferten och värm lösningen i cirka 20 minuter för att hålla den nära koktemperaturen. Töm överskottslösningen och torka försiktigt området runt varje sektion med en bit vävnad.Dra sedan en cirkel runt sektionen med en vattenavvisande penna för att bilda en hydrofob barriär och blockera sektionen i två timmar för att blockera lösning-2 vid rumstemperatur. Pipettera primär antikroppslösning per objektglas och inkubera objektglasen i en immunhistokemisk våtlåda vid fyra grader Celsius över natten. Tvätta glasen tre gånger med PBS medan du inkuberar i 10 minuter under varje tvätt och töm överflödigt PBS.Inkubera sedan objektglasen med lämplig sekundär antikropp i en timme vid rumstemperatur i PBS. Tvätta glasen tre gånger med PBS medan du inkuberar i 10 minuter under varje tvätt och töm överflödigt PBS. Därefter pipetterar du monteringsmediet på bilden och monterar med ett glidskydd.Uttrycket av 5-HT2C-receptorn i centrala nervsystemet detekterades i den transgena foxP2 egfp-caax-linjen. Det samtidiga uttrycket av 5-HT2C observerades i den transgena linjen tillsammans med foxP2-neuroner, vilka märktes av fluoresceingrönt fluorescerande protein. Uttrycket av insm1a, en zinkfingertranskriptionsfaktor i zebrafiskens ryggmärg och motorneuroner, detekterades i den transgena linjen.Det samtidiga uttrycket av insm1a observerades i den transgena linjen tillsammans med hb9-neuroner, vilka märktes av fluoresceingrönt fluorescerande protein. Zebrafisk måste fixeras med nyberedd paraformaldehyd.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Dubbel Fluorescens På plats Hybridisering i Fresh Brain § §

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Kombinera lipofila färgämne, På plats Hybridisering, immunohistokemi, och histologi

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Upptäckt av arvsmassan och Avskrifter av en beständig DNA-virus i neuronala vävnader från lysrör In situ Hybridisering Kombinerat med immunfärgning

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Komplett ryggmärgsskada och Brain Dissection protokoll för Efterföljande Wholemount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i Larvernas havsnejonöga

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Primer för Immunohistokemi på Cryosectioned råtthjärna Vävnad: Exempel färgning för Mikroglia och Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Upptäckt av Axonally Lokaliserad mRNA i hjärnan sektioner Använda hög upplösning<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Snabb<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering med användning av oligonukleotidsonder på Paraformaldehyd-prefixet Brain av råttor med serotonergt syndrom

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Med hjälp av kombinerade Metoder för att definiera rollen av plasmamembranet leverans under Axon förgrening och Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Kombinera Double Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering med inmärkning för detektion av uttryck av tre gener i mus hjärnsektioner

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Lokalisering av luktantreceptormener i lokalisationsantennen genom RNA<em&gt; I situ</em&gt; Hybridisering

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...