Name: small-scale extraction of caenorhabditis elegans genomic dna
Uploaded: 2022-06-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA at JoVE.com

تم الحصول على سلالة N2 وبكتيريا E. coli OP50 من مركز Caenorhabditis Genetics Center (CGC) ، الذي يموله مكتب برامج البنية التحتية البحثية التابع للمعاهد الوطنية للصحة (P40 OD010440). تم الحصول على سلالة blmp-1 (tm548) من المشروع الوطني للموارد الحيوية ، اليابان. يشكر المؤلفون WormBase. تم دعم هذا العمل من قبل NIH R01GM097591 إلى T.L.G. ، والتمويل الداخلي من جامعة تكساس للمرأة إلى T.L.G ، ومركز TWU لأبحاث الطلاب إلى M.F.L.

1. C. صيانة elegans
ملاحظة: تم الحفاظ على سلالات N2 (النوع البري) و blmp-1 (tm548) C. elegans على لوحات وسائط نمو الديدان الخيطية القياسية (NGM) عند 20 درجة مئوية.
<ol><li>تحضير لوحات NGM عن طريق إذابة 23.005 غرام من مسحوق NGM في 973 مل من الماء في قارورة 2 لتر. قم بتغطية فتحة القارورة بورق ا...

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+window+into+biology:+A+on+Caenorhabditis+elegans.">A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+mapping+system+in+Caenorhabditis+elegans+based+on+polymorphic+sequence-tagged+sites.">A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites.</a> Genetics. 131, 609-624 (1992).</li><li>Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Caenorhabditis+elegans+genomic+DNA+and+detection+of+deletions+in+the+unc-93+gene+using+PCR.">Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).</li><li>Fay, D., Bender, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNPs:+introduction+and+two-point+mapping.">SNPs: introduction and two-point mapping.</a> WormBook. , 1-10 (2008).</li><li>Biron, D., Haspel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans: Methods and Applications. , (2015).</li><li>. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin Available from: <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf</a> (2013)</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).</li><li>Gumienny, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+SMA-10/LRIG+is+a+conserved+transmembrane+protein+that+enhances+bone+morphogenetic+protein+signaling.">Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling.</a> PLoS Genetics. 6, 1000963 (2010).</li><li>Nelson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bow-tie+genetic+architecture+for+morphogenesis+suggested+by+a+genome-wide+RNAi+screen+in+Caenorhabditis+elegans.">A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).</li><li>Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLMP-1+contributes+to+collagen-related+morphogenesis+in+C.+elegans.">BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans.</a> Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).</li><li>Horn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRE-1/FBXO11-dependent+degradation+of+BLMP-1/BLIMP-1+governs+C.+elegans+developmental+timing+and+maturation.">DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation.</a> Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).</li><li>Huang, T. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLMP-1/Blimp-1+regulates+the+spatiotemporal+cell+migration+pattern+in+C.+elegans.">BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).</li><li>Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+interactions+between+the+DBL-1/BMP-like+pathway+and+dpy+body+size-associated+genes+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).</li><li>Madeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EMBL-EBI+search+and+sequence+analysis+tools+APIs+in+2019.">The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019.</a> Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).</li></ol>

يعد تحديد الأنماط الجينية ل C. elegans خطوة مهمة أثناء إجراء الصلبان الجينية لإنشاء سلالات C. elegans جديدة. يعد استخراج الحمض النووي الجيني باستخدام واحد أو عدد قليل من C. elegans خطوة حاسمة في التنميط الجيني C. elegans. يصف هذا البروتوكول استخراج الحمض النووي الجيني من C. elegans باست?...

هنا ، يتم تقديم بروتوكولين مرتبطين بتحلل Caenorhabditis elegans لجعل الحمض النووي متاحا للتطبيقات القائمة على PCR. PCR هي تقنية جزيئية شائعة الاستخدام تستخدم للعديد من التطبيقات ، بما في ذلك التنميط الجيني وتضخيم شظايا الحمض النووي للاستنساخ والتسلسل ، من بين أمور أخرى. الدودة المستديرة الصغيرة (1 مم) التي تعيش بحرية C. elegans هي نظام حيواني شائع للبحوث البيولوجية. الحصول على الحمض النووي الجينومي المناسب من واحد أو عدد قليل من الحيوانات يكفي لتضخيم التسلسل بواسطة PCR. تحتوي يرقات L4 المتأخرة والبالغين على حوالي 1000 خلية جسدية فقط (بما في ذلك بعض الخلايا متعددة النواة ومتعددة الصبغيات) ، والخلايا الجرثومية ، و (إذا كان الحيوان خنثى محبوذا) ذرية في الرحم1. ومع ذلك ، فإن هذه الحيوانات محمية بواسطة بشرة يجب تعطيلها لاستخراج الحمض النووي الجينومي2. تتضمن الطرق القياسية لإعداد قالب الحمض النووي الجيني الخيطي ل PCR خطوات متعددة وتستغرق عدة ساعات. يتم تجميد الحيوانات أولا في مخزن تحلل الدودة الذي يحتوي على بروتين K (-70 درجة مئوية أو أقل) لمدة 15-45 دقيقة على الأقل (يوصى ببعض البروتوكولات بفترة أطول) 3،4،5،6. هذه الخطوة الشقوق فتح الحيوانات.
بعد التجميد ، يتم تحضين الحيوانات لمدة 1 ساعة عند 60-65 درجة مئوية حتى يعمل البروتين K ، ثم يتم تعطيل الإنزيم لمدة 15-30 دقيقة عند 95 درجة مئوية. البروتيناز K يدمر النوكليز الذي يتحلل الحمض النووي. يعد تعطيل البروتين K قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل أمرا مهما لمنع البروتين K من تدهور بوليميراز الحمض النووي. البروتوكولان القائمان على المجموعة الموصوفان هنا هما طريقتان سريعتان وموثوقتان وفعالتان من حيث التكلفة لاستخراج الحمض النووي الجيني من واحد أو عدد قليل من الديدان الخيطية للبحث اليومي وتدريس التطبيقات المختبرية. تم تحسين المجموعة المستخدمة في الأصل من قبل الشركة المصنعة لاستخراج الحمض النووي من الأنسجة الحيوانية واللعاب والشعر7. ويستخدم حل إعداد الأنسجة الملكية وحل استخراج لتحليل الخلايا وجعل الحمض النووي الجينومي في متناول اليد. ثم يقوم حل تحييد الملكية بتحييد المكونات التي قد تمنع تفاعل البوليميراز المتسلسل (على سبيل المثال ، الأملاح والأيونات والجزيئات المرتبطة ب Mg2+).
عند التنميط الجيني ، يمكن اختبار واحد. عند تحديد ما إذا كانت السلالة متماثلة الزيجوت ، فإن اختبار ستة أو أكثر من النسل من واحد يعطي ثقة عالية بأن الخط متماثل الزيجوت أم لا (هناك فرصة بنسبة 0.02٪ لاختيار ستة ذرية متحولة متماثلة الزيجوت عشوائيا من أحد الوالدين غير المتجانسين [(1/4)6 × 100٪ = 0.02٪]). هذه الطريقة 1) مباشرة ، مع خطوات أقل من طريقة proteinase K ، و 2) تقلل من وقت إعداد القالب إلى 15 دقيقة. تظهر النتائج في هذا العمل أن البروتوكول المطور يعمل بقوة في استخراج الحمض النووي الجيني من ديدان مفردة أو قليلة ، والتي يمكن استخدامها بشكل موثوق في التطبيقات النهائية التي لا تتطلب الحمض النووي عالي النقاء ، بما في ذلك PCR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>autoclave tape</td>
			<td>Defend</td>
			<td>43237-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aluminium foil, heavy duty</td>
			<td>Reynolds Wrap</td>
			<td>2182934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>102382 (CAS 10035-04-8)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>XNAT2-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp hotplate/stirrer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-100-495H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media, Lennox, capsules</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>3002-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC413485000 (CAS 7487-88-9)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>Labnet International, Inc.</td>
			<td>PrismR, C2500-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>M0515S</td>
			<td>&#34;Pol E&#34; used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20&#8211;30 s/kb)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM media powder</td>
			<td>US Biological Life Sciences</td>
			<td>N1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>&#34;Pol D&#34; in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15&#8211;30 s/kb)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom DNA oligos</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL polymerase</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>R050B</td>
			<td>&#34;Pol C&#34; in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1&#8211;10.0 kb)</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>N0550S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SapphireAmp Fast PCR Master Mix</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR350A</td>
			<td>&#34;Pol A&#34; in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>P4600</td>
			<td>&#34;Pol B&#34; in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A24812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>worm pick</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale extraction of caenorhabditis elegans genomic dna

استخراج الحمض النووي الجينومي من واحد أو عدد قليل من Caenorhabditis elegans له العديد من التطبيقات النهائية ، بما في ذلك PCR لخطوط التنميط الجيني والاستنساخ والتسلسل. تستغرق الطرق التقليدية القائمة على البروتين K لاستخراج الحمض النووي الجيني من C. elegans عدة ساعات. مجموعات الاستخراج التجارية التي تكسر بشكل فعال بشرة C. elegans واستخراج الحمض النووي الجينومي محدودة. يتم الإبلاغ هنا عن طريقة سهلة وأسرع (~ 15 دقيقة) وفعالة من حيث التكلفة لاستخراج الحمض النووي الجينومي C. elegans الذي يعمل بشكل جيد لتطبيقات الفصول الدراسية والبحوث. تم تحسين طريقة استخراج الحمض النووي هذه لاستخدام اليرقات المتأخرة (L4) أو الديدان الخيطية البالغة كمادة أولية للحصول على قالب موثوق به لأداء PCR. تشير النتائج إلى أن جودة الحمض النووي مناسبة لتضخيم الأهداف الجينية ذات الأحجام المختلفة بواسطة PCR ، مما يسمح بالتنميط الجيني لحيوان واحد أو عدد قليل حتى عند التخفيف إلى واحد من خمسين من الحمض النووي الجيني من شخص بالغ واحد لكل تفاعل. يمكن استخدام البروتوكولات المبلغ عنها بشكل موثوق لإنتاج قالب الحمض النووي بسرعة من عينة واحدة أو صغيرة من C. elegans للتطبيقات القائمة على PCR.

تم استخراج الحمض النووي الجيني من شخص واحد أو عدد قليل من البالغين من النوع البري باستخدام المجموعة التجارية أو بروتوكول التحلل التقليدي لمقارنة فعالية هاتين الطريقتين. ثم تم استخدام هذه الليزات كقوالب ل PCR لتضخيم إما هدف أكبر من ~ 2,100 bp (ترميز blmp-1) أو هدف أصغر من ~ 500 bp (ترميز جزء من sma-1...

Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA at JoVE.com

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

يظهر هنا وصف للعزل المباشر والسريع نسبيا للحمض النووي الجينومي Caenorhabditis elegans من واحد أو عدد قليل من الحيوانات باستخدام مجموعة أنسجة متاحة تجاريا. إعداد gDNA الناتج هو قالب مناسب ل PCR.

استخراج على نطاق صغير من Caenorhabditis elegans الحمض النووي الجينومي

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...

لقد طورنا طريقة سهلة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة لاستخراج الحمض النووي الجينومي C.elegans الذي يعمل بشكل رائع لتطبيقات الفصول الدراسية والبحوث. يمكن استخدام هذه البروتوكولات بشكل موثوق لإنتاج قوالب الحمض النووي بسرعة من عينة واحدة أو صغيرة من C.elegance للتطبيقات القائمة على PCR. قد يكافح المستخدمون الذين ليس لديهم خبرة في اختيار الديدان أو استخدام جهاز الماصة الدقيقة مع الخطوات التي تتطلب هذه المهارات.قد تساعد مشاهدة ممارس ماهر وممارسة. سيوضح الإجراء فرحان لاكداوالا ، وهو طالب دراسات عليا من مختبري. لاستخراج الحمض النووي من دودة Caenorhabditis elegans واحدة ، أولا ، اضبط برنامج التحلل الذي يتكون من دورة واحدة عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تليها 95 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق في دورة حرارية.لإعداد محلول التحلل ، أولا ، أضف 0.8 ميكرولتر من محلول الاستخراج من المجموعة إلى الجدار الداخلي لأنبوب PCR سعة 0.2 ملليلتر على الجليد. ثم أضف 0.2 ميكرولتر من محلول تحضير الأنسجة من المجموعة إلى قطرة محلول الاستخراج واخلطها عن طريق الملاعبة. مع اختيار دودة لاستخراج الحمض النووي ، أولا ، حدد L4 أو بالغ تحت مجهر تشريح.يمكن التعرف على خنثى L4 بواسطة فرج مميز مرئي كنصف دائرة شاحبة في منتصف الحيوان. لتحديد خنثى بالغ ، اختر أحد أكبر الحيوانات على اللوحة التي قد تحتوي على أجنة بيضاوية مرئية في رحمها. بعد ذلك ، باستخدام اختيار سلك بلاتيني ، انقل الحيوان المحدد إلى المحلول.لجمع المحتويات في الجزء السفلي من الأنبوب ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان عند 2000 × g في درجة حرارة الغرفة. ثم ضع الأنبوب في جهاز التدوير الحراري ، وقم بتشغيل برنامج التحلل الذي تم تعيينه مسبقا. بعد انتهاء برنامج التحلل هذا ، قم بطرد مركزي للأنبوب لفترة وجيزة ووضعه على الجليد.ثم أضف 0.8 ميكرولتر من محلول التحييد من المجموعة واخلطها عن طريق السحب. مرة أخرى ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان عند 2000 × g في درجة حرارة الغرفة. إذا لم يتم استخدام الليزات على الفور ، فقم بتخزين الأنبوب عند أربع درجات مئوية للاستخدام في المستقبل.لاستخراج الحمض النووي من الديدان الفردية أيضا ، أولا ، اضبط برنامج التحلل لدورة واحدة على 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تليها 95 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق في دورة حرارية. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول التحلل عن طريق إضافة ميكرولترين من محلول الاستخراج من المجموعة أولا إلى الجدار الداخلي لأنبوب PCR سعة 0.2 ملليلتر على الجليد ، يليه إضافة 0.5 ميكرولتر من محلول تحضير الأنسجة من المجموعة إلى قطرة محلول الاستخراج ، ثم خلط المحتويات عن طريق السحب. بعد تحديد L4 أو الحيوانات البالغة ، استخدم سلك بلاتيني لنقل عدد كاف من الحيوانات إلى المحلول.بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان عند 2000 × g في درجة حرارة الغرفة ، ثم ضع الأنبوب في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل برنامج التحلل المحدد مسبقا. بعد الانتهاء من البرنامج ، قم بطرد مركزي للأنبوب لفترة وجيزة ووضعه على الجليد. ثم أضف ميكرولترين من محلول التحييد من المجموعة إلى الأنبوب وخلطها عن طريق السحب.مرة أخرى ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان عند 2000 × g في درجة حرارة الغرفة. إذا لم يتم استخدامه على الفور ، فقم بتخزين الليزات عند أربع درجات مئوية للاستخدام في المستقبل. يمكن استخدام الحمض النووي الجينومي المستخرج بواسطة البروتوكول بنجاح كقالب PCR ، حيث أنتجت كل من المجموعة التجارية وطريقة proteinase K التقليدية الحمض النووي بمستويات مماثلة من تضخيم PCR لمنتج زوج أساسي 2100 ومنتج زوج أساسي 500.كما وفرت طريقة مجموعة تحلل الحمض النووي قوالب PCR فعالة لمجموعة متنوعة من إنزيمات بوليميراز الحمض النووي. حتى في حالات التخفيف المختلفة ، دعم الحمض النووي المستخرج من واحد بواسطة المجموعة التجارية تضخيم PCR لجزء الحمض النووي لزوج 2100 قاعدة بكفاءة مماثلة. ومع ذلك ، فإن تضخيم جزء الحمض النووي لزوج القاعدة 500 يختلف مع تركيز القالب.وقد تجلت ملاءمة الحمض النووي المستخرج إما من واحد أو من متعددة كقالب PCR لتحديد النمط الوراثي من خلال التضخيم الناجح للجين ومتغيره المتحور. نظرا لأن هذا البروتوكول يتضمن سحب كمية صغيرة من الكواشف ، لضمان الاتساق ، استخدم مزيجا رئيسيا لتفاعلات متعددة ، وتقنية أنابيب جيدة ، وماصات معايرة جيدا. أيضا ، الدوران لأسفل محتويات الأنبوب يضمن التحلل المناسب.يمكن توسيع نطاق هذه الطريقة ، وتكييفها لاستخراج الحمض النووي الجيني C.elegans للتطبيقات النهائية الأخرى ، ويمكن استخدامها لاستخراج الحمض النووي من أنواع الديدان الخيطية الأخرى. نظرا لبساطة البروتوكول وسرعته ومتانته وتكلفته المنخفضة ، فهو مناسب تماما لكل من تطبيقات البحث والفصول الدراسية حيث يكون الوقت والموارد محدودة.

Research

JoVE Journal

Biology

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

عزل الحمض النووي الجينوم من الذيول ماوس

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

استخراج عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي الجينوم من التربة والرواسب

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

والعزلة في المختبر تفعيل انواع معينة ايليجانس الحيوانات المنوية

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

الجينومية MRI -- وهو من الموارد العامة للدراسة أنماط تسلسل الحمض النووي داخل الجينوم

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

مصاصة للدماء العزل من السائل خارج الخلية من<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

الأساسية<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em&gt; طرق: التزامن والمراقبة

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

انتقائية لقطة من hydroxymethylcytosine-5 من الحمض النووي الجيني

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

استخراج البروستاجلاندين والتحليل في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

قياس معدلات استهلاك الأوكسجين في سليمة ايليجانس كاينورهابديتيس

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...