Name: small-scale extraction of caenorhabditis elegans genomic dna
Uploaded: 2022-06-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA at JoVE.com

N2-stammen og E. coli OP50-bakterierne blev opnået fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som finansieres af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Blmp-1 (tm548) stammen blev opnået fra National Bioresource Project, Japan. Forfatterne takker WormBase. Dette arbejde blev støttet af NIH R01GM097591 til T.L.G., intern finansiering fra Texas Woman's University til T.L.G og TWU's Center for Student Research til M.F.L.

1. C. elegans vedligeholdelse
BEMÆRK: N2 (vildtype) og blmp-1(tm548) C. elegans stammer blev opretholdt på standard nematode vækstmedier (NGM) plader ved 20 °C.
<ol><li>NGM-plader fremstilles ved at opløse 23,005 g NGM-pulver i 973 ml vand i en 2 L kolbe. Dæk kolbeåbningen med aluminiumsfolie (eller autoklaverbar hætte, der tillader udluftning) og fastgør belægningen med autoklavetape. Autoklave for at opløse pulveret og sterilisere indholdet med...

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+window+into+biology:+A+on+Caenorhabditis+elegans.">A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+mapping+system+in+Caenorhabditis+elegans+based+on+polymorphic+sequence-tagged+sites.">A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites.</a> Genetics. 131, 609-624 (1992).</li><li>Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Caenorhabditis+elegans+genomic+DNA+and+detection+of+deletions+in+the+unc-93+gene+using+PCR.">Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).</li><li>Fay, D., Bender, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNPs:+introduction+and+two-point+mapping.">SNPs: introduction and two-point mapping.</a> WormBook. , 1-10 (2008).</li><li>Biron, D., Haspel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans: Methods and Applications. , (2015).</li><li>. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin Available from: <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf</a> (2013)</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).</li><li>Gumienny, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+SMA-10/LRIG+is+a+conserved+transmembrane+protein+that+enhances+bone+morphogenetic+protein+signaling.">Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling.</a> PLoS Genetics. 6, 1000963 (2010).</li><li>Nelson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bow-tie+genetic+architecture+for+morphogenesis+suggested+by+a+genome-wide+RNAi+screen+in+Caenorhabditis+elegans.">A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).</li><li>Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLMP-1+contributes+to+collagen-related+morphogenesis+in+C.+elegans.">BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans.</a> Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).</li><li>Horn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRE-1/FBXO11-dependent+degradation+of+BLMP-1/BLIMP-1+governs+C.+elegans+developmental+timing+and+maturation.">DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation.</a> Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).</li><li>Huang, T. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLMP-1/Blimp-1+regulates+the+spatiotemporal+cell+migration+pattern+in+C.+elegans.">BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).</li><li>Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+interactions+between+the+DBL-1/BMP-like+pathway+and+dpy+body+size-associated+genes+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).</li><li>Madeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EMBL-EBI+search+and+sequence+analysis+tools+APIs+in+2019.">The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019.</a> Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).</li></ol>

Bestemmelse af genotyperne af C. elegans er et vigtigt skridt, mens du udfører genetiske kryds for at skabe nye C. elegans stammer. Genomisk DNA-ekstraktion ved hjælp af en enkelt eller få C. elegans er et afgørende skridt i genotypning af C. elegans. Denne protokol beskriver genomisk DNA-ekstraktion fra C. elegans ved hjælp af et kommercielt kit. Denne metode er hurtig og fungerer robust. Det genomiske DNA, der ekstraheres ved hjælp af denne metode, kan bruges til downs...

Her præsenteres to relaterede protokoller for lysis af Caenorhabditis elegans for at gøre DNA tilgængeligt for PCR-baserede applikationer. PCR er en almindeligt anvendt molekylær teknik, der anvendes til mange applikationer, herunder genotypning og forstærkning af DNA-fragmenter til kloning og sekventering, blandt andre. Den lille (1 mm), fritlevende rundorm C. elegans er et populært dyresystem til biologisk forskning. Opnåelse af egnet genomisk DNA fra et enkelt dyr eller nogle få dyr er tilstrækkeligt til at forstærke sekvensen ved PCR. Sene L4 larver og voksne indeholder kun ~ 1.000 somatiske celler (herunder nogle multi-nukleare, polyploide celler), kimceller og (hvis dyret er en gravid hermafrodit) afkom i utero1. Disse dyr er dog beskyttet af en neglebånd, der skal forstyrres for at ekstrahere det genomiske DNA2. Standardmetoder til fremstilling af nematode genomisk DNA-skabelon til PCR involverer flere trin og tager flere timer. Dyrene fryses først i ormelysebuffer indeholdende proteinase K (-70 °C eller derunder) i mindst 15-45 minutter (længere anbefales i nogle protokoller)3,4,5,6. Dette trin revner åbne dyrene.
Efter frysning inkuberes dyrene i 1 time ved 60-65 °C, så proteinasen K virker, hvorefter enzymet inaktiveres i 15-30 min ved 95 °C. Proteinasen K ødelægger nukleaserne, der nedbryder DNA. Inaktivering af proteinase K før PCR er vigtig for at forhindre, at proteinasen K nedbryder DNA-polymerasen. De to kitbaserede protokoller, der er beskrevet her, er hurtige, pålidelige og omkostningseffektive metoder til at udtrække genomisk DNA fra enten et enkelt dyr eller et par nematoder til daglig forskning og undervisning i laboratorieapplikationer. Det anvendte sæt blev oprindeligt optimeret af producenten til at udtrække DNA fra animalsk væv, spyt og hår7. Det bruger en proprietær vævsforberedelsesopløsning og ekstraktionsopløsning til at lyse celler og gøre genomisk DNA tilgængeligt. En proprietær neutraliseringsopløsning neutraliserer derefter de komponenter, der kan hæmme PCR (f.eks. Salte, ioner og Mg2 + -bindende molekyler).
Ved genotypning kan et enkelt dyr testes. Når det skal afgøres, om en stamme er homozygot, giver test af seks eller flere afkom fra et enkelt dyr stor tillid til, at en linje er homozygot eller ej (der er 0,02% chance for tilfældigt at vælge seks homozygote mutante afkom fra en heterozygot forælder [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Denne metode 1) er ligetil, med færre trin end proteinase K-metoden, og 2) reducerer skabelonforberedelsestiden til 15 min. Resultaterne i dette arbejde viser, at den udviklede protokol fungerer robust ved ekstraktion af genomisk DNA fra enkelte eller nogle få orme, som pålideligt kan bruges til downstream-applikationer, der ikke kræver stærkt oprenset DNA, herunder PCR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>autoclave tape</td>
			<td>Defend</td>
			<td>43237-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aluminium foil, heavy duty</td>
			<td>Reynolds Wrap</td>
			<td>2182934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>102382 (CAS 10035-04-8)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>XNAT2-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp hotplate/stirrer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-100-495H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media, Lennox, capsules</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>3002-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC413485000 (CAS 7487-88-9)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>Labnet International, Inc.</td>
			<td>PrismR, C2500-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>M0515S</td>
			<td>&#34;Pol E&#34; used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20&#8211;30 s/kb)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM media powder</td>
			<td>US Biological Life Sciences</td>
			<td>N1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>&#34;Pol D&#34; in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15&#8211;30 s/kb)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom DNA oligos</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL polymerase</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>R050B</td>
			<td>&#34;Pol C&#34; in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1&#8211;10.0 kb)</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>N0550S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SapphireAmp Fast PCR Master Mix</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR350A</td>
			<td>&#34;Pol A&#34; in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>P4600</td>
			<td>&#34;Pol B&#34; in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A24812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>worm pick</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale extraction of caenorhabditis elegans genomic dna

Genomisk DNA-ekstraktion fra enkelte eller nogle få Caenorhabditis elegans har mange nedstrøms applikationer, herunder PCR til genotekypinglinjer, kloning og sekventering. De traditionelle proteinase K-baserede metoder til genomisk DNA-ekstraktion fra C. elegans tager flere timer. Kommercielle ekstraktionssæt, der effektivt bryder C. elegans neglebånd og ekstrakt genomisk DNA, er begrænsede. En nem, hurtigere (~ 15 min) og omkostningseffektiv metode til ekstraktion af C. elegans genomisk DNA, der fungerer godt til klasseværelses- og forskningsapplikationer, rapporteres her. Denne DNA-ekstraktionsmetode er optimeret til at anvende enkelte eller nogle få senlarver (L4) eller voksne nematoder som udgangsmateriale til opnåelse af en pålidelig skabelon til udførelse af PCR. Resultaterne tyder på, at DNA-kvaliteten er egnet til at forstærke genmål af forskellig størrelse ved PCR, hvilket tillader genotypning af enkelte eller nogle få dyr selv ved fortyndinger til en halvtredsindstyvende del af det genomiske DNA fra en enkelt voksen pr. reaktion. De rapporterede protokoller kan pålideligt bruges til hurtigt at producere DNA-skabelon fra en enkelt eller en lille prøve af C. elegans til PCR-baserede applikationer.

Genomisk DNA fra en enkelt eller et par vildtypevoksne blev ekstraheret ved hjælp af det kommercielle kit eller den traditionelle lysisprotokol for at sammenligne effektiviteten af disse to metoder. Disse lysater blev derefter brugt som skabeloner til PCR for at forstærke enten et større mål på ~ 2.100 bp (kodning af blmp-1) eller et mindre mål på ~ 500 bp (kodning af en del af sma-10). Begge metoder gav med succes passende PCR-produkter (figur 1A).
<p class="jov...

Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA at JoVE.com

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Præsenteret her er en beskrivelse af den ligetil og relativt hurtige isolering af Caenorhabditis elegans genomisk DNA fra et eller nogle få dyr ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt vævssæt. Det resulterende gDNA-præparat er en passende skabelon til PCR.

Småskala ekstraktion af Caenorhabditis elegans Genomisk DNA

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...

Vi har udviklet en nem, hurtig og omkostningseffektiv metode til ekstraktion af C.elegans genomisk DNA, der fungerer godt til klasseværelses- og forskningsapplikationer. Disse protokoller kan pålideligt bruges til hurtigt at producere DNA-skabeloner fra en enkelt eller en lille prøve af C.elegance til PCR-baserede applikationer. Brugere, der ikke har erfaring med at plukke orme eller bruge en mikropipetter, kan kæmpe med trin, der kræver disse færdigheder.At se en dygtig praktiserende læge og øve kan hjælpe. Farhan Lakdawala, en seniorstuderende fra mit laboratorium, demonstrerer proceduren. For at ekstrahere DNA fra en enkelt Caenorhabditis elegans orm skal du først indstille lysisprogrammet bestående af en cyklus ved 55 grader Celsius i 10 minutter efterfulgt af 95 grader Celsius i tre minutter i en termocyklist.For at forberede lysisopløsningen tilsættes først 0,8 mikroliter ekstraktionsopløsning fra sættet til indersiden af et 0,2 ml PCR-rør på is. Derefter tilsættes 0,2 mikroliter vævsforberedelsesopløsning fra sættet til dråben af ekstraktionsopløsning og blandes ved petting. Ved udvælgelsen af en orm til DNA-ekstraktion skal du først identificere et L4 eller voksent dyr under et dissekerende mikroskop.En L4 hermafrodit kan identificeres ved en karakteristisk vulva, der er synlig som en bleg halvcirkel midt i dyret. For at identificere en voksen hermafrodit skal du vælge et af de største dyr på pladen, der kan have ovale embryoner synlige i livmoderen. Derefter overføres det valgte dyr til opløsningen ved hjælp af et platintrådvalg.For at opsamle indholdet i bunden af røret centrifugeres røret i to til tre sekunder ved 2000 x g ved stuetemperatur. Placer derefter røret i termocyklisten, og kør lysisprogrammet, der er indstillet tidligere. Når dette lysisprogram er overstået, centrifugeres røret kortvarigt og lægges på is.Tilsæt derefter 0,8 mikroliter neutraliseringsopløsning fra sættet og bland ved pipettering. Igen centrifugeres røret i to til tre sekunder ved 2000 x g ved stuetemperatur. Hvis lysatet ikke anvendes med det samme, skal røret opbevares ved fire grader Celsius til fremtidig brug.For at udtrække DNA fra en individuel orm skal du først indstille lysisprogrammet for en cyklus til 55 grader Celsius i 10 minutter efterfulgt af 95 grader Celsius i tre minutter i en termocyklist. Derefter forberedes lysisopløsningen ved først at tilsætte to mikroliter af ekstraktionsopløsningen fra sættet på indersiden af en 0,2 ml PCR-rør på is efterfulgt af tilsætning af 0,5 mikroliter vævsforberedelsesopløsningen fra kittet til dråben af ekstraktionsopløsningen, og bland derefter indholdet ved pipettering. Efter at have identificeret L4 eller voksne dyr, skal du bruge et platintrådvalg til at overføre et tilstrækkeligt antal dyr til opløsningen.Centrifuger derefter røret i to til tre sekunder ved 2000 x g ved stuetemperatur, anbring derefter røret i termocyklinen og kør det tidligere indstillede lysisprogram. Efter afslutningen af programmet skal du kort centrifugere røret og placere det på is. Tilsæt derefter to mikroliter af neutraliseringsopløsningen fra sættet til røret og blandes ved pipettering.Igen centrifugeres røret i to til tre sekunder ved 2000 x g ved stuetemperatur. Hvis det ikke bruges med det samme, skal lysatet opbevares ved fire grader Celsius til fremtidig brug. Det genomiske DNA, der ekstraheres af protokollen, kunne med succes anvendes som en PCR-skabelon, både det kommercielle kit og den traditionelle proteinase K-metode producerede DNA med lignende niveauer af PCR-amplifikation af et 2100-baseparprodukt og et 500-baseparprodukt.Kitmetoden til DNA-lysis leverede også PCR-skabeloner, der var effektive til en række DNA-polymeraseenzymer. Selv ved forskellige fortyndinger understøttede DNA'et ekstraheret fra et enkelt dyr af det kommercielle kit PCR-amplifikationen af et 2100 basepar DNA-fragment med tilsvarende effektivitet. Amplifikationen af et 500 basepar DNA-fragment varierede imidlertid med skabelonkoncentrationen.Egnetheden af DNA'et ekstraheret enten fra et enkelt dyr eller fra flere dyr som en PCR-skabelon til bestemmelse af genotype blev yderligere demonstreret ved den vellykkede amplifikation af et gen og dets muterede variant. Da denne protokol involverer pipettering af et lille volumen reagenser, skal du bruge en masterblanding til flere reaktioner, god rørteknik og godt kalibrerede pipetter for at sikre konsistens. Også spinding ned indholdet af røret sikrer korrekt lysis.Denne metode kunne skaleres op, tilpasses til at udtrække C.elegans genomiske DNA til andre downstream-applikationer og kunne bruges til at udtrække DNA fra andre nematodearter. I betragtning af protokollens enkelhed, hastighed, robusthed og lave omkostninger er den velegnet til både forsknings- og klasseværelsesapplikationer, hvor tid og ressourcer er begrænsede.

Research

JoVE Journal

Biology

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grundlæggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Selektiv opsamling af 5-hydroxymethylcytosine fra genomisk DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Udvinding og Analyse i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Forstærkning, Næste generations sekventering, og Genomisk DNA Kortlægning af retroviral integration steder

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Måling af ilt forbrug satser i intakt Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...