Name: small-scale extraction of caenorhabditis elegans genomic dna
Uploaded: 2022-06-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA at JoVE.com

De N2-stam en E. coli OP50-bacteriën werden verkregen van het Caenorhabditis Genetics Center (CGC), dat wordt gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). De blmp-1 (tm548) stam werd verkregen van het National Bioresource Project, Japan. De auteurs bedanken WormBase. Dit werk werd ondersteund door NIH R01GM097591 aan T.L.G., interne financiering door Texas Woman's University aan T.L.G. en TWU's Center for Student Research aan M.F.L.

1. Onderhoud van C. elegans
OPMERKING: N2 (wild type) en blmp-1(tm548) C. elegans stammen werden gehandhaafd op standaard nematode groeimedia (NGM) platen bij 20 °C.
<ol><li>Bereid NGM-platen door 23,005 g NGM-poeder op te lossen in 973 ml water in een kolf van 2 L. Dek de opening van de kolf af met aluminiumfolie (of autoclaveerbare dop die ontluchting mogelijk maakt) en bevestig de bekleding met autoclaaftape. Autoclaaf om het poeder op te lossen en de i...

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+window+into+biology:+A+on+Caenorhabditis+elegans.">A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+mapping+system+in+Caenorhabditis+elegans+based+on+polymorphic+sequence-tagged+sites.">A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites.</a> Genetics. 131, 609-624 (1992).</li><li>Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Caenorhabditis+elegans+genomic+DNA+and+detection+of+deletions+in+the+unc-93+gene+using+PCR.">Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).</li><li>Fay, D., Bender, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNPs:+introduction+and+two-point+mapping.">SNPs: introduction and two-point mapping.</a> WormBook. , 1-10 (2008).</li><li>Biron, D., Haspel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans: Methods and Applications. , (2015).</li><li>. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin Available from: <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf</a> (2013)</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).</li><li>Gumienny, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+SMA-10/LRIG+is+a+conserved+transmembrane+protein+that+enhances+bone+morphogenetic+protein+signaling.">Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling.</a> PLoS Genetics. 6, 1000963 (2010).</li><li>Nelson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bow-tie+genetic+architecture+for+morphogenesis+suggested+by+a+genome-wide+RNAi+screen+in+Caenorhabditis+elegans.">A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).</li><li>Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLMP-1+contributes+to+collagen-related+morphogenesis+in+C.+elegans.">BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans.</a> Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).</li><li>Horn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRE-1/FBXO11-dependent+degradation+of+BLMP-1/BLIMP-1+governs+C.+elegans+developmental+timing+and+maturation.">DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation.</a> Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).</li><li>Huang, T. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLMP-1/Blimp-1+regulates+the+spatiotemporal+cell+migration+pattern+in+C.+elegans.">BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).</li><li>Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+interactions+between+the+DBL-1/BMP-like+pathway+and+dpy+body+size-associated+genes+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).</li><li>Madeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EMBL-EBI+search+and+sequence+analysis+tools+APIs+in+2019.">The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019.</a> Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).</li></ol>

Het bepalen van de genotypen van C. elegans is een belangrijke stap bij het uitvoeren van genetische kruisingen om nieuwe C. elegans-stammen te creëren. Genomische DNA-extractie met behulp van een enkele of enkele C. elegans is een cruciale stap in het genotyperen van C. elegans. Dit protocol beschrijft genomische DNA-extractie van C. elegans met behulp van een commerciële kit. Deze methode is snel en werkt robuust. Het genomische DNA dat met deze methode wordt geëxtraheerd...

Hier worden twee gerelateerde protocollen gepresenteerd voor de lysis van Caenorhabditis elegans om DNA toegankelijk te maken voor PCR-gebaseerde toepassingen. PCR is een veelgebruikte moleculaire techniek die voor veel toepassingen wordt gebruikt, waaronder genotypering en het versterken van DNA-fragmenten voor onder andere klonen en sequencing. De kleine (1 mm), vrijlevende rondworm C. elegans is een populair diersysteem voor biologisch onderzoek. Het verkrijgen van geschikt genomisch DNA van een enkel dier of een paar dieren is voldoende om de sequentie door PCR te versterken. Late L4-larven en volwassenen bevatten slechts ~ 1.000 somatische cellen (waaronder sommige multinucleaire, polyploïde cellen), geslachtscellen en (als het dier een gravid hermafrodiet is) nakomelingen in utero1. Deze dieren worden echter beschermd door een cuticula die moet worden verstoord om het genomische DNA2 te extraheren. Standaardmethoden om nematode genomische DNA-sjabloon voor PCR voor te bereiden, omvatten meerdere stappen en duren enkele uren. De dieren worden eerst ingevroren in een wormlysisbuffer met proteïnase K (−70 °C of lager) gedurende ten minste 15-45 minuten (langer wordt aanbevolen door sommige protocollen)3,4,5,6. Deze stap breekt de dieren open.
Na bevriezing worden de dieren gedurende 1 uur bij 60-65 ° C geïncubeerd om het proteïnase K te laten werken, waarna het enzym gedurende 15-30 minuten bij 95 ° C wordt geïnactiveerd. Het proteïnase K vernietigt de nucleasen die DNA afbreken. De inactivatie van proteïnase K vóór PCR is belangrijk om te voorkomen dat het proteïnase K het DNA-polymerase afbreekt. De twee kit-gebaseerde protocollen die hier worden beschreven, zijn snelle, betrouwbare en kosteneffectieve methoden om genomisch DNA te extraheren uit een enkel dier of een paar nematoden voor dagelijks onderzoek en het onderwijzen van laboratoriumtoepassingen. De gebruikte kit werd oorspronkelijk door de fabrikant geoptimaliseerd om DNA uit dierlijk weefsel, speeksel en haar te extraheren7. Het maakt gebruik van een gepatenteerde weefselpreparatieoplossing en extractieoplossing om cellen te lyseren en genomisch DNA toegankelijk te maken. Een gepatenteerde neutralisatieoplossing neutraliseert vervolgens de componenten die PCR kunnen remmen (bijv. Zouten, ionen en Mg2 + -bindende moleculen).
Bij genotypering kan een enkel dier worden getest. Bij het bepalen of een stam homozygoot is, geeft het testen van zes of meer nakomelingen van een enkel dier een hoge mate van vertrouwen dat een lijn homozygoot is of niet (er is een kans van 0,02% om willekeurig zes homozygote mutante nakomelingen te kiezen van een heterozygote ouder [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Deze methode 1) is eenvoudig, met minder stappen dan de proteïnase K-methode, en 2) vermindert de voorbereidingstijd van de sjabloon tot 15 minuten. De resultaten in dit werk tonen aan dat het ontwikkelde protocol robuust werkt bij het extraheren van genomisch DNA uit enkele of enkele wormen, die betrouwbaar kunnen worden gebruikt voor downstream-toepassingen die geen sterk gezuiverd DNA vereisen, inclusief PCR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>autoclave tape</td>
			<td>Defend</td>
			<td>43237-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aluminium foil, heavy duty</td>
			<td>Reynolds Wrap</td>
			<td>2182934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>102382 (CAS 10035-04-8)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>XNAT2-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp hotplate/stirrer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-100-495H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media, Lennox, capsules</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>3002-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC413485000 (CAS 7487-88-9)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>Labnet International, Inc.</td>
			<td>PrismR, C2500-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>M0515S</td>
			<td>&#34;Pol E&#34; used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20&#8211;30 s/kb)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM media powder</td>
			<td>US Biological Life Sciences</td>
			<td>N1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>&#34;Pol D&#34; in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15&#8211;30 s/kb)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom DNA oligos</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL polymerase</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>R050B</td>
			<td>&#34;Pol C&#34; in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1&#8211;10.0 kb)</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>N0550S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SapphireAmp Fast PCR Master Mix</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR350A</td>
			<td>&#34;Pol A&#34; in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>P4600</td>
			<td>&#34;Pol B&#34; in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A24812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>worm pick</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale extraction of caenorhabditis elegans genomic dna

Genomische DNA-extractie uit enkele of enkele Caenorhabditis elegans heeft veel downstream-toepassingen, waaronder PCR voor genotyperingslijnen, klonen en sequencing. De traditionele proteïnase K-gebaseerde methoden voor genomische DNA-extractie uit C. elegans duren enkele uren. Commerciële extractiekits die de C. elegans-cuticula effectief openbreken en genomisch DNA extraheren, zijn beperkt. Een eenvoudige, snellere (~ 15 min) en kostenefficiënte methode voor het extraheren van C. elegans genomisch DNA dat goed werkt voor klaslokalen en onderzoekstoepassingen wordt hier gerapporteerd. Deze DNA-extractiemethode is geoptimaliseerd om enkele of enkele laatlarven (L4) of volwassen nematoden te gebruiken als uitgangsmateriaal voor het verkrijgen van een betrouwbare sjabloon om PCR uit te voeren. De resultaten geven aan dat de DNA-kwaliteit geschikt is voor het versterken van gendoelen van verschillende grootte door PCR, waardoor genotypering van enkele of enkele dieren mogelijk is, zelfs bij verdunningen tot een vijftigste van het genomische DNA van een enkele volwassene per reactie. De gerapporteerde protocollen kunnen betrouwbaar worden gebruikt om snel DNA-sjablonen te produceren uit een enkele of een kleine steekproef van C. elegans voor PCR-gebaseerde toepassingen.

Genomisch DNA van een enkele of enkele wild-type volwassenen werd geëxtraheerd met behulp van de commerciële kit of het traditionele lysisprotocol om de werkzaamheid van deze twee methoden te vergelijken. Deze lysaten werden vervolgens gebruikt als sjablonen voor PCR om ofwel een groter doel van ~ 2.100 bp (codering blmp-1) of een kleiner doel van ~ 500 bp (coderend voor een deel van sma-10) te versterken. Beide methoden leverden met succes geschikte PCR-producten op (figuur 1A</s...

Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA at JoVE.com

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Hier wordt een beschrijving gegeven van de eenvoudige en relatief snelle isolatie van Caenorhabditis elegans genomisch DNA van een of enkele dieren met behulp van een in de handel verkrijgbare weefselkit. Het resulterende gDNA-preparaat is een geschikt sjabloon voor PCR.

Kleinschalige extractie van Caenorhabditis elegans Genomisch DNA

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...

We hebben een eenvoudige, snelle en kostenefficiënte methode ontwikkeld voor het extraheren van C.elegans genomisch DNA dat geweldig werkt voor klassikale en onderzoekstoepassingen. Deze protocollen kunnen betrouwbaar worden gebruikt om snel DNA-sjablonen te produceren uit een enkel of een klein monster van C.elegance voor PCR-gebaseerde toepassingen. Gebruikers die geen ervaring hebben met het plukken van wormen of het gebruik van een micropipetter kunnen worstelen met stappen die deze vaardigheden vereisen.Kijken naar een bekwame beoefenaar en oefenen kan helpen. De procedure wordt gedemonstreerd door Farhan Lakdawala, een senior afgestudeerde student uit mijn laboratorium. Voor het extraheren van DNA uit een enkele Caenorhabditis elegans-worm, stelt u eerst het lysis-programma in dat bestaat uit één cyclus op 55 graden Celsius gedurende 10 minuten gevolgd door 95 graden Celsius gedurende drie minuten in een thermocycler.Om de lysisoplossing te bereiden, voegt u eerst 0,8 microliter extractieoplossing uit de kit toe aan de binnenwand van een PCR-buis van 0,2 milliliter op ijs. Voeg vervolgens 0,2 microliter weefselpreparatieoplossing uit de kit toe aan de druppel extractieoplossing en meng door te aaien. Met de selectie van een worm voor DNA-extractie, identificeer eerst een L4 of volwassen dier onder een ontleedmicroscoop.Een L4 hermafrodiet is te herkennen aan een karakteristieke vulva die zichtbaar is als een bleke halve cirkel in het midden van het dier. Om een volwassen hermafrodiet te identificeren, selecteert u een van de grootste dieren op de plaat die ovale embryo's zichtbaar kunnen hebben in de baarmoeder. Breng vervolgens met behulp van een platina draadplectrum het geselecteerde dier over naar de oplossing.Om de inhoud aan de onderkant van de buis te verzamelen, centrifugeert u de buis gedurende twee tot drie seconden bij 2000 x g bij kamertemperatuur. Plaats vervolgens de buis in de thermocycler en voer het eerder ingestelde lysisprogramma uit. Nadat dit lysisprogramma voorbij is, centrifugeer je de buis kort en zet je hem op ijs.Voeg vervolgens 0,8 microliter neutralisatieoplossing uit de kit toe en meng door pipetteren. Nogmaals, centrifugeer de buis gedurende twee tot drie seconden bij 2000 x g bij kamertemperatuur. Als het lysaat niet onmiddellijk wordt gebruikt, bewaar de buis dan bij vier graden Celsius voor toekomstig gebruik.Om ook DNA uit een individuele worm te extraheren, stelt u eerst het lysisprogramma van één cyclus in op 55 graden Celsius gedurende 10 minuten gevolgd door 95 graden Celsius gedurende drie minuten in een thermocycler. Bereid vervolgens de lysisoplossing door eerst twee microliter van de extractieoplossing uit de kit toe te voegen aan de binnenwand van een PCR-buis van 0,2 milliliter op ijs, gevolgd door de toevoeging van 0,5 microliter van de weefselpreparatieoplossing uit de kit aan de druppel extractieoplossing en meng vervolgens de inhoud door pipetteren. Gebruik na het identificeren van L4 of volwassen dieren een platina draadprikker om een voldoende aantal dieren in de oplossing over te brengen.Centrifugeer vervolgens de buis gedurende twee tot drie seconden bij 2000 x g bij kamertemperatuur, plaats de buis vervolgens in de thermocycler en voer het eerder ingestelde lysisprogramma uit. Na voltooiing van het programma, kort centrifugeer de buis en plaats deze op ijs. Voeg vervolgens twee microliter van de neutralisatieoplossing uit de kit toe aan de buis en meng door pipetteren.Nogmaals, centrifugeer de buis gedurende twee tot drie seconden bij 2000 x g bij kamertemperatuur. Als het niet onmiddellijk wordt gebruikt, bewaar het lysaat dan bij vier graden Celsius voor toekomstig gebruik. Het genomische DNA geëxtraheerd door het protocol kon met succes worden gebruikt als een PCR-sjabloon, zowel de commerciële kit als de traditionele proteïnase K-methode produceerde DNA met vergelijkbare niveaus van PCR-amplificatie van een 2100 base pair-product en een 500 base pair-product.De kitmethode voor DNA-lysis leverde ook PCR-sjablonen die effectief zijn voor een verscheidenheid aan DNA-polymerase-enzymen. Zelfs bij verschillende verdunningen ondersteunde het DNA dat door de commerciële kit uit een enkel dier werd geëxtraheerd de PCR-amplificatie van een DNA-fragment van 2100 basenparen met een equivalente efficiëntie. De versterking van een DNA-fragment van 500 basenparen varieerde echter met de sjabloonconcentratie.De geschiktheid van het DNA geëxtraheerd uit een enkel dier of uit meerdere dieren als een PCR-sjabloon voor het bepalen van het genotype werd verder aangetoond door de succesvolle amplificatie van een gen en zijn gemuteerde variant. Aangezien dit protocol het pipetteren van kleine hoeveelheden reagentia omvat, gebruikt u, om consistentie te garanderen, een mastermix voor meerdere reacties, een goede leidingtechniek en goed gekalibreerde pipetten. Ook zorgt het draaien langs de inhoud van de buis voor een goede lysis.Deze methode kan worden opgeschaald, aangepast om C.elegans genomisch DNA te extraheren voor andere downstream-toepassingen, en kan worden gebruikt om DNA van andere nematodensoorten te extraheren. Gezien de eenvoud, snelheid, robuustheid en lage kosten van het protocol, is het zeer geschikt voor zowel onderzoeks- als klastoepassingen waar tijd en middelen beperkt zijn.

Research

JoVE Journal

Biology

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolatie van Genomic DNA van muis Tails

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Extractie met een hoog molecuulgewicht Genomic DNA uit bodems en sedimenten

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolatie en In vitro Activering van Caenorhabditis elegans Sperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Genomische MRI - een openbare hulpbron voor het bestuderen van Sequence patronen binnen Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolatie van extracellulaire vloeistof uit<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basis-<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisatie-en-

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Selectieve vangen van 5-hydroxymethylcytosine van genomisch DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandine-extractie en analyse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Meting van zuurstof verbruik in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...