Name: small-scale extraction of caenorhabditis elegans genomic dna
Uploaded: 2022-06-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA at JoVE.com

זן N2 וחיידקי E. coli OP50 התקבלו מהמרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC), הממומן על ידי המשרד לתוכניות תשתית מחקר של NIH (P40 OD010440). זן blmp-1(tm548) התקבל מפרויקט הביו-ורסורס הלאומי, יפן. המחברים מודים ל-WormBase. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01GM097591 ל- T.L.G., מימון פנימי של אוניברסיטת טקסס לנשים ל- T.L.G, והמרכז לחקר סטודנטים של TWU ל- M.F.L.

1. C. elegans תחזוקה
הערה: N2 (סוג פראי) ו blmp-1(tm548) C. elegans זנים נשמרו על לוחות סטנדרטיים של מדיית גדילת נמטודה (NGM) בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.
<ol><li>הכן צלחות NGM על ידי המסת 23.005 גרם של אבקת NGM ב 973 מ"ל של מים בבקבוקון 2 ליטר. מכסים את פתח הבקבוקון בנייר אלומיניום (או מכסה ...

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+window+into+biology:+A+on+Caenorhabditis+elegans.">A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+mapping+system+in+Caenorhabditis+elegans+based+on+polymorphic+sequence-tagged+sites.">A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites.</a> Genetics. 131, 609-624 (1992).</li><li>Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Caenorhabditis+elegans+genomic+DNA+and+detection+of+deletions+in+the+unc-93+gene+using+PCR.">Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).</li><li>Fay, D., Bender, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNPs:+introduction+and+two-point+mapping.">SNPs: introduction and two-point mapping.</a> WormBook. , 1-10 (2008).</li><li>Biron, D., Haspel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans: Methods and Applications. , (2015).</li><li>. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin Available from: <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf</a> (2013)</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).</li><li>Gumienny, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+SMA-10/LRIG+is+a+conserved+transmembrane+protein+that+enhances+bone+morphogenetic+protein+signaling.">Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling.</a> PLoS Genetics. 6, 1000963 (2010).</li><li>Nelson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bow-tie+genetic+architecture+for+morphogenesis+suggested+by+a+genome-wide+RNAi+screen+in+Caenorhabditis+elegans.">A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).</li><li>Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLMP-1+contributes+to+collagen-related+morphogenesis+in+C.+elegans.">BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans.</a> Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).</li><li>Horn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRE-1/FBXO11-dependent+degradation+of+BLMP-1/BLIMP-1+governs+C.+elegans+developmental+timing+and+maturation.">DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation.</a> Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).</li><li>Huang, T. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLMP-1/Blimp-1+regulates+the+spatiotemporal+cell+migration+pattern+in+C.+elegans.">BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).</li><li>Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+interactions+between+the+DBL-1/BMP-like+pathway+and+dpy+body+size-associated+genes+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).</li><li>Madeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EMBL-EBI+search+and+sequence+analysis+tools+APIs+in+2019.">The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019.</a> Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).</li></ol>

קביעת הגנוטיפים של C. elegans היא צעד חשוב בעת ביצוע הצלבות גנטיות ליצירת זנים חדשים של C. elegans . מיצוי דנ"א גנומי באמצעות C. elegans יחיד או מעטים הוא שלב מכריע בגנוטיפ C. elegans. פרוטוקול זה מתאר מיצוי דנ"א גנומי מ-C. elegans באמצעות ערכה מסחרית. שיטה זו מהירה ופועלת בחוזקה. הדנ"א הגנו?...

כאן, שני פרוטוקולים קשורים מוצגים עבור lysis של Caenorhabditis elegans כדי להפוך את הדנ"א נגיש עבור יישומים מבוססי PCR. PCR היא טכניקה מולקולרית נפוצה המשמשת ליישומים רבים, כולל גנוטיפ והגברת מקטעי דנ"א לשיבוט וריצוף, בין היתר. התולעת העגולה הקטנה (1 מ"מ), החיה בחופשיות C. elegans היא מערכת פופולרית של בעלי חיים למחקר ביולוגי. די בהשגת דנ"א גנומי מתאים מבעל חיים יחיד או מכמה בעלי חיים כדי להגביר את הרצף על ידי PCR. זחלי L4 מאוחרים ובוגרים מכילים רק כ-1,000 תאים סומטיים (כולל כמה תאים רב-גרעיניים, פוליפלואידים), תאי נבט, וצאצאים (אם החיה היא הרמפרודיט גרבידי) ברחם1. עם זאת, בעלי חיים אלה מוגנים על ידי קוטיקולה שיש לשבש כדי לחלץ את הדנ"א הגנומי2. שיטות סטנדרטיות להכנת תבנית דנ"א גנומית נמטודה ל-PCR כרוכות במספר שלבים ונמשכות מספר שעות. בעלי החיים מוקפאים לראשונה במאגר ליזה של תולעים המכיל פרוטאינאז K (−70 מעלות צלזיוס ומטה) למשך 15-45 דקות לפחות (יותר זמן מומלץ על ידי פרוטוקולים מסוימים)3,4,5,6. שלב זה פותח את החיות.
לאחר ההקפאה, בעלי החיים מודגרים במשך שעה אחת ב 60-65 מעלות צלזיוס עבור פרוטאינז K לעבוד, ואז האנזים מומת במשך 15-30 דקות ב 95 °C (65 °F). הפרוטאינאז K הורס את הנוקלאזות שמפרקות את הדנ"א. ההשבתה של פרוטאינאז K לפני PCR חשובה כדי למנוע מהפרוטאינאז K לפרק את ה-DNA פולימראז. שני הפרוטוקולים מבוססי הערכה המתוארים כאן הם שיטות מהירות, אמינות וחסכוניות לחילוץ דנ"א גנומי מבעל חיים יחיד או מכמה נמטודות לצורך מחקר יומיומי וליישומי מעבדה. הערכה שבה נעשה שימוש הותאמה במקור על ידי היצרן כדי לחלץ דנ"א מרקמת בעלי חיים, רוק ושיער7. הוא משתמש בתמיסת הכנת רקמות קניינית ובתמיסת מיצוי כדי ליזום תאים ולהנגיש את הדנ"א הגנומי. תמיסת נטרול קניינית מנטרלת את הרכיבים שעלולים לעכב PCR (למשל, מלחים, יונים ומולקולות קושרות Mg2+).
בעת גנוטיפ, ניתן לבחון בעל חיים יחיד. כאשר קובעים אם זן מסוים הוא הומוזיגוטי, בדיקת שישה צאצאים או יותר מבעל חיים אחד נותנת ביטחון גבוה שהקו הוא הומוזיגוטי או לא (יש סיכוי של 0.02% לבחור באופן אקראי שישה צאצאים מוטנטיים הומוזיגוטיים מהורה הטרוזיגוטי [(1/4)6 × 100% = 0.02%]). שיטה זו 1) היא פשוטה, עם פחות שלבים משיטת הפרוטאינאז K, ו-2) מקטינה את זמן הכנת התבנית ל-15 דקות. התוצאות בעבודה זו מדגימות כי הפרוטוקול שפותח פועל באופן חזק בחילוץ דנ"א גנומי מתולעים בודדות או מכמה תולעים, אשר ניתן להשתמש בהן באופן אמין עבור יישומים במורד הזרם שאינם דורשים דנ"א מטוהר מאוד, כולל PCR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>autoclave tape</td>
			<td>Defend</td>
			<td>43237-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aluminium foil, heavy duty</td>
			<td>Reynolds Wrap</td>
			<td>2182934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>102382 (CAS 10035-04-8)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>XNAT2-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp hotplate/stirrer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-100-495H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media, Lennox, capsules</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>3002-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC413485000 (CAS 7487-88-9)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>Labnet International, Inc.</td>
			<td>PrismR, C2500-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>M0515S</td>
			<td>&#34;Pol E&#34; used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20&#8211;30 s/kb)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM media powder</td>
			<td>US Biological Life Sciences</td>
			<td>N1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>&#34;Pol D&#34; in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15&#8211;30 s/kb)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom DNA oligos</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL polymerase</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>R050B</td>
			<td>&#34;Pol C&#34; in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1&#8211;10.0 kb)</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>N0550S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SapphireAmp Fast PCR Master Mix</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR350A</td>
			<td>&#34;Pol A&#34; in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>P4600</td>
			<td>&#34;Pol B&#34; in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A24812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>worm pick</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale extraction of caenorhabditis elegans genomic dna

למיצוי דנ"א גנומי מ-Caenorhabditis elegans יחידים או מכמה סוגים של Caenorhabditis יש יישומים רבים במורד הזרם, כולל PCR עבור קווי גנוטיפ, שיבוט וריצוף. השיטות המסורתיות המבוססות על פרוטאינאז K למיצוי דנ"א גנומי מ- C. elegans אורכות מספר שעות. ערכות מיצוי מסחריות שפותחות ביעילות את הקוטיקולה C. elegans ומוציאות דנ"א גנומי מוגבלות. שיטה קלה, מהירה יותר (כ-15 דקות) וחסכונית לחילוץ דנ"א גנומי של C. elegans שעובדת היטב עבור יישומי כיתה ומחקר מדווחת כאן. שיטת מיצוי דנ"א זו ממוטבת לשימוש בזחל יחיד או בכמה נמטודות מאוחרות (L4) או נמטודות בוגרות כחומר התחלתי לקבלת תבנית אמינה לביצוע PCR. התוצאות מצביעות על כך שאיכות הדנ"א מתאימה להגברת מטרות גנים בגדלים שונים על ידי PCR, ומאפשרת גנוטיפ של בעלי חיים בודדים או כמה גם בדילולים עד חמישים מהדנ"א הגנומי ממבוגר יחיד לכל תגובה. ניתן להשתמש בפרוטוקולים המדווחים באופן אמין כדי לייצר במהירות תבנית דנ"א מדגימה אחת או קטנה של C. elegans עבור יישומים מבוססי PCR.

דנ"א גנומי של בוגרים יחידים או כמה בוגרים מסוג פרא הופק באמצעות הערכה המסחרית או פרוטוקול ליזה מסורתי כדי להשוות את היעילות של שתי השיטות הללו. ליאסטים אלה שימשו לאחר מכן כתבניות עבור PCR כדי להגביר מטרה גדולה יותר של ~ 2,100 bp (קידוד blmp-1) או יעד קטן יותר של ~ 500 bp (קידוד חלק מ - sma-10). שתי הש...

Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA at JoVE.com

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

מוצג כאן תיאור של הבידוד הישיר והמהיר יחסית של דנ"א גנומי של Caenorhabditis elegans מבעל חיים אחד או כמה בעלי חיים באמצעות ערכת רקמה זמינה מסחרית. הכנת ה-gDNA המתקבלת היא תבנית מתאימה ל-PCR.

מיצוי בקנה מידה קטן של Caenorhabditis elegans דנ"א גנומי

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...

פיתחנו שיטה קלה, מהירה וחסכונית לחילוץ דנ"א גנומי של C.elegans שעובדת נהדר עבור יישומי כיתה ומחקר. ניתן להשתמש בפרוטוקולים אלה באופן אמין כדי לייצר במהירות תבניות דנ"א מדגימה אחת או קטנה של C.elegance עבור יישומים מבוססי PCR. משתמשים שאין להם ניסיון בקטיף תולעים או בשימוש במיקרו-פיפטר עשויים להתקשות בשלבים הדורשים מיומנויות אלה.צפייה במתרגל מיומן ותרגול עשויים לעזור. מי שידגים את הנוהל יהיה פרחאן לקדאוולה, סטודנט בכיר לתואר שני מהמעבדה שלי. לצורך חילוץ דנ"א מתולעת Caenorhabditis elegans אחת, ראשית, קבעו את תוכנית הליזיס המורכבת ממחזור אחד בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות בתרמוציקלר.כדי להכין את תמיסת הליזיס, ראשית, הוסיפו 0.8 מיקרוליטרים של תמיסת מיצוי מהקיט לקיר הפנימי של צינור PCR 0.2 מיליליטר על קרח. לאחר מכן מוסיפים 0.2 מיקרוליטרים של תמיסת הכנת רקמות מהערכה לטיפת תמיסת המיצוי ומערבבים על ידי ליטוף. עם בחירת תולעת למיצוי דנ"א, ראשית, זהה בעל חיים L4 או בעל חיים בוגר תחת מיקרוסקופ ניתוח.ניתן לזהות הרמפרודיט L4 על ידי פות אופייני הנראה כחצי עיגול חיוור במרכז החיה. כדי לזהות הרמפרודיט בוגר, בחר את אחת מהחיות הגדולות ביותר בצלחת שעשויות להיות להן עוברים סגלגלים הנראים ברחם שלה. לאחר מכן, באמצעות בחירת חוט פלטינה, להעביר את החיה שנבחרה לתמיסה.כדי לאסוף את התוכן בתחתית הצינור, צנטריפוגה של הצינור במשך שתיים עד שלוש שניות ב 2000 x g בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הניחו את הצינור בתרמוציפלר, והריצו את תוכנית הליזיס שנקבעה קודם לכן. לאחר שתוכנית ליזיס זו מסתיימת, צנטריפוגה קצרה של הצינור והניחו אותו על הקרח.לאחר מכן הוסיפו 0.8 מיקרוליטרים של תמיסת נטרול מהערכה וערבבו על ידי צנרת. שוב, צנטריפוגה של הצינור במשך שתיים עד שלוש שניות ב 2000 x g בטמפרטורת החדר. אם לא נעשה שימוש מיידי בליזאט, אחסן את הצינור בארבע מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.כדי לחלץ דנ"א מתולעים בודדות גם, ראשית, קבעו את תוכנית הליזיס של מחזור אחד ב-55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות בתרמוציקלר. לאחר מכן להכין את תמיסת lysis על ידי הוספת שני microliters של תמיסת המיצוי מן הערכה על הקיר הפנימי של צינור PCR 0.2 מיליליטר על קרח, ולאחר מכן תוספת של 0.5 microliters של תמיסת הכנת הרקמה מן הערכה טיפה של תמיסת מיצוי, ולאחר מכן לערבב את התוכן על ידי pipetting. לאחר זיהוי L4 או בעלי חיים בוגרים, השתמש בחוט פלטינה כדי להעביר מספר מספיק של בעלי חיים לתמיסה.לאחר מכן, צנטריפוגה של הצינור למשך שתיים עד שלוש שניות בטמפרטורה של 2000 x g בטמפרטורת החדר, ואז למקם את הצינור בתרמוציפלר ולהפעיל את תוכנית הליזיס שנקבעה בעבר. לאחר סיום התוכנית, צנטריפוגה לזמן קצר את הצינור ולהניח אותו על קרח. לאחר מכן מוסיפים שני מיקרוליטרים של תמיסת הנטרול מהערכה לצינור ומעורבבים על ידי צנרת.שוב, צנטריפוגה של הצינור במשך שתיים עד שלוש שניות ב 2000 x g בטמפרטורת החדר. אם לא נעשה שימוש מיידי, אחסן את הליזאט בארבע מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. הדנ"א הגנומי שחולץ על ידי הפרוטוקול יכול לשמש בהצלחה כתבנית PCR, הן הערכה המסחרית והן שיטת הפרוטאינאז K המסורתית ייצרו דנ"א עם רמות דומות של הגברת PCR של מוצר זוג בסיסים 2100 ומוצר זוג בסיסים של 500.שיטת הערכה לתזת DNA סיפקה גם תבניות PCR יעילות למגוון אנזימי פולימראז DNA. אפילו בדילולים שונים, הדנ"א שחולץ מבעל חיים יחיד על ידי הערכה המסחרית תמך בהגברת PCR של מקטע דנ"א זוגי של 2100 בסיסים עם יעילות שווה ערך. עם זאת, ההגברה של מקטע דנ"א של זוג בסיסים בן 500 בסיסים השתנתה בהתאם לריכוז התבנית.התאמתו של הדנ"א המופק מבעל חיים יחיד או מבעלי חיים מרובים כתבנית PCR לקביעת הגנוטיפ הודגמה עוד יותר על ידי הגברה מוצלחת של גן והווריאנט המוטנטי שלו. מכיוון שפרוטוקול זה כולל צנרת של נפח קטן של ריאגנטים, כדי להבטיח עקביות, השתמש בתערובת מאסטר לתגובות מרובות, טכניקת צנרת טובה ופיפטות מכויילות היטב. כמו כן, סיבוב התוכן של הצינור מבטיח ליזיס תקין.ניתן היה להגדיל את השיטה הזו, להתאים אותה למיצוי הדנ"א הגנומי של C.elegans עבור יישומים אחרים במורד הזרם, וניתן להשתמש בה כדי לחלץ דנ"א ממיני נמטודות אחרים. בהתחשב בפשטות, במהירות, בחוסן ובעלויות הנמוכות של הפרוטוקול, הוא מתאים היטב הן ליישומי מחקר והן ליישומים בכיתה שבהם הזמן והמשאבים מוגבלים.

Research

JoVE Journal

Biology

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

בידוד של הדנ&quot;א הגנומי של זנבות עכבר

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

בידוד במבחנה הפעלת Caenorhabditis elegans זרע

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

הגנום MRI - משאב ציבורי עבור לימוד דפוסי בתוך רצף הדנ&quot;א הגנומי

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

בידוד ערפדים של נוזלים מתאיים<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

לכידה סלקטיבית של 5-hydroxymethylcytosine מהדנ&quot;א הגנומי

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

הפקה וניתוח בפרוסטגלנדין<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

מדידה של קצב הצריכה של חמצן בשלם Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...