Name: small-scale extraction of caenorhabditis elegans genomic dna
Uploaded: 2022-06-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA at JoVE.com

एन 2 तनाव और ई कोलाई ओपी 50 बैक्टीरिया कैनोरहाब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर (सीजीसी) से प्राप्त किए गए थे, जिसे एनआईएच ऑफिस ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम्स (पी 40 ओडी 010440) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। ब्लम्प -1 (टीएम 548) तनाव राष्ट्रीय जैव संसाधन परियोजना, जापान से प्राप्त किया गया था। लेखक वर्मबेस को धन्यवाद देते हैं। इस काम को एनआईएच आर 01 जीएम 097591 द्वारा टीएलजी, टेक्सास वुमन यूनिवर्सिटी द्वारा टीएलजी को आंतरिक वित्त पोषण और टीडब्ल्यूयू के छात्र अनुसंधान केंद्र द्वारा एमएफएल में समर्थित किया गया था।

1. सी एलिगेंस रखरखाव
नोट: एन 2 (जंगली प्रकार) और ब्लम्प -1 (टीएम 548) सी एलिगेंस उपभेदों को 20 डिग्री सेल्सियस पर मानक निमेटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम) प्लेटों पर बनाए रखा गया था।
<ol><li>2 एल फ्ला?...

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+window+into+biology:+A+on+Caenorhabditis+elegans.">A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. 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Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin Available from: <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf</a> (2013)</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).</li><li>Gumienny, T. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bow-tie+genetic+architecture+for+morphogenesis+suggested+by+a+genome-wide+RNAi+screen+in+Caenorhabditis+elegans.">A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).</li><li>Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLMP-1+contributes+to+collagen-related+morphogenesis+in+C.+elegans.">BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans.</a> Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).</li><li>Horn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRE-1/FBXO11-dependent+degradation+of+BLMP-1/BLIMP-1+governs+C.+elegans+developmental+timing+and+maturation.">DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation.</a> Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).</li><li>Huang, T. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLMP-1/Blimp-1+regulates+the+spatiotemporal+cell+migration+pattern+in+C.+elegans.">BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).</li><li>Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+interactions+between+the+DBL-1/BMP-like+pathway+and+dpy+body+size-associated+genes+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).</li><li>Madeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EMBL-EBI+search+and+sequence+analysis+tools+APIs+in+2019.">The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019.</a> Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).</li></ol>

सी एलिगेंस के जीनोटाइप का निर्धारण करना एक महत्वपूर्ण कदम है जबकि नए सी एलिगेंस उपभेदों को बनाने के लिए आनुवंशिक क्रॉस का प्रदर्शन करना। एक या कुछ सी एलिगेंस का उपयोग करके जीनोमिक डीएनए निष?...

यहां, पीसीआर-आधारित अनुप्रयोगों के लिए डीएनए को सुलभ बनाने के लिए कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस के लाइसिस के लिए दो संबंधित प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए गए हैं। पीसीआर एक आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली आणविक तकनीक है जिसका उपयोग कई अनुप्रयोगों के लिए किया जाता है, जिसमें क्लोनिंग और अनुक्रमण के लिए जीनोटाइपिंग और डीएनए टुकड़ों को बढ़ाना शामिल है। छोटे (1 मिमी), मुक्त रहने वाले राउंडवर्म सी एलिगेंस जैविक अनुसंधान के लिए एक लोकप्रिय पशु प्रणाली है। एक एकल जानवर या कुछ जानवरों से उपयुक्त जीनोमिक डीएनए प्राप्त करना पीसीआर द्वारा अनुक्रम को बढ़ाने के लिए पर्याप्त है। देर से एल 4 लार्वा और वयस्कों में केवल ~ 1,000 दैहिक कोशिकाएं (कुछ बहु-परमाणु, पॉलीप्लोइड कोशिकाएं सहित), रोगाणु कोशिकाएं, और (यदि जानवर एक गुरुत्वाकर्षण हर्माफ्रोडाइट है) गर्भाशय1 में संतान होती है। हालांकि, इन जानवरों को एक छल्ली द्वारा संरक्षित किया जाता है जिसे जीनोमिक डीएनए2 निकालने के लिए बाधित किया जाना चाहिए। पीसीआर के लिए निमेटोड जीनोमिक डीएनए टेम्पलेट तैयार करने के लिए मानक तरीकों में कई कदम शामिल हैं और कई घंटे लगते हैं। जानवरों को पहले कम से कम 15-45 मिनट (कुछ प्रोटोकॉल द्वारा अनुशंसित है) 3,4,5,6 के लिए प्रोटीनेस के (-70 डिग्री सेल्सियस या नीचे) युक्त कृमि लिसिस बफर में जमे हुए हैं। यह कदम दरारें जानवरों को खोलती हैं।
ठंड के बाद, जानवरों को प्रोटीनेज के काम करने के लिए 60-65 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया जाता है, फिर एंजाइम को 95 डिग्री सेल्सियस पर 15-30 मिनट के लिए निष्क्रिय कर दिया जाता है। प्रोटीनेज के डीएनए को नीचा दिखाने वाले न्यूक्लीज को नष्ट कर देता है। पीसीआर से पहले प्रोटीनेज के की निष्क्रियता प्रोटीनेज के को डीएनए पोलीमरेज़ को नीचा दिखाने से रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। यहां वर्णित दो किट-आधारित प्रोटोकॉल रोजमर्रा के अनुसंधान और शिक्षण प्रयोगशाला अनुप्रयोगों के लिए एक ही जानवर या कुछ नेमाटोड से जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए त्वरित, विश्वसनीय और लागत प्रभावी तरीके हैं। उपयोग की जाने वाली किट मूल रूप से पशु ऊतक, लार और बाल7 से डीएनए निकालने के लिए निर्माता द्वारा अनुकूलित की गई थी। यह लाइस कोशिकाओं के लिए एक मालिकाना ऊतक तैयारी समाधान और निष्कर्षण समाधान का उपयोग करता है और जीनोमिक डीएनए को सुलभ बनाता है। एक मालिकाना तटस्थीकरण समाधान तब उन घटकों को बेअसर करता है जो पीसीआर (जैसे, लवण, आयन, और एमजी2 + -बाध्यकारी अणुओं) को बाधित कर सकते हैं।
जीनोटाइपिंग करते समय, एक एकल जानवर का परीक्षण किया जा सकता है। यह निर्धारित करते समय कि क्या एक तनाव होमोजाइगस है, एक ही जानवर से छह या अधिक संतानों का परीक्षण करने से उच्च आत्मविश्वास मिलता है कि एक रेखा होमोजाइगस है या नहीं (विषमयुग्मजी माता-पिता [(1/4)6 × 100% = 0.02%] से बेतरतीब ढंग से छह होमोजाइगस उत्परिवर्ती संतान को चुनने का 0.02% मौका है)। यह विधि 1) प्रोटीनेज के विधि की तुलना में कम चरणों के साथ सरल है, और 2) टेम्पलेट तैयारी के समय को 15 मिनट तक कम कर देता है। इस काम के परिणाम दर्शाते हैं कि विकसित प्रोटोकॉल एकल या कुछ कीड़े से जीनोमिक डीएनए निकालने में मजबूती से काम करता है, जिसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए मज़बूती से उपयोग किया जा सकता है जिन्हें पीसीआर सहित अत्यधिक शुद्ध डीएनए की आवश्यकता नहीं होती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>autoclave tape</td>
			<td>Defend</td>
			<td>43237-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aluminium foil, heavy duty</td>
			<td>Reynolds Wrap</td>
			<td>2182934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>102382 (CAS 10035-04-8)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>XNAT2-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp hotplate/stirrer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-100-495H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media, Lennox, capsules</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>3002-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC413485000 (CAS 7487-88-9)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>Labnet International, Inc.</td>
			<td>PrismR, C2500-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>M0515S</td>
			<td>&#34;Pol E&#34; used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20&#8211;30 s/kb)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM media powder</td>
			<td>US Biological Life Sciences</td>
			<td>N1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>&#34;Pol D&#34; in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15&#8211;30 s/kb)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom DNA oligos</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL polymerase</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>R050B</td>
			<td>&#34;Pol C&#34; in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1&#8211;10.0 kb)</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>N0550S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SapphireAmp Fast PCR Master Mix</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR350A</td>
			<td>&#34;Pol A&#34; in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>P4600</td>
			<td>&#34;Pol B&#34; in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A24812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>worm pick</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale extraction of caenorhabditis elegans genomic dna

एकल या कुछ कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस से जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण में कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग हैं, जिनमें जीनोटाइपिंग लाइनों, क्लोनिंग और अनुक्रमण के लिए पीसीआर शामिल है। सी एलिगेंस से जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के लिए पारंपरिक प्रोटीनेज के-आधारित तरीकों में कई घंटे लगते हैं । वाणिज्यिक निष्कर्षण किट जो प्रभावी रूप से सी एलिगेंस छल्ली को तोड़ते हैं और जीनोमिक डीएनए निकालते हैं, सीमित हैं। एलिगेंस जीनोमिक डीएनए निकालने की एक आसान, तेज (~ 15 मिनट), और लागत कुशल विधि जो कक्षा और अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए अच्छी तरह से काम करती है, यहां बताई गई है। इस डीएनए निष्कर्षण विधि को पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए एक विश्वसनीय टेम्पलेट प्राप्त करने के लिए प्रारंभिक सामग्री के रूप में एकल या कुछ देर से लार्वा (एल 4) या वयस्क नेमाटोड का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया गया है। परिणामों से संकेत मिलता है कि डीएनए गुणवत्ता पीसीआर द्वारा विभिन्न आकारों के जीन लक्ष्यों को बढ़ाने के लिए उपयुक्त है, जो प्रति प्रतिक्रिया एक वयस्क से जीनोमिक डीएनए के एक-पचासवें हिस्से में कमजोर पड़ने पर भी एकल या कुछ जानवरों के जीनोटाइपिंग की अनुमति देता है। रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल का उपयोग पीसीआर-आधारित अनुप्रयोगों के लिए सी एलिगेंस के एकल या एक छोटे से नमूने से डीएनए टेम्पलेट को जल्दी से उत्पादन करने के लिए मज़बूती से किया जा सकता है।

इन दो विधियों की प्रभावकारिता की तुलना करने के लिए वाणिज्यिक किट या पारंपरिक लाइसिस प्रोटोकॉल का उपयोग करके एकल या कुछ जंगली प्रकार के वयस्कों से जीनोमिक डीएनए निकाला गया था। इन लाइसेट्स का उपयोग तब प...

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Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

यहां प्रस्तुत व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ऊतक किट का उपयोग करके एक या कुछ जानवरों से कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस जीनोमिक डीएनए के सीधे और अपेक्षाकृत तेजी से अलगाव का वर्णन है। परिणामी जीडीएनए तैयारी पीसीआर के लिए एक उपयुक्त टेम्पलेट है।

कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस जीनोमिक डीएनए के छोटे पैमाने पर निष्कर्षण

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...

हमने सी एलिगेंस जीनोमिक डीएनए निकालने की एक आसान, तेज और लागत कुशल विधि विकसित की है जो कक्षा और अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए बहुत अच्छा काम करती है। इन प्रोटोकॉल का उपयोग पीसीआर आधारित अनुप्रयोगों के लिए सी.लालित्य के एक या एक छोटे से नमूने से डीएनए टेम्पलेट्स को जल्दी से उत्पादन करने के लिए मज़बूती से किया जा सकता है। जिन उपयोगकर्ताओं के पास कीड़े चुनने या माइक्रोपिपेटर का उपयोग करने का अनुभव नहीं है, वे इन कौशलों की आवश्यकता वाले चरणों के साथ संघर्ष कर सकते हैं।एक कुशल व्यवसायी को देखने और अभ्यास करने से मदद मिल सकती है। प्रक्रिया का प्रदर्शन फरहान लकड़ावाला होगा, जो मेरी प्रयोगशाला से एक वरिष्ठ स्नातक छात्र हैं। एक एकल कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस कीड़े से डीएनए निकालने के लिए, सबसे पहले, थर्मोसाइकिलर में तीन मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के बाद 10 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर एक चक्र से युक्त लाइसिस कार्यक्रम सेट करें।लाइसिस समाधान तैयार करने के लिए, सबसे पहले, बर्फ पर 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब की अंदर की दीवार पर किट से निष्कर्षण समाधान के 0.8 माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर निष्कर्षण समाधान की बूंद के लिए किट से ऊतक तैयारी समाधान के 0.2 माइक्रोलीटर जोड़ें और पेटिंग द्वारा मिश्रण। डीएनए निष्कर्षण के लिए एक कीड़ा के चयन के साथ, सबसे पहले, एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक एल 4 या वयस्क जानवर की पहचान करें।एक एल 4 हर्माफ्रोडाइट को एक विशेषता वल्वा द्वारा पहचाना जा सकता है जो जानवर के बीच में एक पीला आधा सर्कल के रूप में दिखाई देता है। एक वयस्क हेर्मैफ्रोडाइट की पहचान करने के लिए, प्लेट पर सबसे बड़े जानवरों में से एक का चयन करें जिसके गर्भाशय में अंडाकार भ्रूण दिखाई दे सकते हैं। इसके बाद, प्लैटिनम तार पिक का उपयोग करके, चयनित जानवर को समाधान में स्थानांतरित करें।ट्यूब के तल पर सामग्री एकत्र करने के लिए, कमरे के तापमान पर 2000 एक्स जी पर दो से तीन सेकंड के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र। फिर ट्यूब को थर्मोसाइक्लर में रखें, और पहले सेट किए गए लाइसिस प्रोग्राम को चलाएं। इस लिसिस कार्यक्रम के खत्म होने के बाद, संक्षेप में ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें और इसे बर्फ पर रखें।फिर किट से तटस्थीकरण समाधान के 0.8 माइक्रोलीटर जोड़ें और पाइपिंग करके मिलाएं। फिर से, कमरे के तापमान पर 2000 एक्स जी पर दो से तीन सेकंड के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र। यदि लाइसेट का तुरंत उपयोग नहीं किया जाता है, तो भविष्य के उपयोग के लिए ट्यूब को चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।एक व्यक्तिगत कीड़े से डीएनए निकालने के लिए, सबसे पहले, एक चक्र के लिसिस कार्यक्रम को 10 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, इसके बाद थर्मोसाइक्लर में तीन मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस। इसके बाद बर्फ पर 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब की अंदर की दीवार पर किट से निष्कर्षण समाधान के दो माइक्रोलीटर जोड़कर लिसिस समाधान तैयार करें, इसके बाद किट से ऊतक तैयारी समाधान के 0.5 माइक्रोलीटर के अलावा निष्कर्षण समाधान की बूंद तक, फिर सामग्री को पाइप करके मिलाएं। एल 4 या वयस्क जानवरों की पहचान करने के बाद, समाधान में पर्याप्त संख्या में जानवरों को स्थानांतरित करने के लिए प्लैटिनम तार पिक का उपयोग करें।इसके बाद, कमरे के तापमान पर 2000 एक्स जी पर दो से तीन सेकंड के लिए ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें, फिर ट्यूब को थर्मोसाइकलर में रखें और पहले से निर्धारित लाइसिस प्रोग्राम चलाएं। कार्यक्रम के पूरा होने के बाद, संक्षेप में ट्यूब अपकेंद्रित्र और इसे बर्फ पर रखें। फिर किट से ट्यूब में तटस्थता समाधान के दो माइक्रोलीटर जोड़ें और पाइपिंग द्वारा मिश्रित करें।फिर से, कमरे के तापमान पर 2000 एक्स जी पर दो से तीन सेकंड के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र। यदि तुरंत उपयोग नहीं किया जाता है, तो भविष्य के उपयोग के लिए लाइसेट को चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। प्रोटोकॉल द्वारा निकाले गए जीनोमिक डीएनए को पीसीआर टेम्पलेट के रूप में सफलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है, वाणिज्यिक किट और पारंपरिक प्रोटीनेस के विधि दोनों ने 2100 बेस जोड़ी उत्पाद और 500 बेस जोड़ी उत्पाद के पीसीआर प्रवर्धन के समान स्तर के साथ डीएनए का उत्पादन किया।डीएनए लाइसिस के लिए किट विधि ने विभिन्न प्रकार के डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइमों के लिए प्रभावी पीसीआर टेम्पलेट्स भी प्रदान किए। यहां तक कि विभिन्न कमजोर पड़ने पर, वाणिज्यिक किट द्वारा एक ही जानवर से निकाले गए डीएनए ने समकक्ष दक्षता के साथ 2100 आधार जोड़ी डीएनए टुकड़े के पीसीआर प्रवर्धन का समर्थन किया। हालांकि, एक 500 आधार जोड़ी डीएनए टुकड़ा का प्रवर्धन टेम्पलेट एकाग्रता के साथ भिन्न होता है।जीनोटाइप का निर्धारण करने के लिए पीसीआर टेम्पलेट के रूप में एक एकल जानवर से या कई जानवरों से निकाले गए डीएनए की उपयुक्तता को जीन के सफल प्रवर्धन और इसके उत्परिवर्तित संस्करण द्वारा आगे प्रदर्शित किया गया था। चूंकि इस प्रोटोकॉल में अभिकर्मकों की छोटी मात्रा को पाइप करना शामिल है, स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए, कई प्रतिक्रियाओं, अच्छी पाइपिंग तकनीक और अच्छी तरह से कैलिब्रेटेड पिपेट के लिए एक मास्टर मिश्रण का उपयोग करें। इसके अलावा, ट्यूब की सामग्री को कताई उचित लाइसिस सुनिश्चित करती है।इस विधि को बढ़ाया जा सकता है, अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए सी एलिगेंस जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और इसका उपयोग अन्य निमेटोड प्रजातियों से डीएनए निकालने के लिए किया जा सकता है। प्रोटोकॉल की सादगी, गति, मजबूती और कम लागत को देखते हुए, यह अनुसंधान और कक्षा अनुप्रयोगों दोनों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है जहां समय और संसाधन सीमित हैं।

Research

JoVE Journal

Biology

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

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जीनोमिक डीएनए के माउस पूंछ से अलगाव

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

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जीनोमिक एमआरआई - जीनोमिक डीएनए के भीतर अनुक्रम पैटर्न के अध्ययन के लिए एक सार्वजनिक संसाधन

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

पैशाचिक कोशिकेतर द्रव से अलगाव<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

बुनियादी<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</em&gt; तरीके तुल्यकालन और निरीक्षण:

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

जीनोमिक डीएनए से 5-hydroxymethylcytosine के चुनिंदा कब्जा

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

में प्रोस्टाग्लैंडीन निष्कर्षण और विश्लेषण<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

रेट्रोवायरल एकता स्थलों की प्रवर्धन, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण, और जीनोमिक डीएनए का मिलान

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

अक्षुण्ण केनोहाब्दितिस एलीगेंस में ऑक्सीजन उपभोग दरों का मापन

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...