Name: small-scale extraction of caenorhabditis elegans genomic dna
Uploaded: 2022-06-07T13:00:00
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La cepa N2 y la bacteria E. coli OP50 se obtuvieron del Centro de Genética Caenorhabditis (CGC), que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). La cepa blmp-1(tm548) se obtuvo del National Bioresource Project, Japón. Los autores agradecen a WormBase. Este trabajo fue apoyado por NIH R01GM097591 a T.L.G., financiamiento interno de Texas Woman's University a T.L.G, y el Centro de Investigación Estudiantil de TWU a M.F.L.

1. Mantenimiento de C. elegans
NOTA: Las cepas N2 (tipo salvaje) y blmp-1(tm548) C. elegans se mantuvieron en placas estándar de medios de crecimiento de nematodos (NGM) a 20 °C.
<ol><li>Preparar placas NGM disolviendo 23.005 g de polvo NGM en 973 mL de agua en un matraz de 2 L. Cubra la abertura del matraz con papel de aluminio (o tapa autoclavable que permite la ventilación) y asegure la cubierta con cinta de autoclave. Autoclave para disolver el polvo...

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+window+into+biology:+A+on+Caenorhabditis+elegans.">A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bow-tie+genetic+architecture+for+morphogenesis+suggested+by+a+genome-wide+RNAi+screen+in+Caenorhabditis+elegans.">A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).</li><li>Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLMP-1+contributes+to+collagen-related+morphogenesis+in+C.+elegans.">BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans.</a> Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).</li><li>Horn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRE-1/FBXO11-dependent+degradation+of+BLMP-1/BLIMP-1+governs+C.+elegans+developmental+timing+and+maturation.">DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation.</a> Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).</li><li>Huang, T. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLMP-1/Blimp-1+regulates+the+spatiotemporal+cell+migration+pattern+in+C.+elegans.">BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).</li><li>Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+interactions+between+the+DBL-1/BMP-like+pathway+and+dpy+body+size-associated+genes+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).</li><li>Madeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EMBL-EBI+search+and+sequence+analysis+tools+APIs+in+2019.">The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019.</a> Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).</li></ol>

Determinar los genotipos de C. elegans es un paso importante al realizar cruces genéticos para crear nuevas cepas de C. elegans . La extracción de ADN genómico utilizando uno o pocos C. elegans es un paso crucial en el genotipado de C. elegans. Este protocolo describe la extracción de ADN genómico de C. elegans utilizando un kit comercial. Este método es rápido y funciona de manera robusta. El ADN genómico extraído utilizando este método se puede utilizar para aplica...

Aquí, se presentan dos protocolos relacionados para la lisis de Caenorhabditis elegans para hacer que el ADN sea accesible para aplicaciones basadas en PCR. La PCR es una técnica molecular de uso común utilizada para muchas aplicaciones, incluyendo el genotipado y la amplificación de fragmentos de ADN para clonación y secuenciación, entre otras. El pequeño (1 mm) gusano redondo de vida libre C. elegans es un sistema animal popular para la investigación biológica. La obtención de ADN genómico adecuado de un solo animal o de unos pocos animales es suficiente para amplificar la secuencia mediante PCR. Las larvas y adultos L4 tardíos contienen solo ~ 1,000 células somáticas (incluidas algunas células poliploides multinucleares), células germinales y (si el animal es un hermafrodita grávido) descendencia en el útero1. Sin embargo, estos animales están protegidos por una cutícula que debe ser interrumpida para extraer el ADN genómico2. Los métodos estándar para preparar la plantilla de ADN genómico de nematodos para PCR implican múltiples pasos y toman varias horas. Los animales se congelan primero en tampón de lisis de lombrices que contiene proteinasa K (-70 °C o menos) durante al menos 15-45 min (algunos protocolos recomiendan más tiempo)3,4,5,6. Este paso abre los animales.
Después de la congelación, los animales se incuban durante 1 h a 60-65 ° C para que la proteinasa K funcione, luego la enzima se inactiva durante 15-30 min a 95 ° C. La proteinasa K destruye las nucleasas que degradan el ADN. La inactivación de la proteinasa K antes de la PCR es importante para evitar que la proteinasa K degrade la ADN polimerasa. Los dos protocolos basados en kits descritos aquí son métodos rápidos, confiables y rentables para extraer ADN genómico de un solo animal o de unos pocos nematodos para aplicaciones diarias de laboratorio de investigación y enseñanza. El kit utilizado fue optimizado originalmente por el fabricante para extraer ADN de tejido animal, saliva y cabello7. Utiliza una solución patentada de preparación de tejidos y una solución de extracción para lisar las células y hacer que el ADN genómico sea accesible. Una solución de neutralización patentada neutraliza los componentes que pueden inhibir la PCR (por ejemplo, sales, iones y moléculas de unión a Mg2+).
Al genotipar, se puede probar un solo animal. Al determinar si una cepa es homocigota, la prueba de seis o más crías de un solo animal da una gran confianza en que una línea es homocigota o no (hay una probabilidad del 0,02% de elegir al azar seis progenies mutantes homocigotas de un padre heterocigoto [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Este método 1) es sencillo, con menos pasos que el método de la proteinasa K, y 2) disminuye el tiempo de preparación de la plantilla a 15 min. Los resultados de este trabajo demuestran que el protocolo desarrollado funciona de manera robusta en la extracción de ADN genómico de uno o varios gusanos, que se pueden usar de manera confiable para aplicaciones posteriores que no requieren ADN altamente purificado, incluida la PCR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>autoclave tape</td>
			<td>Defend</td>
			<td>43237-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aluminium foil, heavy duty</td>
			<td>Reynolds Wrap</td>
			<td>2182934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>102382 (CAS 10035-04-8)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>XNAT2-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp hotplate/stirrer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-100-495H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media, Lennox, capsules</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>3002-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC413485000 (CAS 7487-88-9)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>Labnet International, Inc.</td>
			<td>PrismR, C2500-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>M0515S</td>
			<td>&#34;Pol E&#34; used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20&#8211;30 s/kb)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM media powder</td>
			<td>US Biological Life Sciences</td>
			<td>N1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>&#34;Pol D&#34; in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15&#8211;30 s/kb)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom DNA oligos</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL polymerase</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>R050B</td>
			<td>&#34;Pol C&#34; in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1&#8211;10.0 kb)</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>N0550S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SapphireAmp Fast PCR Master Mix</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>RR350A</td>
			<td>&#34;Pol A&#34; in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>P4600</td>
			<td>&#34;Pol B&#34; in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A24812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>worm pick</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale extraction of caenorhabditis elegans genomic dna

La extracción de ADN genómico de uno o unos pocos Caenorhabditis elegans tiene muchas aplicaciones posteriores, incluida la PCR para líneas de genotipado, clonación y secuenciación. Los métodos tradicionales basados en la proteinasa K para la extracción de ADN genómico de C. elegans tardan varias horas. Los kits de extracción comerciales que rompen efectivamente la cutícula de C. elegans y extraen ADN genómico son limitados. Aquí se informa un método fácil, más rápido (~ 15 min) y rentable de extracción de ADN genómico de C. elegans que funciona bien para aplicaciones en el aula y la investigación. Este método de extracción de ADN está optimizado para utilizar nematodos monolarvales tardíos (L4) o adultos como material de partida para obtener una plantilla confiable para realizar PCR. Los resultados indican que la calidad del ADN es adecuada para amplificar objetivos genéticos de diferentes tamaños mediante PCR, lo que permite el genotipado de uno o varios animales incluso en diluciones a una quincuagésima parte del ADN genómico de un solo adulto por reacción. Los protocolos informados se pueden utilizar de manera confiable para producir rápidamente una plantilla de ADN a partir de una sola o una pequeña muestra de C. elegans para aplicaciones basadas en PCR.

El ADN genómico de uno o varios adultos de tipo salvaje se extrajo utilizando el kit comercial o el protocolo de lisis tradicional para comparar la eficacia de estos dos métodos. Estos lisados se utilizaron como plantillas para PCR para amplificar un objetivo más grande de ~ 2,100 bp (codificación blmp-1) o un objetivo más pequeño de ~ 500 bp (codificando una parte de sma-10). Ambos métodos produjeron con éxito productos de PCR apropiados (Figura 1A).
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Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Aquí se presenta una descripción del aislamiento directo y relativamente rápido del ADN genómico de Caenorhabditis elegans de uno o unos pocos animales utilizando un kit de tejido disponible comercialmente. La preparación de gDNA resultante es una plantilla adecuada para PCR.

Extracción a pequeña escala de ADN genómico de Caenorhabditis elegans

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...

Hemos desarrollado un método fácil, rápido y rentable de extracción de ADN genómico de C.elegans que funciona muy bien para aplicaciones en el aula y en la investigación. Estos protocolos se pueden utilizar de manera confiable para producir rápidamente plantillas de ADN a partir de una sola o una pequeña muestra de C.elegance para aplicaciones basadas en PCR. Los usuarios que no tienen experiencia en la selección de gusanos o el uso de un micropipetador pueden tener dificultades con los pasos que requieren estas habilidades.Observar a un practicante experto y practicar puede ayudar. Demostrando el procedimiento estará Farhan Lakdawala, un estudiante graduado de último año de mi laboratorio. Para extraer ADN de un solo gusano Caenorhabditis elegans, primero, establezca el programa de lisis que consiste en un ciclo a 55 grados Celsius durante 10 minutos seguido de 95 grados Celsius durante tres minutos en un termociclador.Para preparar la solución de lisis, primero, agregue 0.8 microlitros de solución de extracción del kit a la pared interior de un tubo de PCR de 0.2 mililitros sobre hielo. Luego agregue 0.2 microlitros de solución de preparación de tejido del kit a la gota de la solución de extracción y mezcle acariciando. Con la selección de un gusano para la extracción de ADN, primero, identifique un L4 o un animal adulto bajo un microscopio de disección.Un hermafrodita L4 se puede identificar por una vulva característica que es visible como un semicírculo pálido en el medio del animal. Para identificar un hermafrodita adulto, seleccione uno de los animales más grandes en la placa que pueda tener embriones ovalados visibles en su útero. A continuación, utilizando una selección de alambre de platino, transfiera el animal seleccionado a la solución.Para recoger el contenido en la parte inferior del tubo, centrífique el tubo durante dos o tres segundos a 2000 x g a temperatura ambiente. Luego coloque el tubo en el termociclador y ejecute el programa de lisis establecido anteriormente. Después de que termine este programa de lisis, centrífique brevemente el tubo y póngalo en hielo.Luego agregue 0.8 microlitros de solución de neutralización del kit y mezcle mediante pipeteo. Una vez más, centrifugue el tubo durante dos o tres segundos a 2000 x g a temperatura ambiente. Si el lisado no se usa inmediatamente, guarde el tubo a cuatro grados Celsius para su uso futuro.Para extraer ADN de un gusano individual también, primero, establezca el programa de lisis de un ciclo a 55 grados Celsius durante 10 minutos seguido de 95 grados Celsius durante tres minutos en un termociclador. A continuación, prepare la solución de lisis agregando primero dos microlitros de la solución de extracción del kit en la pared interior de un tubo de PCR de 0,2 mililitros sobre hielo, seguido de la adición de 0,5 microlitros de la solución de preparación de tejidos del kit a la gota de la solución de extracción, luego mezcle el contenido mediante pipeteo. Después de identificar L4 o animales adultos, use una selección de alambre de platino para transferir un número adecuado de animales a la solución.A continuación, centrifugue el tubo durante dos o tres segundos a 2000 x g a temperatura ambiente, luego coloque el tubo en el termociclador y ejecute el programa de lisis previamente establecido. Después de completar el programa, centrífique brevemente el tubo y colóquelo sobre hielo. Luego agregue dos microlitros de la solución de neutralización del kit al tubo y mezcle mediante pipeteo.Una vez más, centrifugue el tubo durante dos o tres segundos a 2000 x g a temperatura ambiente. Si no se usa inmediatamente, guarde el lisado a cuatro grados Celsius para su uso futuro. El ADN genómico extraído por el protocolo podría usarse con éxito como una plantilla de PCR, tanto el kit comercial como el método tradicional de proteinasa K produjeron ADN con niveles similares de amplificación de PCR de un producto de par de bases 2100 y un producto de par base 500.El método del kit para la lisis del ADN también proporcionó plantillas de PCR efectivas para una variedad de enzimas adn polimerasas. Incluso en diferentes diluciones, el ADN extraído de un solo animal por el kit comercial apoyó la amplificación por PCR de un fragmento de ADN de 2100 pares de bases con una eficiencia equivalente. Sin embargo, la amplificación de un fragmento de ADN de 500 pares de bases varió con la concentración de la plantilla.La idoneidad del ADN extraído de un solo animal o de múltiples animales como plantilla de PCR para determinar el genotipo se demostró aún más mediante la amplificación exitosa de un gen y su variante mutada. Como este protocolo implica pipetear un pequeño volumen de reactivos, para garantizar la consistencia, use una mezcla maestra para múltiples reacciones, una buena técnica de tuberías y pipetas bien calibradas. Además, girar hacia abajo el contenido del tubo garantiza una lisis adecuada.Este método podría ampliarse, adaptarse para extraer ADN genómico de C.elegans para otras aplicaciones posteriores, y podría usarse para extraer ADN de otras especies de nematodos. Dada la simplicidad, velocidad, robustez y bajo costo del protocolo, es muy adecuado tanto para aplicaciones de investigación como de aula donde el tiempo y los recursos son limitados.

Research

JoVE Journal

Biology

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