Detta protokoll möjliggör kvantifiering av lipiddroppar och analys av deras morfologi och subcellulära fördelning på ett fibertypspecifikt sätt. Denna teknik möjliggör samtidig bearbetning av olika muskler, vilket sparar tid och undviker artefakter som kan uppstå när de bearbetas oberoende. Det tillåter också automatisering av kvantifiering av lipiddroppar.
Myosteatos bedömdes i marina muskler, men detta protokoll kunde översättas till människor under olika tillstånd, såsom fetma, åldrande och cancer. Att känna igen samma fibrer i parallell sektion kan vara svårt, men anmärkningsvärda strukturer som axonjusteringar eller muskelspindlar är bra landmärken som hjälper forskaren att hitta samma fibrer på båda bilderna. För att börja placera två seriella kryofrysta tvärsnitt av muskelprovet på två förmärkta vidhäftningsglas.
En bild för att bestämma fibertyper och den andra för att kvantifiera lipidinnehåll. För immunohistokemisk detektion av muskelfibertyp, omge sektionerna med en kontur ritad med en hydrofob penna. Placera den i en fuktig kammare och skölj med iskall 0,1 molär PBS i en minut vid rumstemperatur.
Ta sedan bort PBS, tillsätt blockeringslösningen i bilden och inkubera i 90 minuter vid 37 grader Celsius. Ta senare bort blockeringslösningen och inkubera bilderna i 90 minuter vid 37 grader Celsius med lösningen innehållande de primära antikropparna. Tvätta bilderna tre gånger med PBS i fem minuter vardera, vid rumstemperatur.
Tillsätt lösningen som innehåller de sekundära antikropparna och inkubera bilderna i mörkret i en timme vid rumstemperatur, se därefter till att hålla bilden borta från ljuset och fortsätt med de tre tvättarna i PBS i fem minuter vardera, skölj sedan bilden i dubbeldestillerat vatten, efter att ha tagit bort överflödigt vatten, montera bilden med antifadereagens och förvara den vid fyra grader Celsius skyddad från ljus. För att färga lipiddroppen med bodipy, omge muskelsektionen med en kontur ritad av en hydrofob penna innan du sköljer den med iskall 0.1 molär PBS i 10 minuter. Båda bilderna måste färgas samtidigt.
Fixa sektionen med kall fyra procent paraformaldehyd utan metanol i 10 minuter vid rumstemperatur. Efter första snabbsköljningen tvätta bilderna tre gånger med PBS i fem minuter. Blockera bilden med 5% normalt getserum i PBS i en timme i mänsklig kammare.
Följt av inkubering av bilden med lösningen av den primära antikroppen bestående av 2% normalt getserum och råtta-anti-laminin i PBS i 90 minuter. Efter tvättning av bilder tre gånger i PBS, utför nästa inkubation med den sekundära antikroppslösningen innehållande get, anti-råtta, Alexa fluor 647-antikropp i PBS vid rumstemperatur i en timme. Se till att bilden är skyddad från ljuset.
Efter inkubation tvätta bilden tre gånger med PBS. Inkubera sedan sektionen i 20 minuter med dapi och bodipy lösning. Efter en snabb sköljning, tvätta tre gånger med PBS, och en gång med dubbeldestillerat vatten, ta sedan bort överflödigt vatten och montera sektionen med ett anti-fade reagens.
När muskeln har skannats laddar du upp de tagna digitala bilderna till valfri bildbehandlingsprogramvara för rekonstruktion. Baserat på fibermorfologin och muskelsektionens histologi, spara bilden i ett lämpligt format med alla kanaler sammanslagna. För kroppslig bildobservation och förvärv, ställ in parametrarna för ett konfokalmikroskop, med en 40 X oljedoppningsmållins och en numerisk bländare på 1,4, som beskrivs i manuskriptet.
För att undvika överhörning mellan bodipy och 558, 568 och laminin Alexa fluor 647; Använd sekventiellt skanningsläge på konfokalprogramvaran. Excitera bodipy och 493, 503 med 488 nanometer laserlinje eller argonlaserlinje och excitera bodipy och 555, 568 med 561 nanometer diodlaserlinjen. Slutligen detektera laminin Alexa fluor 647 med en 640 nanometer diodlaserlinje, beroende på vilket färgämne som valts, ställ in utsläppshastigheterna på 570 till 650 nanometer för bodipy och 493, 503.
Och vid 565 till 620 nanometer för bodipy och 558, 568. Ställ in utsläppsområdet för laminin på 656 till 700 nanometer. Ställ sedan in förstärkningen och den digitala förstärkningen på lämpligt sätt för att undvika att upptäcka mättade pixlar på intervallindikatorn.
Korrigera bakgrundssignalen genom att justera förskjutningen. För att identifiera typen av fiber på konfokalmikroskopet, använd en bärbar dator där bilden av den tidigare rekonstruerade bilden med fibertypen immundetektering kan kontrolleras. När en grupp fibrer är korrekt identifierade förvärva bilden med bodipy- och lamininkanalerna.
Öppna varje bild med hjälp av bioformatets importör från Fiji. Under visningsstacken med alternativet väljer du hyperstack, sedan färgläge och standard. Se till att fönstret för automatisk skalning är markerat.
Använd verktyget för fri handval för att manuellt välja fiberns sarcolemma baserat på lamininkanalen. Och tryck på T på tangentbordet för att spela in intresseområdet i ROI-fönstret. Gå till Fijis huvudfönster och klicka på analysera och ställ in mätningar.
Välj sedan område i popup-fönstret och för upphöjd diameter, lämna de återstående rutorna avmarkerade och andra parametrar som de visas som standard. Klicka på måttet i ROI-fönstret för att få arean och minimal för höjd diameter på den valda fibern och notera dem för senare användning. Beräkna värdet på en sjättedel av det minimala för upphöjd diameter för att avgränsa den centrala delen av fibern.
Klicka på ROI-fönstret, klicka på lägg till för att få en kopia av den första avkastningen och välj den andra avkastningen som visas i fönstret. I Fijis huvudfönster klickar du på redigera, väljer sedan och förstorar. För att introducera det tidigare beräknade värdet med ett minustecken före numret och klicka på okej.
I ROI-fönstret klickar du på lägg till, En tredje ROI måste visas och ta bort för att ta bort den andra ROI. I ROI-fönstret väljer du båda ROI: erna och klickar på mer än ZOR och lägger till, vänta tills en tredje ROI visas som motsvarar fiberns periferi. Om omanalys av samma fibrer behövs, spara ROI: erna genom att klicka på mer och spara sedan.
Välj bodipy-kanalen och öppna tröskelverktyget genom att klicka på bild-, justerings- och tröskelflikar i Fijis huvudfönster. I popup-fönstret för tröskelvärdet ställer du in värdena till 70 och 255. Välj sedan YEN och svartvit metod.
Innan du klickar på mörk bakgrund. Slutligen tryck på fliken Apply. Gå till Fijis huvudfönster och klicka på analysera och ställ in mätningar.
I popup-fönstret väljer du område, områdesfraktion och gräns till tröskel. Lämna de återstående rutorna och parametrarna som standard. Gå till ROI-fönstret och välj den första ROI.
I Fijis huvudfönster klickar du på analysera och analyserar sedan partikelverktyget. I fönstret analyserade partiklar ställer du in värdena från två till oändligheten och markerar pixelrutan. Behåll standardvärdet för cirkularitet och välj sammanfatta innan du klickar på okej.
För att få värdena på mitten och fiberns periferi, upprepa valet av den andra och den tredje avkastningen varje gång. Spara sedan resultaten genom att klicka på fil och spara sedan som i sammanfattningsfönstret. Inkludera typen av fiber på filens namn.
Detta immunohistokemiska protokoll tillåter erkännande av möss, långsamma oxidativa fibrer, som typ 1 och 2A, snabba glykolytiska fibrer, såsom typ 2X och 2B, Och närvaron av hybridfibrer. Genom att mäta arean och minimal för förhöjd diameter av muskelfibern applicerades en storleksberoende reduktion för att erhålla de centrala och perifera områdena för varje fiber. Anmärkningsvärda strukturer i varje muskelsektion, såsom axonkvistar eller muskelspindlar är bra landmärken som kan hjälpa till att hitta samma fibrer på båda sidor.
De inställningar som beskrivs för att förvärva kroppslig lamininfärgning genom konfokalmikroskopi. Tillåtet, visualisering och analys av storlek, antal och fördelning av lipiddroppar från tre till sex fibrer samtidigt. Metoden möjliggjorde också kvantifiering av tre viktiga parametrar, nämligen procentandelen av fiberområdet som upptas av lipiddropparna, densiteten och den genomsnittliga storleken på lipiddroppar.
Felaktig frysningsprocedur och misslyckande med att uppnå rätt temperatur av isopentan resulterade i en iskristallbildning inuti muskelfibrerna. När sektioner inte var inriktade tvärs över lipiddroppskvantifieringen och jämförelsen mellan fibrer, muskler eller djur kunde inte utföras. Bearbetningen av den andra bilden måste göras samtidigt med den första.
Lufttorkning av bilden efter kryosektion i 15 minuter kommer att minska storleken och antalet lipiddroppar avsevärt. Bodipy kan användas för att studera interaktionen mellan lipiddroppar och andra subcellulära organeller, eller proteinstack med fluorescens av ett annat spektrum, eller med genetiskt modifierade GFP-modeller. Myosteatos har rapporterats vara en dålig prognostisk faktor för flera sjukdomar.
Därför kan denna teknik användas för att övervaka utvecklingen av en sjukdom eller för att utvärdera effekten av en behandling.
