Name: detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing
Uploaded: 2022-06-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing at JoVE.com

نشكر ميغان ك. هولت على تحرير المخطوطة. تم دعم هذه الدراسة من خلال منح NIH / NIDCR DE026461 و DE028345 وتمويل بدء التشغيل من كلية طب الأسنان في تكساس إيه آند إم للدكتور شياو فانغ وانغ.

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) لكلية طب الأسنان بجامعة تكساس إيه آند إم.
1. إعداد كوكتيل وضع العلامات EdU
<ol><li>قم بإعداد حلول مخزون الكوكتيل كما هو موضح في الجدول 1.</li>
	<li>قم بإعداد كوكتيل وضع العلا?...

<ol>
	<li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+incisor+through+gene+co-expression+analysis.">Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis.</a> eLife. 6, 24712 (2017).</li><li>Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+tooth+development,+growth,+repair,+and+regeneration.">Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).</li><li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quiescent+cell+population+replenishes+mesenchymal+stem+cells+to+drive+accelerated+growth+in+mouse+incisors.">A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors.</a> Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).</li><li>Biehs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMI1+represses+Ink4a/Arf+and+Hox+genes+to+regulate+stem+cells+in+the+rodent+incisor.">BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor.</a> Nature Cell Biology. 15 (7), 846-852 (2013).</li><li>Sharir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+pool+of+actively+cycling+progenitors+orchestrates+self-renewal+and+injury+repair+of+an+ectodermal+appendage.">A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage.</a> Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).</li><li>Terskikh, V. V., Vasiliev, A. V., Vorotelyak, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label+retaining+cells+and+cutaneous+stem+cells.">Label retaining cells and cutaneous stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 414-425 (2012).</li><li>de Miguel-Gomez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+the+endometrium:+From+the+discovery+of+adult+stem+cells+to+pre-clinical+models.">Stem cells and the endometrium: From the discovery of adult stem cells to pre-clinical models.</a> Cells. 10 (3), 595 (2021).</li><li>Ishikawa, Y., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+adult+stem+cells+in+murine+teeth+are+regulated+by+Shh+signaling.">Quiescent adult stem cells in murine teeth are regulated by Shh signaling.</a> Cell and Tissue Research. 369 (3), 497-512 (2017).</li><li>Chehrehasa, F., Meedeniya, A. C., Dwyer, P., Abrahamsen, G., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU,+a+new+thymidine+analogue+for+labelling+proliferating+cells+in+the+nervous+system.">EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 122-130 (2009).</li><li>Solius, G. M., Maltsev, D. I., Belousov, V. V., Podgorny, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+nucleotide+analogue-based+techniques+for+tracking+dividing+stem+cells:+An+overview.">Recent advances in nucleotide analogue-based techniques for tracking dividing stem cells: An overview.</a> The Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101345 (2021).</li><li>Ning, H., Albersen, M., Lin, G., Lue, T. F., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+EdU+labeling+on+mesenchymal+stem+cells.">Effects of EdU labeling on mesenchymal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (1), 57-63 (2013).</li><li>Lin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+tracking+of+mesenchymal+stromal+cells+with+EdU.">Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU.</a> Cytotherapy. 11 (7), 864-873 (2009).</li><li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Challen, G. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+expression+of+H2B-GFP+transgene+in+hematopoietic+stem+cells.">Promiscuous expression of H2B-GFP transgene in hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 3 (6), 2357 (2008).</li><li>Kopecky, B. J., Duncan, J. S., Elliott, K. L., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstructions+from+optical+sections+of+thick+mouse+inner+ears+using+confocal+microscopy.">Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).</li><li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+technique:+Recent+progress+and+biomedical+applications.">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing.">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+application+to+bone+and+dental+tissues.">Tissue clearing and its application to bone and dental tissues.</a> Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Fink, J., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cell+lineage+tracing+and+deep+tissue+imaging.">Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging.</a> BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).</li></ol>

عادة ما تستخدم جرعات متعددة من الحقن (BrdU ، EdU) على الفئران الوليدية النامية لتسمية الخلايا المتكاثرة قدر الإمكان1،6،13. تعتبر فترة المطاردة خطوة حاسمة فيما يتعلق بمعدل تجديد الأنسجة 6,13. قاطعة الماوس تجدد نفس?...

تعد قاطعة الماوس المتنامية باستمرار نموذجا ممتازا لدراسة الخلايا الجذعية البالغة1. تتمايز الخلايا الجذعية الظهارية (حلقة عنق الرحم الشفوية واللسانية) والخلايا الجذعية الوسيطة (بين حلقة عنق الرحم الشفوية واللسانية) الموجودة على الجانب القريب من القاطعة إلى الأرومات المينائية والأرومات السنية وخلايا لب الأسنان. توفر هذه العملية الفريدة مصدرا للخلايا لتعويض فقدان الأنسجة ودورانها2. على الرغم من وجود العديد من علامات الخلايا الجذعية مثل Sox2 و Gli1 و Thy1 / CD90 و Bmi1 وما إلى ذلك. تم تحديدها في الجسم الحي لمجموعات فرعية من الخلايا الجذعية البالغة في قواطع الفئران ، فهي غير كافية في تمثيل مجموعات الخلايا الجذعية عند استخدامها بمفردها1،3،4،5. يمكن أن يوفر تصور الخلايا الهادئة طويلة العمر عن طريق وسم الحمض النووي التناظري للنيوكليوتيدات والاحتفاظ به اكتشافا غير متحيز لمعظم المجموعات الفرعية من الخلايا الجذعية البالغة6. علاوة على ذلك ، يعد هذا النهج مفيدا بين العديد من طرق تحديد الخلايا الجذعية7 لفهم سلوك الخلايا وتوازن مجموعات الخلايا الجذعية السنية 3,8. في حين أن الخلايا الجذعية المنقسمة ستفقد علامات الحمض النووي الخاصة بها بعد مطاردة كبيرة ، فإن الخلايا الجذعية الهادئة المفترضة تحتفظ بتسمية الحمض النووي الخاصة بها ، معتبرة أنها خلايا تحتفظ بالتسمية (LRCs)6. سيؤدي وضع علامات الحمض النووي والاحتفاظ به بواسطة الخلايا الجذعية غير المنقسمة إلى تحديد وتحديد موقع الخلايا الجذعية البالغة المفترضة في منافذها.
على مدى السنوات الماضية ، حل وضع العلامات التناظرية thymidine 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) محل طريقة وضع العلامات على الحمض النووي 3H-thymidine المرهقة والمستهلكة للوقت وعالية الدقة وغير المتوافقة مع الفحص الدقيق لفحوصات تكاثر الخلايا 6,9. في السنوات الأخيرة ، تم استخدام تقنية وضع العلامات 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) بشكل متزايد على BrdU. ظهر هذا النمط لعدة أسباب. أولا ، طريقة BrdU بطيئة وكثيفة العمالة. ظروف المستخدم متغيرة ، وهي غير قادرة على الحفاظ على البنية التحتية في العينات (بسبب تمسخ الحمض النووي). وبالمثل ، تفقد طريقة BrdU مستضدية الخلايا ، مما يجعلها غير فعالة للتحليلات والمقايسات الوظيفية النهائية مثل تجارب التوطين المشترك وزرع الخلايا الجذعية في الجسم الحي 3،7،9،10،11،12. BrdU هو أيضا ماسخ ، وهو غير مناسب لوضع العلامات على LRCs في التطور الجنيني6. أيضا ، طريقة BrdU غير فعالة عند استخدامها في عينات التركيب الكامل. العيوب هي انخفاض تغلغل الأجسام المضادة في الجزء العميق من العينات أو شرط فترة حضانة طويلة للأجسام المضادة للاختراق العميق13. يهرب وضع العلامات EdU من خطوات تغيير طبيعة العينات ، وبالتالي الحفاظ على البنية التحتية. هذه الميزة مفيدة للتحليلات الوظيفية النهائية مثل تجارب التوطين المشترك وزرع الخلايا الجذعية11,12. أيضا ، وضع العلامات EdU حساسة للغاية وسريعة. تغلغل العينة مرتفع بسبب استخدام أزيدات الفلورسنت سريعة الامتصاص والأصغر حجما للكشف عن ملصقات EdU من خلال تفاعل الإضافة الحلقية المحفز بالنحاس (I) [3 + 2] (كيمياء "النقر)14.
طريقة أخرى لتصنيف الحمض النووي يتم تطبيقها بشكل متزايد هي استخدام الفئران المعدلة وراثيا المهندسة. تعبر هذه الفئران عن بروتين الفلورسنت الأخضر هيستون 2B (H2B-GFP) الذي يتحكم فيه عنصر منظم مستجيب للتتراسيكلين 5,14. بعد إطعام الفئران بتشاو / ماء التتراسيكلين لفترة مطاردة تتراوح من 4 أسابيع إلى 4 أشهر ، سوف يتضاءل مضان GFP في خلايا الدورة ويحتفظ LRCs فقط بالتألق6. ميزة هذه الطريقة هي أنه يمكن عزل مراكز مصادر التعلم الموسومة وتظل قابلة للحياة لزراعة الخلايا أو التحليلات الوظيفيةالنهائية 6,7. أبلغت بعض الدراسات عن وضع علامات غير دقيقة على الخلايا الجذعية الهادئة عند مطاردتها للاستخدام على المدى الطويل. كانت هذه النتيجة بسبب تعبير خلفية متسرب من سلالة H2B-GFP وليس الاستجابة المناسبة التي ينظمها التتراسيكلين15.
علاوة على ذلك ، استخدمت معظم الأدبيات في الماضي اكتشاف مراكز مصادر التعلم بشكل أساسي على شرائح مجزأة ، وهي ثنائية الأبعاد وغالبا ما تكون متحيزة بشكل خاطئ في إظهار الموقع الدقيق وعدد مراكز مصادر التعلم. أظهر النهج زوايا غير صحيحة لأقسام هياكل الأنسجة المعقدة16. كانت الطريقة الأخرى هي الحصول على صور 3D من الأقسام التسلسلية وإجراء عمليات إعادة بناء ما بعد الصورة. كانت هذه الخطوات غير دقيقة بسبب تشويه الصورة من الاختلافات في كل قسم تسلسلي بسبب الأقسام المضغوطة أو الممتدة ، مما أدى إلى فقدان المعلومات16،17،18. كانت الطريقة أيضا شاقة وتستغرق وقتا طويلا.
لتسهيل التصوير الكامل لمراكز مصادر التعلم ، يجب توضيح العينات مع الحفاظ على التألق جيدا. يمكن تصنيف تقنيات إزالة الأنسجة الحالية إلى ثلاث فئات رئيسية: تقنيات إزالة الأنسجة القائمة على المذيبات العضوية ، وتقنيات إزالة الأنسجة القائمة على الكاشف المائي ، وتقنيات إزالة الأنسجة القائمة على الهيدروجيل17،19. تم مؤخرا تطوير نظام المذيبات المرتبط بالبولي إيثيلين جلايكول (PEG) (PEGASOS). هذا النهج يجعل جميع أنواع الأنسجة تقريبا شفافة ويحافظ على مضان داخلي المنشأ ، بما في ذلك الأنسجة الصلبة مثل العظام والأسنان20. تتميز طريقة PEGASOS بمزايا مقارنة بطرق إزالة الأنسجة الأخرى ، خاصة في إزالة مواد الأسنان والعظام. يمكن لمعظم الطرق الأخرى إزالة الأنسجة الصلبة جزئيا فقط ، أو لها أوقات معالجة طويلة ، أو تتطلب كواشف مكلفة21. أيضا ، يمكن لطريقة PEGASOS الحفاظ بكفاءة على التألق الداخلي على الطرق الأخرى.
قادتنا هذه الأدبيات إلى إنشاء طريقة جديدة لدراسة الخلايا. لقد جمعنا مزايا الكشف عن LRCs لوضع العلامات على EdU مع التصوير الأكثر تفوقا 3D الكامل للعينات التي تم تطهيرها من الأنسجة. تمت معالجة العينات باستخدام تقنية إزالة الأنسجة المتقدمة المرتبطة بنظام المذيبات المرتبط بالبولي إيثيلين جلايكول (PEG) (PEGASOS)15. مكنتنا شفافية الأنسجة الصلبة من إعادة بناء إشارة 3D لتألق LRCs في الجسم الحي دون كسر الأسنان أو الفك السفلي ، مما يخلق طريقة أكثر دقة لتصور وقياس LRCs.
في هذه الدراسة ، نقدم دليلا مبتكرا لتصور LRCs في قاطعة الماوس. لقد صنعنا نهجا مرئيا 3D لتحديد موقع وكمية LRCs داخل مكانة الخلايا الجذعية القاطعة للفأر. استخدم هذا المشروع وضع العلامات على EdU ، وتقنيات إزالة الأنسجة PEGASOS ، والفحص المجهري متحد البؤر. تتغلب طريقتنا في وضع علامات EdU على LRCs على أنسجة كاملة التركيب واستخدام عينة واضحة وشفافة على كل من قيود الشرائح التقليدية المجزأة وغيرها من طرق وضع العلامات على الحمض النووي غير المواتية. وبالتالي ، ستكون تقنيتنا مناسبة للدراسات حول توازن الخلايا الجذعية التي تتطلب اكتشاف LRCs ، خاصة على الأنسجة الصلبة. يمكن أن يكون البروتوكول مفيدا بنفس القدر لأولئك الذين يركزون على الاتزان الداخلي للخلايا الجذعية في الأنسجة والأعضاء الأخرى.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#215; Objective/NA 0.9</td>
			<td>Leica</td>
			<td>507702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bezyl benzoate (BB)</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>409529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane 9.0.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND cavity slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>BR475505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation Pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>23609-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Carboynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Miiilipore Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X Software</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehye</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGMMA500</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>447943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfa-Cyanine 3 Azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>D1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-10X</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-butanol (tB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>360538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing

قاطعة الفئران هي عضو ينمو باستمرار طوال عمر الفأر. تؤدي الخلايا الجذعية الظهارية والوسيطة الموجودة في الأنسجة القريبة من القواطع إلى ظهور ذرية تتمايز إلى أرومات المينائية والأرومات السنية والخلايا الليفية اللبية. هذه الخلايا ضرورية في دعم الدوران المستمر للأنسجة القاطعة ، مما يجعل قاطعة الفئران نموذجا ممتازا لدراسة توازن الخلايا الجذعية البالغة. يعتقد أن الخلايا الجذعية تحتوي على خلايا هادئة طويلة العمر يمكن تصنيفها بواسطة نظائر النوكليوتيدات مثل 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU). تحتفظ الخلايا بهذه التسمية بمرور الوقت وتسمى وفقا لذلك خلايا الاحتفاظ بالتسمية (LRCs). توفر مناهج تصور مراكز مصادر التعلم في الجسم الحي أداة قوية لمراقبة توازن الخلايا الجذعية. في هذه الدراسة ، وصفنا طريقة لتصور وتحليل مراكز مصادر التعلم. يتميز نهجنا المبتكر بمراكز مصادر التعلم في قواطع الماوس بعد إزالة الأنسجة وتلطيخ EdU الكامل متبوعا بالفحص المجهري متحد البؤر وإعادة البناء ثلاثية الأبعاد (3D) باستخدام برنامج التصوير. تتيح هذه الطريقة الحصول على تصوير 3D والقياس الكمي غير المتحيز مقارنة بتحليل LRCs التقليدي على الشرائح المقسمة.

بعد وضع العلامات على EdU وعملية إزالة الأنسجة PEGASOS (الشكل 2) ، تم الحصول على الفك السفلي الشفاف كما هو موضح في صورتنا (الشكل 3B). قارنا العينة المعدلة بالفك السفلي العادي دون عملية إزالة الأنسجة (الشكل 3 أ). تعرض الفك السفلي الشفاف (الشك...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing at JoVE.com

Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing

تحتوي قاطعة الفأر على خلايا قيمة للاحتفاظ بالتسمية في مكانتها للخلايا الجذعية. لدينا طريقة جديدة لاكتشاف الخلايا التي تحتفظ بالتسمية وتحديدها بشكل غير متحيز. استخدمت دراستنا وضع العلامات EdU ونهج إعادة الإعمار 3D بعد تطهير أنسجة PEGASOS من الفك السفلي.

الكشف عن وكمية خلايا الاحتفاظ بالتسمية في قواطع الماوس باستخدام نهج إعادة البناء 3D بعد إزالة الأنسجة

The murine incisor is an organ that grows continuously throughout the lifespan of the mouse. The epithelial and mesenchymal stem cells residing in the ...

يصف هذا البروتوكول طريقة للتصور في الجسم الحي وثلاثي الأبعاد والقياس الكمي للخلايا التي تحتفظ بالتسمية لمكانة الخلايا الجذعية القاطعة للفأر. هذه التقنية موفرة للوقت وسهلة الاستخدام للمتعلمين الجدد. يتم الحصول على صور 3D دون الإضرار بالأنسجة.الكمي 3D يجعل البيانات أكثر موثوقية ودقة. للبدء ، تشريح الفك السفلي. ثبت العينات في 4٪ بارافورمالدهيد ، واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.بعد الحضانة ، قم بإزالة العضلات من الفك السفلي. اغمرها في محلول حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك 0.5 مولار لإزالة الكلس لمدة أربعة أيام مع تغيير متوسط يومي على شاكر 37 درجة مئوية. قم بإزالة لون الفك السفلي في 15 ملليلتر من محلول كوادرول 25٪ على شاكر 37 درجة مئوية ليوم واحد لإزالة الهيم الدموي المتبقي.لتلطيخ 5-إيثينيل -2-برايم-ديوكسييوريدين كامل ، قم بإعداد كوكتيل جديد لوضع العلامات 5-إيثينيل -2-برايم ديوكسييوريدين كما هو مذكور في النص. اشطف الفك السفلي بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات باستخدام Tween 20 أو PBST لمدة 30 دقيقة على شاكر بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. كرر شطف الفك السفلي بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات ثلاث ثلاث دقائق لكل منهما ، متبوعا بالحضانة في كوكتيل 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine طازج على شاكر طوال الليل.كرر الغسيل الملحي المخزن بالفوسفات ثلاث مرات ، وقم بإجراء إزالة الدهون التسلسلية عن طريق وضع الفك السفلي في المحاليل المذكورة في النص لمدة ست ساعات لكل منها في شاكر 37 درجة مئوية. قم بتجفيف الفك السفلي في محلول ثلاثي البيوتانول والبولي إيثيلين جلايكول ، أو tB-PEG ، لمدة يومين عند 37 درجة مئوية مع التغيير اليومي المتوسط. بعد يومين ، قم بإزالة الفك السفلي في وسط إزالة البنزيل بنزوات البولي إيثيلين جلايكول الذي يحتوي على 75٪ بنزوات البنزيل ، و 22٪ من البولي إيثيلين جلايكول ميثيل إيثر ميثاكريلات بمتوسط 500 أو PEG-MMA500 ، و 3٪ كوادرول للحصول على مطابقة معامل الانكسار وحتى يتم تحقيق الشفافية.قم بتركيب الفك السفلي الكامل الذي تم تطهيره من الأنسجة على شرائح تجويف العلامة التجارية في وسط إزالة البنزيل بنزوات البولي إيثيلين جلايكول ، وقم بتغطيته بشرائح غطاء زجاجي. في برنامج التصوير متحد البؤر ، قم بتعيين معلمات الحصول على الصور المطلوبة. في لوحة الإثارة الفلورية ، قم بتنشيط الليزر المطلوب لإثارة الفلوروفورات على النحو الأمثل.في لوحة اكتشاف الفلورسنت ، حرك شريط التمرير لتحديد الأطوال الموجية المراد قياسها. أضف قطرة من زيت الغمر بمعامل انكسار 1.52 أعلى غطاء الغطاء لتتناسب مع معامل الانكسار لانزلاق الغطاء الزجاجي والهدف ، وضع الفك السفلي المثبت على مرحلة المجهر. قم بتشغيل مصابيح الفلورسنت ، واختر هدف تكبير مناسب لتصوير مناطق الاهتمام.في وضع المسح المباشر ، حدد مجال الرؤية لتصور المنطقة بأكملها من الفك السفلي في أبعاد X و Y. قم بتعيين معلمات اكتساب المرحلة Z العلوية والسفلية التي تغطي بدقة حجم مكانة الخلايا الجذعية في قاطعة الفئران. استخدم حجم خطوة Z من 2 ميكرومتر أو حسب متطلباتك.الحصول على ملفات صور Z-stack وحفظها بتنسيق lif. استخدم محول ملفات برنامج تصوير لتحويل ملف الصورة Z-stack إلى نوع ملف التنسيق الأصلي. في برنامج التصوير، انقر على زر الساحة، ثم اختر صورة.حدد ملف lif الأصلي ، واختر الملف المدمج. سيتم استيراد الصور إلى برنامج التصوير. انقر نقرا مزدوجا فوق الملف المدرج لفتح مجموعة بيانات الصورة.في برنامج التصوير، تفضل بزيارة لوحة ضبط الشاشة. في لوحة ضبط العرض ، انقر فوق اسم القناة. عادة ما يتم تصنيفه على أنه أحمر في الوضع الافتراضي.في نافذة خصائص الصورة ، انقر فوق علامة التبويب اللون المعين. في خيار ملف علامة تبويب اللون ، اختر Fire Flow ، ثم انقر فوق موافق. حدد لون العرض لتمييز مضان الخلفية والتألق الإيجابي من العينة. في الجانب العلوي الأيسر من الشاشة ، في جزء خصائص المشهد ، انقر فوق الرمز الأزرق المسمى إضافة سطح جديد.قم بإلغاء تحديد أيقونة مستوى الصوت لإزالة معظم مضان الخلفية ، مما يؤدي إلى التألق الإيجابي المرئي بوضوح أثناء التجزئة اليدوية. بعد ذلك ، ابدأ التقسيم اليدوي لمنطقة الاهتمام ، أو عائد الاستثمار ، بالنقر فوق علامة التبويب إنشاء وتحديد علامة التبويب تخطي الإنشاء التلقائي ، والتحرير يدويا. في معالج إنشاء السطح اليدوي ، انقر فوق علامة التبويب كفاف لاختيار الاتجاه بناء على العينات لتحديد عائد الاستثمار بسهولة.بعد ذلك ، تأكد من أن قائمة المؤشر في الزاوية اليمنى في وضع التحديد. اضبط موضع الشريحة لتحديد موقع عائد الاستثمار في الأنسجة. كما ذكرنا سابقا ، تمت إزالة معظم مضان الخلفية بالفعل.انقر فوق الزر "رسم" ، وارسم منطقة اهتمام مؤقتة. حدد خيار الرؤية إلى لا شيء لتجنب التداخل من مناطق أخرى غير عائد الاستثمار، متبوعا بتقسيم منطقة الاهتمام شريحة تلو الأخرى. بعد الانتهاء من رسم عائد الاستثمار ، انقر فوق إنشاء Surface للحصول على هندسة 3D لعائد الاستثمار.انقر فوق الزر تحرير في معالج إنشاء السطح اليدوي ، وحدد قناع الكل. في نافذة قناع القناة المنبثقة ، حدد القناة 1 في خيارات اختيار القناة. بعد ذلك ، حدد تكرار القناة قبل تطبيق القناع.في إعدادات القناع ، حدد ثابت داخل / خارج ، واضبط السطح الخارجي للفوكسل على الصفر. في جزء خصائص المشهد، قم بإلغاء تحديد كائن Surface، وحدد كائن وحدة التخزين. في معايرة العرض، قم بإلغاء تحديد القناة الحمراء الأصلية، وحدد القناة الحمراء المقنعة.وضبط كثافة اللون للحصول على المطلوب 3D المقدمة ووصفت إيجابيا مضان ROI. قم بإنشاء كائن بقعة جديد بالنقر فوق رمز البقع لتحديد خلايا الاحتفاظ بالتسمية المقدمة ثلاثية الأبعاد عن طريق إنشاء بقع ثلاثية الأبعاد تتداخل بشكل مماثل مع خلايا الاحتفاظ بالتسمية ثلاثية الأبعاد. استخدم الأسهم السفلية للتنقل بين الخطوات في معالج إنشاء البقعة.انقر فوق الزر "إنهاء" ، وحدد الزر "إحصائية". بعد ذلك ، حدد علامة التبويب "الإجمالي" للعثور على قيمة العدد الإجمالي للبقع في الصورة. بعد وضع العلامات على 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine وعملية إزالة الأنسجة لنظام المذيبات المرتبط بالبولي إيثيلين جلايكول ، تم الحصول على الفك السفلي الشفاف.تمت مقارنة العينة المعدلة بالفك السفلي العادي دون عملية إزالة الأنسجة ، وتم إخضاع الفك السفلي الشفاف مع وضع العلامات على 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine للتصوير متحد البؤر. أظهر القسم البصري من القاطعة خلايا الاحتفاظ بالتسمية في مكانة الخلايا الجذعية لقمة القاطعة في المستوى XY. أظهر بناء الصورة ثلاثية الأبعاد لقمة قاطعة 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine خلايا جذعية هادئة تحتفظ بالتسمية الإيجابية في كل من مكانة الخلايا الجذعية الظهارية والوسيطة.تم نقل الخلايا الإيجابية 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine إلى أماكن للقياس الكمي تتداخل نسبيا مع خلايا الاحتفاظ بالتسمية الوسيطة. تظهر البقع التي تم إنشاؤها فقط لخلايا الاحتفاظ بالتسمية الوسيطة وفقط لخلايا الاحتفاظ بالتسمية الظهارية في الصورة. كما تم إجراء تقدير كمي للخلايا الظهارية والوسيطة التي تحتفظ بالعلامات.خصائص المعالجة والمقاصة هي أهم الخطوات ويجب تحسينها وفقا لاستخدام الأنسجة للحصول على نتائج مرضية. يمكن أيضا تعديل هذه الطريقة لتصور LRCs على مستوى S2VGFP وفي تتبع نسب الخلية للحصول على تفاصيل حول موقع النسل وكميتها أو مساهماتها.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Loss- ونهج كسب من وظيفة إلى التحقيق في خلية المبكر مصير محددات في سابق للانغراس أجنة الفئران

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

إنتاج الخلايا الجذعية المحفزة من الفأر الأمنيوسي الخلايا السوائل عن طريق نظام ينقول

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

نهج موحد لتنقية مولتبيسيسيز من الثدييات خلايا الجرثومية الذكور من الأنسجة الميكانيكية التفكك والتدفق الخلوي

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

أفقي جبل كامل: A معالجة الرواية والتصوير بروتوكول للثدي، ثلاثة-- الأبعاد الأنسجة عبر-- أقسام الجلد

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

وسم المناعية-فلوري Microtubules والبروتينات سينتروسومال في 3D في المختبر أورجانويدس الأمعاء والأنسجة المعوية السابقين فيفو

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

في المختبر توليد المشتقات سميط من البشرية التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

نظام فحص تكوين الأوعية ثلاثي الأبعاد باستخدام Spheroids الثقافة المشتركة التي شكلتها الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية والخلايا الجذعية Mesenchymal

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

التصور والتحليل من الشرايين القوس البلعوم ية باستخدام كامل جبل الكيمياء المناعية وإعادة الإعمار 3D

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

إعداد مكتبات RNA الصغيرة لتسلسل من أجنة الماوس المبكر

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...