Name: detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing
Uploaded: 2022-06-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing at JoVE.com

Vi takker Meghann K. Holt for at redigere manuskriptet. Denne undersøgelse blev støttet af NIH / NIDCR-tilskud DE026461 og DE028345 og opstartsfinansiering fra Texas A &M School of Dentistry til Dr. Xiaofang Wang.

Alle metoder beskrevet her er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) for Texas A &M University College of Dentistry.
1. Forberedelse af EdU-mærkningscocktailen
<ol><li>Forbered cocktailstamopløsningerne som beskrevet i tabel 1.</li>
	<li>Forbered EdU-mærkningscocktailen som beskrevet i tabel 1.</li>
</ol>2. Fremstilling af musene og EdU-opløsningen
<ol><li>Forbered EdU-o...

<ol>
	<li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+incisor+through+gene+co-expression+analysis.">Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis.</a> eLife. 6, 24712 (2017).</li><li>Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+tooth+development,+growth,+repair,+and+regeneration.">Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).</li><li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quiescent+cell+population+replenishes+mesenchymal+stem+cells+to+drive+accelerated+growth+in+mouse+incisors.">A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors.</a> Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).</li><li>Biehs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMI1+represses+Ink4a/Arf+and+Hox+genes+to+regulate+stem+cells+in+the+rodent+incisor.">BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor.</a> Nature Cell Biology. 15 (7), 846-852 (2013).</li><li>Sharir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+pool+of+actively+cycling+progenitors+orchestrates+self-renewal+and+injury+repair+of+an+ectodermal+appendage.">A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage.</a> Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).</li><li>Terskikh, V. V., Vasiliev, A. V., Vorotelyak, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label+retaining+cells+and+cutaneous+stem+cells.">Label retaining cells and cutaneous stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 414-425 (2012).</li><li>de Miguel-Gomez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+the+endometrium:+From+the+discovery+of+adult+stem+cells+to+pre-clinical+models.">Stem cells and the endometrium: From the discovery of adult stem cells to pre-clinical models.</a> Cells. 10 (3), 595 (2021).</li><li>Ishikawa, Y., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+adult+stem+cells+in+murine+teeth+are+regulated+by+Shh+signaling.">Quiescent adult stem cells in murine teeth are regulated by Shh signaling.</a> Cell and Tissue Research. 369 (3), 497-512 (2017).</li><li>Chehrehasa, F., Meedeniya, A. C., Dwyer, P., Abrahamsen, G., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU,+a+new+thymidine+analogue+for+labelling+proliferating+cells+in+the+nervous+system.">EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 122-130 (2009).</li><li>Solius, G. M., Maltsev, D. I., Belousov, V. V., Podgorny, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+nucleotide+analogue-based+techniques+for+tracking+dividing+stem+cells:+An+overview.">Recent advances in nucleotide analogue-based techniques for tracking dividing stem cells: An overview.</a> The Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101345 (2021).</li><li>Ning, H., Albersen, M., Lin, G., Lue, T. F., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+EdU+labeling+on+mesenchymal+stem+cells.">Effects of EdU labeling on mesenchymal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (1), 57-63 (2013).</li><li>Lin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+tracking+of+mesenchymal+stromal+cells+with+EdU.">Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU.</a> Cytotherapy. 11 (7), 864-873 (2009).</li><li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Challen, G. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+expression+of+H2B-GFP+transgene+in+hematopoietic+stem+cells.">Promiscuous expression of H2B-GFP transgene in hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 3 (6), 2357 (2008).</li><li>Kopecky, B. J., Duncan, J. S., Elliott, K. L., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstructions+from+optical+sections+of+thick+mouse+inner+ears+using+confocal+microscopy.">Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).</li><li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+technique:+Recent+progress+and+biomedical+applications.">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing.">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+application+to+bone+and+dental+tissues.">Tissue clearing and its application to bone and dental tissues.</a> Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Fink, J., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cell+lineage+tracing+and+deep+tissue+imaging.">Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging.</a> BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).</li></ol>

Flere doser injektioner (BrdU, EdU) bruges normalt på voksende neonatale mus til at mærke prolifererende celler så meget som muligt 1,6,13. Jagtperioden betragtes som et kritisk skridt med hensyn til fornyelseshastigheden af væv 6,13. Musens fortænder fornyer sig rundt hver måned. Dette træk giver forskere mulighed for at indstille jagtperioden til 4 uger eller l?...

Den kontinuerligt voksende musefortænder er en fremragende model til at studere voksne stamceller1. Epitelial (labial og lingual cervikal loop) og mesenkymale stamceller (mellem labial og lingual cervikal loop), der befinder sig på den proksimale side af forænden, differentieres i ameloblaster, odontoblaster og tandmasseceller. Denne unikke proces giver en kilde til celler til kompensation for vævstab og omsætning2. Selvom flere stamcellemarkører som Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1 osv. er blevet identificeret in vivo for undergrupperne af voksne stamceller i musefortænder, er de utilstrækkelige til at repræsentere stamcellepopulationerne, når de anvendes alene 1,3,4,5. Visualisering af langtidslevende hvilende celler ved nukleotidanalog DNA-mærkning og tilbageholdelse kunne give upartisk detektion for de fleste undergrupper af voksne stamceller6. Endvidere er denne tilgang nyttig blandt mange stamcelleidentifikationsmetoder7 til forståelse af celleadfærd og homeostase af dentale stamcellepopulationer 3,8. Mens de delende stamceller ville miste deres DNA-mærkning efter en betydelig jagt, bevarer de formodede hvilende stamceller deres DNA-etiket og anser dem for etiketbevarende celler (LRC'er)6. DNA-mærkning og tilbageholdelse af ikke-delende stamceller vil markere og lokalisere de formodede voksne stamceller i deres nicher.
I løbet af de sidste år har thymidinanalog 5-brom-2′-deoxyuridin (BrdU) mærkning erstattet den besværlige, tidskrævende og højopløsningsmikroskopi-inkompatible 3H-thymidin-DNA-mærkningsmetode til celleproliferationsassays 6,9. I de senere år er 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) mærkningsteknikken i stigende grad blevet brugt over BrdU. Dette mønster opstod på grund af flere grunde. For det første er BrdU-metoden langsom og arbejdskrævende. Brugerforholdene er variable, og det er ikke i stand til at bevare ultrastrukturen i prøver (på grund af DNA-denaturering). På samme måde mister BrdU-metoden cellernes antigenicitet, hvilket gør den ineffektiv til downstream-funktionelle analyser og assays såsom co-lokaliseringseksperimenter og in vivo-stamcelletransplantation 3,7,9,10,11,12. BrdU er også et teratogen, som ikke er egnet til mærkning af LRC'er i embryonal udvikling6. BrdU-metoden er også ineffektiv, når den anvendes i helmonterede prøver. Ulemperne er lav penetration af antistoffer i den dybe del af prøver eller kravet om en lang antistofinkubationsperiode for dyb penetration13. EdU-mærkning undslipper trinene til denaturering af prøver og bevarer således ultrastrukturen. Denne funktion er fordelagtig for downstream-funktionelle analyser såsom co-lokaliseringseksperimenter og stamcelletransplantation11,12. EdU-mærkning er også meget følsom og hurtig; prøvepenetrationen er høj på grund af brugen af hurtigt absorberede og mindre fluorescerende azider til påvisning af EdU-etiketter gennem en Cu (I) -katalyseret [3 + 2] cycloadditionsreaktion ("klik" kemi)14.
En anden stadig mere anvendt DNA-mærkningsmetode er brugen af konstruerede transgene mus. Disse mus udtrykker histon 2B grønt fluorescerende protein (H2B-GFP) styret af et tetracyklinresponsivt regulatorelement 5,14. Efter fodring af mus med tetracyklinchow/vand i en 4-ugers til 4-måneders jagtperiode, vil GFP-fluorescensen falde i cykelceller, og kun LRC'er bevarer fluorescensen6. Fordelen ved denne metode er, at de mærkede LRC'er kan isoleres og forblive levedygtige til cellekultur eller downstream-funktionelle analyser 6,7. Nogle undersøgelser rapporterede unøjagtig mærkning af hvilende stamceller, når de jages til langvarig brug. Dette resultat skyldtes et utæt baggrundsudtryk fra H2B-GFP-stammen og ikke det passende tetracyklinregulerede respons15.
Desuden brugte det meste litteratur tidligere LRC'ernes detektion hovedsageligt på sektionerede dias, som er todimensionelle og ofte fejlagtigt forudindtaget i at vise den nøjagtige placering og antallet af LRC'er. Fremgangsmåden viste forkerte vinkler for sektioner af komplekse vævsstrukturer16. Den anden metode var at opnå 3D-billeder fra serielle sektioner og udføre post-image rekonstruktioner. Disse trin var unøjagtige på grund af billedforvrængning fra variationer i hvert serielt afsnit på grund af komprimerede eller strakte sektioner, hvilket resulterede i manglende information16,17,18. Metoden var også besværlig og tidskrævende.
For at lette helmonteringsbilleddannelsen af LRC'er skal prøverne gøres klare, mens fluorescensen vedligeholdes godt. Nuværende vævsrensningsteknikker kan klassificeres i tre hovedkategorier: organiske opløsningsmiddelbaserede vævsrensningsteknikker, vandige reagensbaserede vævsrensningsteknikker og hydrogelbaserede vævsrensningsteknikker17,19. Det polyethylenglycol (PEG)-associerede opløsningsmiddelsystem (PEGASOS) er for nylig blevet udviklet. Denne tilgang gør næsten alle typer væv gennemsigtige og bevarer endogen fluorescens, herunder hårdt væv som knogler og tænder20. PEGASOS-metoden har fordele i forhold til andre vævsrensningsmetoder, især ved rensning af tand- og knoglematerialer. De fleste andre metoder kunne kun delvis fjerne hårdt væv, have lange behandlingstider eller kræve dyre reagenser21. PEGASOS-metoden kan også effektivt bevare endogen fluorescens frem for andre metoder.
Denne litteratur førte os til at skabe en ny metode til celleundersøgelse. Vi kombinerede LRC's detektionsfordele ved EdU-mærkning med den mest overlegne 3D-helmonterede billeddannelse af vævsrensede prøver; Prøverne blev behandlet med avanceret polyethylenglycol (PEG)-associeret opløsningsmiddelsystem (PEGASOS) vævsrydningsteknik15. Gennemsigtighed i hårdt væv gjorde det muligt for os at rekonstruere 3D-signalet fra LRC's fluorescens in vivo uden at knække tænderne eller underkæben, hvilket skabte en mere præcis måde at visualisere og kvantificere LRC'er på.
I denne undersøgelse giver vi en innovativ guide til visualisering af LRC'er i musefortænderne. Vi lavede en visuel 3D-tilgang til at bestemme placeringen og mængden af LRC'er inden for musefortandstamcellenichen. Dette projekt brugte EdU-mærkning, PEGASOS-vævsrensningsteknikker og konfokal mikroskopi. Vores metode til EdU-mærkning af LRC'erne på helmonteret væv og brugen af en ryddet og gennemsigtig prøve overvinder både begrænsningerne ved traditionelle sektionerede dias og andre ufordelagtige DNA-mærkningsmetoder. Således vil vores teknik være velegnet til undersøgelser af stamcellehomeostase, der kræver LRC-detektion, især på hårdt væv. Protokollen kan være lige så fordelagtig for dem, der fokuserer på stamcellehomeostase i andre væv og organer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#215; Objective/NA 0.9</td>
			<td>Leica</td>
			<td>507702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bezyl benzoate (BB)</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>409529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane 9.0.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND cavity slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>BR475505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation Pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>23609-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Carboynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Miiilipore Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X Software</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehye</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGMMA500</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>447943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfa-Cyanine 3 Azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>D1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-10X</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-butanol (tB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>360538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing

Murinforænden er et organ, der vokser kontinuerligt gennem musens levetid. De epitel- og mesenkymale stamceller, der er bosiddende i forændernes proksimale væv, giver anledning til afkom, der vil differentiere sig til ameloblaster, odontoblaster og pulpfibroblaster. Disse celler er afgørende for at understøtte den vedvarende omsætning af fortændervæv, hvilket gør murinfortænderne til en fremragende model til at studere homeostase af voksne stamceller. Stamceller menes at indeholde langlevende hvilende celler, der kan mærkes med nukleotidanaloger såsom 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU). Cellerne bevarer denne etiket over tid og kaldes derfor etiketbevarende celler (LRC'er). Tilgange til visualisering af LRC'er in vivo giver et robust værktøj til overvågning af stamcellehomeostase. I denne undersøgelse beskrev vi en metode til visualisering og analyse af LRC'er. Vores innovative tilgang indeholder LRC'er i musefortænder efter vævsrensning og helmonteret EdU-farvning efterfulgt af konfokal mikroskopi og en 3-dimensionel (3D) rekonstruktion med billedbehandlingssoftwaren. Denne metode muliggør indsamling af 3D-billeddannelse og upartisk kvantificering sammenlignet med traditionel LRC-analyse på dias med sektioner.

Efter EdU-mærkning og PEGASOS-vævsrensningsprocessen (figur 2) blev den gennemsigtige underkæbe opnået som vist på vores billede (figur 3B). Vi sammenlignede den modificerede prøve med en normal underkæbe uden en vævsrensningsproces (figur 3A). Den gennemsigtige underkæbe (figur 3B) med EdU-mærkning blev udsat for konfokal billeddannelse. Vi fokuserede på fortænderspidsen, der viser stamcell...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing at JoVE.com

Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing

Musens fortænder indeholder værdifulde etiketbevarende celler i sin stamcelleniche. Vi har en ny måde til upartisk at detektere og kvantificere de etiketbevarende celler; vores undersøgelse brugte EdU-mærkning og en 3D-rekonstruktionstilgang efter PEGASOS-vævsrensning af underkæben.

Påvisning og kvantificering af etiketbevarende celler i musefortænder ved hjælp af en 3D-rekonstruktionstilgang efter vævsrydning

The murine incisor is an organ that grows continuously throughout the lifespan of the mouse. The epithelial and mesenchymal stem cells residing in the ...

Denne protokol beskriver en metode til in vivo og tredimensionel visualisering og kvantificering af de etiketbevarende celler i musefortandstamcelleniche. Denne teknik er tidsbesparende og brugervenlig for nye elever. 3D-billederne erhverves uden at beskadige vævet.3D-kvantificeringen gør dataene mere pålidelige og nøjagtige. Til at begynde med dissekeres mandiblerne. Fastgør prøverne i 4% paraformaldehyd, og opbevar dem ved stuetemperatur natten over.Efter inkubationen skal du fjerne musklerne fra mandiblerne. Dyp dem i 0,5-molær ethylendiamintetraeddikesyreopløsning for at afkalke i fire dage med en daglig mediumændring på en 37 grader Celsius ryster. Affarve mandiblerne i 15 ml 25% Quadrol-opløsning på en 37-graders Celsius-ryster i en dag for at fjerne den resterende blodhæm.Til helmonteret 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridinfarvning skal du forberede en frisk 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridin-mærkningscocktail som nævnt i teksten. Skyl mandiblerne med en fosfatbufret saltvand med Tween 20 eller PBST i 30 minutter på en 37 grader Celsius ryster. Gentag skylning af mandiblerne med fosfatbufret saltvand tre gange i tre minutter hver, efterfulgt af inkubation i en frisklavet 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridin-mærkningscocktail på en shaker natten over.Gentag den fosfatbufferede saltvandsvask tre gange, og udfør seriel delipidering ved at placere mandiblerne i de opløsninger, der er nævnt i teksten, i seks timer hver i 37 grader Celsius ryster. Dehydrer mandiblerne i tert-butanol-polyethylenglycol eller tB-PEG-opløsning i to dage ved 37 grader Celsius med den daglige mediumændring. Efter to dage ryddes underkæben i benzylbenzoat-polyethylenglycol-clearingmedium indeholdende 75 % benzylbenzoat, 22 % polyethylenglycol-methylethermethacrylat gennemsnit 500 eller PEG-MMA500 og 3 % quadrol for at opnå brydningsindeksmatchning, og indtil der er opnået gennemsigtighed.Monter den vævsrensede hele underkæbe på mærkehulrumsglas i benzylbenzoat-polyethylenglycol-clearingmediet, og dæk det med glasdækselglas. I den konfokale billedbehandlingssoftware skal du indstille de ønskede billedoptagelsesparametre. I panelet til fluorescerende excitation skal du aktivere den laser, der kræves for at excitere fluoroforer optimalt.I panelet til fluorescerende detektion skal du flytte skyderen for at vælge de bølgelængder, der skal måles. Tilsæt en dråbe nedsænkningsolie med et brydningsindeks på 1,52 oven på dæksedlen for at matche brydningsindekset for glasdækslet og objektivet, og placer den monterede underkæbe på mikroskoptrinnet. Tænd lysstofrørene, og vælg et passende forstørrelsesmål for at afbilde områder af interesse.I live scan-tilstand skal du identificere synsfeltet for at visualisere hele underkæbens område i X- og Y-dimensionerne. Indstil de øvre og nedre Z-trins erhvervelsesparametre, der nøjagtigt dækker volumenet af stamcellenichen i musefortænderne. Brug en Z-trinstørrelse på to mikrometer eller efter dine krav.Hent og gem Z-stack-billedfiler i lif-format. Brug en billedbehandlingssoftwarefilkonverter til at konvertere Z-stack-billedfilen til den oprindelige formatfiltype. Klik på knappen Arena i billedbehandlingssoftwaren, og vælg derefter Billede.Vælg den oprindelige lif-fil, og vælg den flettede fil. Billederne importeres til billedbehandlingssoftwaren. Dobbeltklik på den importerede fil for at åbne billeddatasættet.I billedbehandlingssoftwaren skal du besøge panelet Skærmjustering. I panelet Skærmjustering skal du klikke på navnet på kanalen. Det er normalt mærket som rødt i standardtilstand.I vinduet Billedegenskaber skal du klikke på fanen Tilknyttet farve. I indstillingen Farvefanefil skal du vælge Fire Flow og derefter klikke på OK. Vælg visningsfarven for at skelne baggrundsfluorescensen og den positive fluorescens fra prøven. Øverst til venstre på skærmen i ruden Sceneegenskaber skal du klikke på det blå ikon mærket Tilføj ny overflade.Fjern markeringen af lydstyrkeikonet for at fjerne det meste af baggrundsfluorescensen, hvilket resulterer i den positive fluorescens, der er tydeligt synlig under manuel segmentering. Start derefter den manuelle segmentering af interesseområdet eller ROI ved at klikke på fanen Opret og vælge fanen Spring automatisk oprettelse over, rediger manuelt. I guiden til manuel overfladeoprettelse skal du klikke på fanen Kontur for at vælge retningen baseret på prøverne for let at konturere ROI.Sørg derefter for, at markørmenuen i højre hjørne er i Vælg tilstand. Juster udsnitspositionen for at finde ROI i vævet. Som tidligere nævnt er det meste baggrundsfluorescens allerede fjernet.Klik på knappen Tegn, og tegn et foreløbigt interesseområde. Vælg indstillingen Synlighed til Ingen for at undgå interferens fra andre områder end investeringsafkast, efterfulgt af segmentering af interesseområdet skive for udsnit. Når ROI-tegningen er færdig, skal du klikke på Opret Surface for at få en 3D-geometri af ROI.Klik på knappen Rediger i guiden til manuel oprettelse af overflade, og vælg Mask alle. I vinduet Maskekanal i pop op-vinduet skal du vælge Kanal 1 i indstillingerne for kanalvalg. Vælg derefter Dupliker kanal, før du anvender masken.I maskeindstillingerne skal du vælge Konstant indvendig/udvendig og indstille voxelens udvendige overflade til nul. Fravælg overfladeobjektet i ruden Sceneegenskaber, og vælg objektet Lydstyrke. I Skærmjustering skal du fravælge den oprindelige røde kanal og vælge kanalen Maskeret rød.Og juster farveintensiteterne for at få den ønskede 3D-gengivne og positivt mærkede fluorescens-ROI. Opret et nyt staffagefarveobjekt ved at klikke på ikonet Pletter for at kvantificere de 3D-gengivne etiketbevarende celler ved at oprette 3D-pletter, der sammenligneligt overlapper 3D-gengivne etiketbevarende celler. Brug de nederste pile til at flytte mellem trinnene i guiden til oprettelse af staffage.Klik på knappen Udfør, og vælg knappen Statistik. Vælg derefter fanen Samlet for at finde værdien for det samlede antal pletter i billedet. Efter 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridinmærkning og vævsrensningsprocessen for polyethylenglycol-associeret opløsningsmiddelsystem blev den gennemsigtige underkæbe opnået.Den modificerede prøve blev sammenlignet med en normal underkæbe uden en vævsrensningsproces, og en gennemsigtig underkæbe med 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridin-mærkning blev udsat for konfokal billeddannelse. Den optiske del af fortænderne viste etiketbevarende celler i stamcellenichen i fortandspidsen i XY-planet. 3D-billedkonstruktionen af en fortandspids viste 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridin-positive etiketbevarende hvilende stamceller i både epitel- og mesenkymalstamcellenichen.De 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridin-positive celler blev overført til pletter til kvantificering, der sammenligneligt overlappede med de mesenkymale etiketbevarende celler. De pletter, der kun er oprettet til mesenkymale etiketbevarende celler og kun til epiteletiketbevarende celler, er synlige i billedet. Kvantificering af epitel- og mesenkymale etiketfastholdende celler blev også udført.Egenskaber til behandling og clearing er de vigtigste trin og bør optimeres i henhold til vævets anvendelse for at opnå tilfredsstillende resultater. Denne metode kan også ændres for at visualisere LRC'er på S2VGFP-niveau og i sporing af celleafstamning for at få detaljer om afkomsplacering og deres kvantificering eller bidrag.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Underskudsgivende og Gain-of-funktion tilgang til Undersøge Tidlig Cell Fate Determinanter i præimplantationsperioden Mouse Embryoner

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produktionen af ​​pluripotente stamceller fra mus fostervand Celler Ved hjælp af en Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

En standardiseret tilgang til multispecies Rensning af mammale mannlige germeller ved hjælp af mekanisk vævsdissociation og flowcytometri

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal Hel Mount: En Novel Processing and Imaging Protocol for Tykke, Tredimensionale Tissue Tværsnit af Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescerende mærkning af mikrotubuli og Centrosomal proteiner i Ex Vivo tarmens væv og 3D In Vitro tarm Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation af Somite derivater fra menneskelige induceret celler pluripotente stamceller

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Tredimensionalt Angiogeneseanalysesystem ved hjælp af co-Culture Sfæroider dannet af Endotelkoloni dannende celler og mesenchymale stamceller

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Visualisering og analyse af Pharyngeal Arch Arterier ved hjælp af fuld-mount Immunohistochemistry og 3D Rekonstruktion

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Forberedelse af små RNA-biblioteker til sekventering fra tidlige museembryoner

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...