Name: detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing
Uploaded: 2022-06-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing at JoVE.com

We danken Meghann K. Holt voor het bewerken van het manuscript. Deze studie werd ondersteund door NIH / NIDCR-subsidies DE026461 en DE028345 en de opstartfinanciering van de Texas A &M School of Dentistry aan Dr. Xiaofang Wang.

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) voor Texas A &M University College of Dentistry.
1. Bereiding van de EdU labeling cocktail
<ol><li>Bereid de cocktailbouillonoplossingen zoals beschreven in tabel 1.</li>
	<li>Bereid de EdU-etiketteringscocktail zoals beschreven in tabel 1.</li>
</ol>2. Bereiding van de muizen en EdU-oplossing
...

<ol>
	<li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+incisor+through+gene+co-expression+analysis.">Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis.</a> eLife. 6, 24712 (2017).</li><li>Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+tooth+development,+growth,+repair,+and+regeneration.">Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).</li><li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quiescent+cell+population+replenishes+mesenchymal+stem+cells+to+drive+accelerated+growth+in+mouse+incisors.">A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors.</a> Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).</li><li>Biehs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMI1+represses+Ink4a/Arf+and+Hox+genes+to+regulate+stem+cells+in+the+rodent+incisor.">BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor.</a> Nature Cell Biology. 15 (7), 846-852 (2013).</li><li>Sharir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+pool+of+actively+cycling+progenitors+orchestrates+self-renewal+and+injury+repair+of+an+ectodermal+appendage.">A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage.</a> Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).</li><li>Terskikh, V. V., Vasiliev, A. V., Vorotelyak, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label+retaining+cells+and+cutaneous+stem+cells.">Label retaining cells and cutaneous stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 414-425 (2012).</li><li>de Miguel-Gomez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+the+endometrium:+From+the+discovery+of+adult+stem+cells+to+pre-clinical+models.">Stem cells and the endometrium: From the discovery of adult stem cells to pre-clinical models.</a> Cells. 10 (3), 595 (2021).</li><li>Ishikawa, Y., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+adult+stem+cells+in+murine+teeth+are+regulated+by+Shh+signaling.">Quiescent adult stem cells in murine teeth are regulated by Shh signaling.</a> Cell and Tissue Research. 369 (3), 497-512 (2017).</li><li>Chehrehasa, F., Meedeniya, A. C., Dwyer, P., Abrahamsen, G., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU,+a+new+thymidine+analogue+for+labelling+proliferating+cells+in+the+nervous+system.">EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 122-130 (2009).</li><li>Solius, G. M., Maltsev, D. I., Belousov, V. V., Podgorny, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+nucleotide+analogue-based+techniques+for+tracking+dividing+stem+cells:+An+overview.">Recent advances in nucleotide analogue-based techniques for tracking dividing stem cells: An overview.</a> The Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101345 (2021).</li><li>Ning, H., Albersen, M., Lin, G., Lue, T. F., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+EdU+labeling+on+mesenchymal+stem+cells.">Effects of EdU labeling on mesenchymal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (1), 57-63 (2013).</li><li>Lin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+tracking+of+mesenchymal+stromal+cells+with+EdU.">Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU.</a> Cytotherapy. 11 (7), 864-873 (2009).</li><li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Challen, G. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+expression+of+H2B-GFP+transgene+in+hematopoietic+stem+cells.">Promiscuous expression of H2B-GFP transgene in hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 3 (6), 2357 (2008).</li><li>Kopecky, B. J., Duncan, J. S., Elliott, K. L., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstructions+from+optical+sections+of+thick+mouse+inner+ears+using+confocal+microscopy.">Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).</li><li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+technique:+Recent+progress+and+biomedical+applications.">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing.">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+application+to+bone+and+dental+tissues.">Tissue clearing and its application to bone and dental tissues.</a> Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Fink, J., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cell+lineage+tracing+and+deep+tissue+imaging.">Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging.</a> BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).</li></ol>

Meerdere doses injecties (BrdU, EdU) worden meestal gebruikt op groeiende neonatale muizen om prolifererende cellen zoveel mogelijk te labelen 1,6,13. De achtervolgingsperiode wordt beschouwd als een cruciale stap met betrekking tot de vernieuwingssnelheid van weefsels 6,13. De muizensnijtand vernieuwt zichzelf ongeveer elke maand. Met deze eigenschap kunnen onderzoekers...

De continu groeiende muizensnijtand is een uitstekend model voor het bestuderen van volwassen stamcellen1. De epitheliale (labiale en linguale cervicale lus) en mesenchymale stamcellen (tussen de labiale en linguale cervicale lus) die zich aan de proximale kant van de snijtand bevinden, differentiëren in ameloblasten, odontoblasten en tandpulpcellen. Dit unieke proces biedt een bron van cellen voor compensatie van weefselverlies en omzet2. Hoewel verschillende stamcelmarkers zoals Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1, enz. in vivo zijn geïdentificeerd voor de subgroepen van volwassen stamcellen in muizensnijtanden, zijn zij ontoereikend om de stamcelpopulaties weer te geven wanneer zij alleen worden gebruikt 1,3,4,5. Het visualiseren van langlevende rustcellen door nucleotide analoge DNA-labeling en -retentie zou onbevooroordeelde detectie kunnen bieden voor de meeste subsets van volwassen stamcellen6. Verder is deze benadering nuttig bij veel stamcelidentificatiemethoden7 voor het begrijpen van celgedrag en de homeostase van tandheelkundige stamcelpopulaties 3,8. Terwijl de delende stamcellen na een aanzienlijke achtervolging hun DNA-labeling zouden verliezen, behouden de vermeende rustige stamcellen hun DNA-label en beschouwen ze ze als label-retaining cells (LRC's)6. DNA-etikettering en -retentie door niet-delende stamcellen zal de vermeende volwassen stamcellen in hun niches markeren en lokaliseren.
In de afgelopen jaren heeft thymidine analoge 5-broom-2′-deoxyuridine (BrdU) etikettering de omslachtige, tijdrovende en hoge resolutie microscopie incompatibele 3H-thymidine DNA etiketteringsmethode voor celproliferatie assays 6,9 vervangen. In de afgelopen jaren is de 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) etiketteringstechniek steeds vaker gebruikt dan BrdU. Dit patroon ontstond om verschillende redenen. Ten eerste is de BrdU-methode traag en arbeidsintensief. De gebruikersomstandigheden zijn variabel en het is niet in staat om de ultrastructuur in monsters te behouden (vanwege DNA-denaturatie). Evenzo verliest de BrdU-methode de antigeniciteit van cellen, waardoor deze inefficiënt wordt voor downstream functionele analyses en assays zoals de co-lokalisatie-experimenten en in vivo stamceltransplantatie 3,7,9,10,11,12. BrdU is ook een teratogeen, dat niet geschikt is voor het labelen van LRC's in embryonale ontwikkeling6. Ook is de BrdU-methode inefficiënt wanneer deze wordt gebruikt in de monsters met een hele montage. De nadelen zijn een lage penetratie van antilichamen in het diepe deel van monsters of de vereiste van een lange incubatietijd van antilichamen voor diepe penetratie13. EdU-etikettering ontsnapt aan de stappen van denaturerende exemplaren, waardoor de ultrastructuur behouden blijft. Deze functie is voordelig voor downstream functionele analyses zoals co-lokalisatie-experimenten en stamceltransplantatie11,12. Ook is EdU-etikettering zeer gevoelig en snel; de penetratie van monsters is hoog vanwege het gebruik van snel geabsorbeerde en kleinere fluorescerende aziden voor het detecteren van EdU-labels via een Cu(I)-gekatalyseerde [3 + 2] cycloadditiereactie ("klik"-chemie)14.
Een andere steeds meer toegepaste DNA-etiketteringsmethode is het gebruik van gemanipuleerde transgene muizen. Deze muizen drukken histon 2B groen fluorescerend eiwit (H2B-GFP) uit, gecontroleerd door een tetracycline-responsief regulatorelement 5,14. Na het voeden van muizen met tetracycline chow / water gedurende een achtervolgingsperiode van 4 weken tot 4 maanden, zal de GFP-fluorescentie afnemen in cyclische cellen en behouden alleen LRC's de fluorescentie6. Het voordeel van deze methode is dat de gelabelde LRC's kunnen worden geïsoleerd en levensvatbaar blijven voor celkweek of downstream functionele analyses 6,7. Sommige studies meldden onnauwkeurige etikettering van rustige stamcellen wanneer ze werden achtervolgd voor langdurig gebruik. Dit resultaat was te wijten aan een lekkende achtergrondexpressie van de H2B-GFP-stam en niet aan de juiste tetracycline-gereguleerde respons15.
Bovendien gebruikte de meeste literatuur in het verleden de detectie van LRC's voornamelijk op doorsnededia's, die tweedimensionaal zijn en vaak ten onrechte bevooroordeeld bij het weergeven van de nauwkeurige locatie en het aantal LRC's. De benadering toonde onjuiste hoeken voor secties van complexe weefselstructuren16. De andere methode was om 3D-beelden te verkrijgen uit seriële secties en post-image reconstructies uit te voeren. Deze stappen waren onnauwkeurig vanwege beeldvervorming van variaties in elke seriële sectie als gevolg van gecomprimeerde of uitgerekte secties, wat resulteerde in ontbrekende informatie16,17,18. De methode was ook bewerkelijk en tijdrovend.
Om de beeldvorming van LRC's met volledige montage te vergemakkelijken, moeten monsters duidelijk worden gemaakt terwijl de fluorescentie goed wordt onderhouden. De huidige weefselopruimingstechnieken kunnen worden ingedeeld in drie hoofdcategorieën: organische op oplosmiddelen gebaseerde weefselopruimingstechnieken, op water gebaseerde weefselopruimingstechnieken en op hydrogel gebaseerde weefselopruimingstechnieken17,19. Het polyethyleenglycol (PEG)-geassocieerde oplosmiddelsysteem (PEGASOS) is onlangs ontwikkeld. Deze aanpak maakt bijna alle soorten weefsels transparant en behoudt endogene fluorescentie, inclusief harde weefsels zoals bot en tanden20. De PEGASOS-methode heeft voordelen ten opzichte van andere weefselverwijderingsmethoden, vooral bij het opruimen van tand- en botmaterialen. De meeste andere methoden kunnen harde weefsels slechts gedeeltelijk verwijderen, hebben lange verwerkingstijden of vereisen dure reagentia21. Ook kan de PEGASOS-methode endogene fluorescentie efficiënt behouden ten opzichte van andere methoden.
Deze literatuur bracht ons ertoe een nieuwe methode voor celstudie te creëren. We combineerden de LRC-detectievoordelen van EdU-etikettering met de meest superieure 3D-beeldvorming van weefselgeklaarde monsters; monsters werden verwerkt met geavanceerde polyethyleenglycol (PEG)-geassocieerde oplosmiddelsysteem (PEGASOS) weefselzuiveringstechniek15. Harde weefseltransparantie stelde ons in staat om het 3D-signaal van LRC's fluorescentie in vivo te reconstrueren zonder de tanden of onderkaak te breken, waardoor een nauwkeurigere manier ontstond om LRC's te visualiseren en te kwantificeren.
In deze studie bieden we een innovatieve gids om LRC's in de muizensnijtand te visualiseren. We hebben een visuele 3D-benadering gemaakt om de locatie en hoeveelheid LRC's in de stamcelniche van de muissnijtand te bepalen. Dit project maakte gebruik van EdU-etikettering, PEGASOS-weefselopruimingstechnieken en confocale microscopie. Onze methode van EdU labelen van de LRC's op whole-mount weefsel en het gebruik van een gewist en transparant monster overwint zowel de beperkingen van traditionele doorgesneden dia's als andere nadelige DNA-etiketteringsmethoden. Onze techniek zal dus geschikt zijn voor studies naar stamcelhomeostase die LRC-detectie vereisen, vooral op harde weefsels. Het protocol kan even voordelig zijn voor degenen die zich richten op stamcelhomeostase in andere weefsels en organen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#215; Objective/NA 0.9</td>
			<td>Leica</td>
			<td>507702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bezyl benzoate (BB)</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>409529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane 9.0.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND cavity slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>BR475505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation Pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>23609-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Carboynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Miiilipore Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X Software</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehye</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGMMA500</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>447943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfa-Cyanine 3 Azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>D1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-10X</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-butanol (tB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>360538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing

De muriene snijtand is een orgaan dat continu groeit gedurende de levensduur van de muis. De epitheliale en mesenchymale stamcellen die zich in de proximale weefsels van snijtanden bevinden, geven aanleiding tot nakomelingen die zullen differentiëren in ameloblasten, odontoblasten en pulpfibroblasten. Deze cellen zijn cruciaal bij het ondersteunen van de aanhoudende omzet van snijtanden, waardoor de muizensnijtand een uitstekend model is voor het bestuderen van de homeostase van volwassen stamcellen. Stamcellen worden verondersteld langlevende rustcellen te bevatten die kunnen worden gelabeld door nucleotide-analogen zoals 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU). De cellen behouden dit label na verloop van tijd en worden daarom label-retaining cells (LRC's) genoemd. Benaderingen voor het visualiseren van LRC's in vivo bieden een robuust hulpmiddel voor het monitoren van stamcelhomeostase. In deze studie beschreven we een methode voor het visualiseren en analyseren van LRC's. Onze innovatieve aanpak omvat LRC's in muissnijtanden na weefselverwijdering en EdU-kleuring met hele montage, gevolgd door confocale microscopie en een 3-dimensionale (3D) reconstructie met de beeldvormingssoftware. Deze methode maakt 3D-beeldvormingsacquisitie en niet-bevooroordeelde kwantificering mogelijk in vergelijking met traditionele LRC-analyse op doorsnededia's.

Na EdU-etikettering en het PEGASOS-weefselreinigingsproces (figuur 2) werd de transparante onderkaak verkregen zoals weergegeven in onze afbeelding (figuur 3B). We vergeleken het gemodificeerde monster met een normale onderkaak zonder weefselzuiveringsproces (figuur 3A). De transparante onderkaak (figuur 3B) met EdU-etikettering werd onderworpen aan confocale beeldvorming. We concentreerden ons op de sn...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing at JoVE.com

Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing

De muizensnijtand bevat waardevolle labelhoudende cellen in zijn stamcelniche. We hebben een nieuwe manier om de labelvasthoudende cellen onbevooroordeeld te detecteren en te kwantificeren; onze studie gebruikte EdU-etikettering en een 3D-reconstructiebenadering na PEGASOS-weefselverwijdering van de onderkaak.

Detectie en kwantificering van labelvasthoudende cellen in muizensnijtanden met behulp van een 3D-reconstructiebenadering na weefselverwijdering

The murine incisor is an organ that grows continuously throughout the lifespan of the mouse. The epithelial and mesenchymal stem cells residing in the ...

Dit protocol beschrijft een methode voor in vivo en driedimensionale visualisatie en kwantificering van de label-retaining cellen van muizen snijtand stamcel niche. Deze techniek is tijdbesparend en gebruiksvriendelijk voor nieuwe leerlingen. De 3D-beelden worden verkregen zonder het weefsel te beschadigen.De 3D-kwantificering maakt de gegevens betrouwbaarder en nauwkeuriger. Om te beginnen, ontleed de kaken. Bevestig de monsters in 4% paraformaldehyde en bewaar ze een nacht op kamertemperatuur.Verwijder na de incubatie de spieren uit de kaken. Dompel ze onder in 0,5-molaire ethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing om gedurende vier dagen te ontkalken met een dagelijkse mediumwissel op een 37-graden Celsius shaker. Ontkleur de kaken in 15 milliliter 25% Quadrol-oplossing op een 37-graden Celsius shaker gedurende één dag om het resterende bloedheem te verwijderen.Voor hele mount 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine kleuring, bereid een verse 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine etiketteringscocktail zoals vermeld in de tekst. Spoel de kaken met een met fosfaat gebufferde zoutoplossing met Tween 20 of PBST gedurende 30 minuten op een 37 graden Celsius shaker. Spoel de kaken driemaal drie minuten met fosfaat-gebufferde zoutoplossing gedurende drie minuten, gevolgd door incubatie in een vers bereide 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine etiketteringscocktail op een shaker 's nachts.Herhaal de fosfaat-gebufferde zoutoplossing drie keer en voer seriële delipidatie uit door de kaken gedurende zes uur in de in de tekst genoemde oplossingen in een 37-graden Celsius shaker te plaatsen. Droog de kaken uit in tert-butanol-polyethyleenglycol, of tB-PEG, oplossing gedurende twee dagen bij 37 graden Celsius met de dagelijkse mediumverandering. Verwijder na twee dagen de onderkaak in benzylbenzoaat-polyethyleenglycolreinigingsmedium dat 75% benzylbenzoaat, 22% polyethyleenglycol-methylethermethacrylaat gemiddeld 500 of PEG-MMA500 en 3% Quadrol bevat om refractieindexmatching te verkrijgen en totdat transparantie is bereikt.Monteer de met weefsel gezuiverde hele onderkaak op merkholteglaasjes in het benzylbenzroom-polyethyleenglycolreinigingsmedium en bedek het met glazen afdekplaten. Stel in de confocale beeldvormingssoftware de gewenste beeldacquisitieparameters in. Activeer in het paneel voor fluorescerende excitatie de laser die nodig is om fluoroforen optimaal te exciteren.Verplaats in het paneel voor fluorescerende detectie de schuifregelaar om de golflengten te selecteren die moeten worden gemeten. Voeg een druppel dompelolie met een brekingsindex van 1,52 toe aan de bovenkant van de dekplaat om overeen te komen met de brekingsindex van de glazen dekplaat en het objectief, en plaats de gemonteerde onderkaak op het microscooppodium. Schakel de fluorescentielampen in en kies een geschikt vergrotingsobjectief om interessante gebieden in beeld te brengen.Identificeer in de live scanmodus het gezichtsveld om het hele gebied van de onderkaak in de X- en Y-dimensies te visualiseren. Stel de bovenste en onderste Z-stadiumacquisitieparameters in die nauwkeurig het volume van de stamcelnis in de muizensnijtand dekken. Gebruik een Z-stapgrootte van twee micrometer of volgens uw vereiste.Verkrijg en bewaar Z-stack afbeeldingsbestanden in lif-indeling. Gebruik een bestandsconversieprogramma voor beeldsoftware om het Z-stack-afbeeldingsbestand naar het oorspronkelijke bestandstype te converteren. Klik in de beeldbewerkingssoftware op de knop Arena en kies vervolgens Afbeelding.Selecteer het oorspronkelijke lif-bestand en kies het samengevoegde bestand. De beelden worden geïmporteerd in de imaging software. Dubbelklik op het geïmporteerde bestand om de afbeeldingsgegevensset te openen.Ga in de beeldbewerkingssoftware naar het deelvenster Beeldschermaanpassing. Klik in het deelvenster Weergaveaanpassing op de naam van het kanaal. Het wordt meestal gelabeld als rood in de standaardmodus.Klik in het venster Afbeeldingseigenschappen op het tabblad Toegewezen kleur. Kies in de optie Color Tab File de optie Fire Flow en klik vervolgens op OK. Selecteer de weergavekleur om de achtergrondfluorescentie en de positieve fluorescentie van het monster te onderscheiden. Klik linksboven in het scherm in het deelvenster Scène-eigenschappen op het blauwe pictogram met het label Nieuwe surface toevoegen.Schakel het pictogram Volume uit om het grootste deel van de achtergrondfluorescentie te verwijderen, waardoor de positieve fluorescentie duidelijk zichtbaar is tijdens handmatige segmentatie. Start vervolgens de handmatige segmentatie van de interesseregio of ROI door op het tabblad Maken te klikken en het tabblad Automatisch maken overslaan, handmatig bewerken te selecteren. Klik in de wizard voor het handmatig maken van oppervlakken op het tabblad Contour om de oriëntatie te kiezen op basis van de voorbeelden om de ROI eenvoudig te contouren.Zorg er vervolgens voor dat het aanwijzermenu in de rechterhoek zich in de modus Selecteren bevindt. Pas de segmentpositie aan om de ROI in het weefsel te lokaliseren. Zoals eerder vermeld, is de meeste achtergrondfluorescentie al verwijderd.Klik op de knop Tekenen en teken een voorlopig interessegebied. Selecteer de optie Zichtbaarheid op Geen om interferentie van andere gebieden dan ROI te voorkomen, gevolgd door het segmenteren van het interessegebied segment voor segment. Nadat de ROI-tekening is voltooid, klikt u op Surface maken om een 3D-geometrie van de ROI te krijgen.Klik op de knop Bewerken in de wizard voor het handmatig maken van oppervlakken en selecteer Alles maskeren. Selecteer in het uitgeklapte venster Maskerkanaal de optie Kanaal 1 in de opties voor Kanaalselectie. Selecteer daarna Kanaal dupliceren voordat u het masker toepast.Selecteer in de maskerinstellingen Constant binnen/buiten en stel het voxelbuitenoppervlak in op nul. Hef in het deelvenster Scène-eigenschappen de selectie van het Surface-object op en selecteer het volumeobject. Hef in de weergaveaanpassing de selectie van het oorspronkelijke rode kanaal op en selecteer het kanaal Gemaskeerd rood.En pas de kleurintensiteiten aan om de gewenste 3D-gerenderde en positief gelabelde fluorescentie-ROI te krijgen. Maak een nieuw steunobject door op het pictogram Spots te klikken om de 3D-gerenderde labelbehoudende cellen te kwantificeren door 3D-vlekken te maken die vergelijkbaar overlappen met 3D-gerenderde labelbehoudende cellen. Gebruik de onderste pijlen om te schakelen tussen stappen in de wizard voor het maken van spots.Klik op de knop Voltooien en selecteer de knop Statistiek. Selecteer vervolgens het tabblad Algemeen om de waarde voor het totale aantal plekken in de afbeelding te vinden. Na 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine labeling en het polyethyleenglycol-geassocieerde oplosmiddelsysteem weefselopruimingsproces, werd de transparante onderkaak verkregen.Het gemodificeerde monster werd vergeleken met een normale onderkaak zonder een weefselzuiveringsproces en een transparante onderkaak met 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine-labeling werd onderworpen aan confocale beeldvorming. Het optische gedeelte van de snijtand toonde labelhoudende cellen in de stamcelnis van de snijtandtop in het XY-vlak. De 3D-beeldconstructie van een snijtandtop toonde 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine positieve label-behoudende rustcellen in zowel de epitheliale als mesenchymale stamcelniche.De 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine positieve cellen werden overgebracht naar plekken voor kwantificering die vergelijkbaar overlapten met de mesenchymale label-retaining cellen. De vlekken die alleen zijn gemaakt voor mesenchymale labelhoudende cellen en alleen voor epitheliale labelhoudende cellen zijn zichtbaar in de afbeelding. Kwantificering van epitheliale en mesenchymale labelhoudende cellen werd ook uitgevoerd.Eigenschappen voor verwerking en clearing zijn de belangrijkste stappen en moeten worden geoptimaliseerd op basis van het gebruik van het weefsel om bevredigende resultaten te verkrijgen. Deze methode kan ook worden aangepast om LRC's op S2VGFP-niveau te visualiseren en in cellijntracering om details te verkrijgen over de locatie van het nageslacht en hun kwantificering of bijdragen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Verlies- en Gain-of-function Aanpak Early Cell Fate Determinanten Onderzoek in Pre-implantatie muizenembryo&#39;s

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

De productie van pluripotente stamcellen van Mouse Vruchtwater cellen met behulp van een transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Een gestandaardiseerde benadering voor multispecies Zuivering van zoogdierkiemcellen door middel van mechanische weefseldissociatie en flowcytometrie

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontale gehele berging: Een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel dwarsdoorsneden van de huid

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-belichting fluorescerende etikettering van microtubuli en Centrosomal eiwitten in Ex Vivo intestinale weefsel en 3D In Vitro intestinale Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In Vitro generatie van Somiet derivaten uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen-cellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Driedimensionaal angiogenese-assay systeem met co-Culture Spheroids gevormd door endotheliale kolonie vormende cellen en mesenchymale stamcellen

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Visualisatie en analyse van faryngeale boogslagaders met behulp van Whole-mount Immunohistochemie en 3D Reconstructie

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Voorbereiding van kleine RNA-bibliotheken voor sequencing van vroege muisembryo's

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...