Name: detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing
Uploaded: 2022-06-10T14:00:00
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Wir danken Meghann K. Holt für die Bearbeitung des Manuskripts. Diese Studie wurde durch die NIH/NIDCR-Zuschüsse DE026461 und DE028345 sowie durch die Anschubfinanzierung der Texas A&M School of Dentistry an Dr. Xiaofang Wang unterstützt.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) für das Texas A&M University College of Dentistry genehmigt.
1. Zubereitung des EdU-Etikettiercocktails
<ol><li>Bereiten Sie die Cocktailstocklösungen wie in Tabelle 1 beschrieben vor.</li>
	<li>Bereiten Sie den EdU-Etikettierungscocktail wie in Tabelle 1 beschrieben vor.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Mäuse und EdU...

<ol>
	<li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+incisor+through+gene+co-expression+analysis.">Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis.</a> eLife. 6, 24712 (2017).</li><li>Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Challen, G. A., Goodell, M. 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L., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstructions+from+optical+sections+of+thick+mouse+inner+ears+using+confocal+microscopy.">Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).</li><li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+technique:+Recent+progress+and+biomedical+applications.">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Molbay, M., Kolabas, Z. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cell+lineage+tracing+and+deep+tissue+imaging.">Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging.</a> BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).</li></ol>

Mehrfachdosen von Injektionen (BrdU, EdU) werden normalerweise bei wachsenden neugeborenen Mäusen verwendet, um proliferierende Zellen so weit wie möglich zu markieren 1,6,13. Die Chasing-Periode gilt als kritischer Schritt in Bezug auf die Erneuerungsrate von Geweben 6,13. Der Schneidezahn der Maus erneuert sich etwa jeden Monat. Diese Eigenschaft ermöglicht es Forsc...

Der kontinuierlich wachsende Schneidezahn der Maus ist ein hervorragendes Modell für die Untersuchung adulter Stammzellen1. Die epithelialen (labiale und linguale zervikale Schleife) und mesenchymalen Stammzellen (zwischen der labialen und lingualen zervikalen Schleife), die sich auf der proximalen Seite des Schneidezahns befinden, differenzieren sich in Ameloblasten, Odontoblasten und Zahnpulpazellen. Dieser einzigartige Prozess bietet eine Zellquelle zur Kompensation von Gewebeverlust und -umsatz2. Obwohl mehrere Stammzellmarker wie Sox2, Gli1, Thy1/CD90, Bmi1 usw. in vivo für die Untergruppen adulter Stammzellen in Schneidezähnen von Mäusen identifiziert wurden, sind sie bei alleiniger Anwendung nicht ausreichend, um die Stammzellpopulationen darzustellen 1,3,4,5. Die Visualisierung langlebiger ruhender Zellen durch nukleotidanaloge DNA-Markierung und -Retention könnte einen unverzerrten Nachweis für die meisten Untergruppen adulter Stammzellen ermöglichen6. Darüber hinaus ist dieser Ansatz unter vielen Stammzellidentifikationsmethoden7 nützlich, um das Zellverhalten und die Homöostase von dentalen Stammzellpopulationenzu verstehen 3,8. Während die sich teilenden Stammzellen nach einer längeren Verfolgungsjagd ihre DNA-Markierung verlieren würden, behalten die mutmaßlich ruhenden Stammzellen ihre DNA-Markierung bei, was sie als markierungserhaltende Zellen (LRCs) bezeichnet6. Die DNA-Markierung und -Retention durch sich nicht teilende Stammzellen markiert und lokalisiert die mutmaßlichen adulten Stammzellen in ihren Nischen.
In den letzten Jahren ersetzte die Markierung mit dem Thymidin-Analogon 5-Brom-2′-Desoxyuridin (BrdU) die umständliche, zeitaufwändige und hochauflösende, mikroskopisch inkompatible 3H-Thymidin-DNA-Markierungsmethode für Zellproliferationsassays 6,9. In den letzten Jahren wurde die 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin (EdU)-Markierungstechnik zunehmend über BrdU verwendet. Dieses Muster entstand aus mehreren Gründen. Erstens ist die BrdU-Methode langsam und arbeitsintensiv. Die Benutzerbedingungen sind variabel, und es ist nicht in der Lage, die Ultrastruktur in Proben zu erhalten (aufgrund der DNA-Denaturierung). Ebenso verliert die BrdU-Methode die Antigenität von Zellen, was sie für nachgelagerte funktionelle Analysen und Assays wie die Co-Lokalisationsexperimente und die In-vivo-Stammzelltransplantation ineffizient macht 3,7,9,10,11,12. BrdU ist auch ein Teratogen, das nicht für die Markierung von LRCs in der Embryonalentwicklung geeignet ist6. Außerdem ist die BrdU-Methode ineffizient, wenn sie in den Proben mit ganzer Montage verwendet wird. Die Nachteile sind eine geringe Penetration von Antikörpern im tiefen Teil der Proben oder die Notwendigkeit einer langen Antikörperinkubationszeit für eine tiefe Penetration13. Die EdU-Markierung entgeht den Schritten der Denaturierung von Proben, wodurch die Ultrastruktur erhalten bleibt. Diese Eigenschaft ist vorteilhaft für nachgelagerte funktionelle Analysen wie Co-Lokalisationsexperimente und Stammzelltransplantationen11,12. Außerdem ist die EdU-Kennzeichnung hochempfindlich und schnell; Die Probenpenetration ist aufgrund der Verwendung von schnell absorbierten und kleineren fluoreszierenden Aziden zum Nachweis von EdU-Markierungen durch eine Cu(I)-katalysierte [3 + 2] Cycloadditionsreaktion ("Klick"-Chemie) hoch14.
Eine weitere zunehmend angewandte DNA-Markierungsmethode ist die Verwendung von gentechnisch veränderten transgenen Mäusen. Diese Mäuse exprimieren das grün fluoreszierende Histon-2B-Protein (H2B-GFP), das durch ein Tetracyclin-responsives Regulatorelement 5,14 gesteuert wird. Nach der Fütterung von Mäusen mit Tetracyclin-Futter/Wasser für eine 4-wöchige bis 4-monatige Jagdperiode nimmt die GFP-Fluoreszenz in zyklischen Zellen ab und nur LRCs behalten die Fluoreszenz6. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass die markierten LRCs isoliert werden können und für Zellkulturen oder nachgeschaltete funktionelle Analysen lebensfähig bleiben 6,7. Einige Studien berichteten über eine ungenaue Markierung ruhender Stammzellen, wenn sie für den Langzeitgebrauch gejagt wurden. Dieses Ergebnis war auf eine undichte Hintergrundexpression des H2B-GFP-Stammes und nicht auf die entsprechende Tetracyclin-regulierte Reaktionzurückzuführen 15.
Darüber hinaus wurde in der Literatur in der Vergangenheit die LRC-Erkennung hauptsächlich auf Schnittobjektträgern verwendet, die zweidimensional sind und oft fälschlicherweise die genaue Position und Anzahl der LRCs anzeigen. Der Ansatz zeigte falsche Winkel für Schnitte komplexer Gewebestrukturen16. Die andere Methode bestand darin, 3D-Bilder aus seriellen Schnitten zu erhalten und Rekonstruktionen nach dem Bild durchzuführen. Diese Schritte waren aufgrund von Bildverzerrungen durch Variationen in jedem seriellen Abschnitt aufgrund komprimierter oder gestreckter Abschnitte ungenau, was zu fehlenden Informationen führte16,17,18. Die Methode war auch mühsam und zeitaufwändig.
Um die Whole-Mount-Bildgebung von LRCs zu erleichtern, müssen die Proben klar gemacht werden, während die Fluoreszenz gut erhalten bleibt. Aktuelle Gewebereinigungstechniken können in drei Hauptkategorien eingeteilt werden: Gewebereinigungstechniken auf der Basis organischer Lösungsmittel, Gewebereinigungstechniken auf der Basis von wässrigen Reagenzien und Gewebereinigungstechniken auf Hydrogelbasis17,19. Das Polyethylenglykol (PEG)-assoziierte Lösungsmittelsystem (PEGASOS) wurde kürzlich entwickelt. Dieser Ansatz macht nahezu alle Arten von Geweben transparent und bewahrt die endogene Fluoreszenz, einschließlich harter Gewebe wie Knochen und Zähne20. Die PEGASOS-Methode hat Vorteile gegenüber anderen Gewebereinigungsmethoden, insbesondere bei der Reinigung von Zahn- und Knochenmaterialien. Die meisten anderen Methoden konnten hartes Gewebe nur teilweise entfernen, haben lange Verarbeitungszeiten oder erfordern kostspielige Reagenzien21. Außerdem kann die PEGASOS-Methode die endogene Fluoreszenz gegenüber anderen Methoden effizient erhalten.
Diese Literatur führte uns dazu, eine neue Methode für die Zellstudie zu entwickeln. Wir kombinierten die LRC-Detektionsvorteile der EdU-Markierung mit der überlegensten 3D-Ganzkörperbildgebung von gewebegereinigten Proben. Die Proben wurden mit der fortschrittlichen Gewebereinigungstechnik des Polyethylenglykol (PEG)-assoziierten Lösungsmittelsystems (PEGASOS) verarbeitet15. Die Transparenz von Hartgewebe ermöglichte es uns, das 3D-Signal der LRC-Fluoreszenz in vivo zu rekonstruieren, ohne die Zähne oder den Unterkiefer zu brechen, wodurch eine genauere Methode zur Visualisierung und Quantifizierung von LRCs geschaffen wurde.
In dieser Studie bieten wir einen innovativen Leitfaden zur Visualisierung von LRCs im Mausschneidezahn. Wir haben einen visuellen 3D-Ansatz entwickelt, um die Position und Menge der LRCs in der Stammzellnische der Mausschneidezähne zu bestimmen. In diesem Projekt wurden EdU-Markierung, PEGASOS-Gewebereinigungstechniken und konfokale Mikroskopie verwendet. Unsere Methode der EdU-Markierung der LRCs auf Whole-Mount-Gewebe und die Verwendung einer gereinigten und transparenten Probe überwindet sowohl die Einschränkungen herkömmlicher Objektträger als auch anderer nachteiliger DNA-Markierungsmethoden. Daher eignet sich unsere Technik für Studien zur Stammzellhomöostase, die den Nachweis von LRCs erfordern, insbesondere an hartem Gewebe. Das Protokoll kann für diejenigen, die sich auf die Stammzellhomöostase in anderen Geweben und Organen konzentrieren, gleichermaßen vorteilhaft sein.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#215; Objective/NA 0.9</td>
			<td>Leica</td>
			<td>507702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bezyl benzoate (BB)</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>409529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane 9.0.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND cavity slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>BR475505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation Pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>23609-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Carboynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Miiilipore Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X Software</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehye</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGMMA500</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>447943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfa-Cyanine 3 Azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>D1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-10X</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-butanol (tB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>360538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing

Der murine Schneidezahn ist ein Organ, das während der gesamten Lebensdauer der Maus kontinuierlich wächst. Die epithelialen und mesenchymalen Stammzellen, die sich im proximalen Gewebe der Schneidezähne befinden, führen zu Nachkommen, die sich in Ameloblasten, Odontoblasten und Pulpa-Fibroblasten differenzieren. Diese Zellen sind entscheidend für die Unterstützung des anhaltenden Umsatzes von Schneidezähnengewebe, was den murinen Schneidezahn zu einem hervorragenden Modell für die Untersuchung der Homöostase adulter Stammzellen macht. Es wird angenommen, dass Stammzellen langlebige ruhende Zellen enthalten, die durch Nukleotidanaloga wie 5-Ethinyl-2'-desoxyuridin (EdU) markiert werden können. Die Zellen behalten diese Markierung im Laufe der Zeit bei und werden dementsprechend als Markierungszellen (LRCs) bezeichnet. Ansätze zur Visualisierung von LRCs in vivo bieten ein robustes Werkzeug zur Überwachung der Stammzellhomöostase. In dieser Studie haben wir eine Methode zur Visualisierung und Analyse von LRCs beschrieben. Unser innovativer Ansatz umfasst LRCs in Mausschneidezähnen nach Gewebereinigung und EdU-Färbung mit ganzer Mount, gefolgt von konfokaler Mikroskopie und einer 3-dimensionalen (3D) Rekonstruktion mit der Bildgebungssoftware. Diese Methode ermöglicht eine 3D-Bildgebung und eine unverzerrte Quantifizierung im Vergleich zur herkömmlichen LRC-Analyse auf Schnittobjektträgern.

Nach der EdU-Markierung und dem PEGASOS-Gewebereinigungsprozess (Abbildung 2) wurde der transparente Unterkiefer erhalten, wie in unserem Bild gezeigt (Abbildung 3B). Wir verglichen die modifizierte Probe mit einem normalen Unterkiefer ohne Gewebereinigungsprozess (Abbildung 3A). Der transparente Unterkiefer (Abbildung 3B) mit EdU-Markierung wurde einer konfokalen Bildgebung unterzogen. Wir konzentriert...

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Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing

Der Schneidezahn der Maus enthält in seiner Stammzellnische wertvolle markierungshaltende Zellen. Wir haben eine neuartige Methode, um die markierungserhaltenden Zellen unvoreingenommen zu erkennen und zu quantifizieren. Unsere Studie verwendete eine EdU-Markierung und einen 3D-Rekonstruktionsansatz nach der PEGASOS-Gewebereinigung des Unterkiefers.

Detektion und Quantifizierung von markierungshaltenden Zellen in Schneidezähnen von Mäusen mittels eines 3D-Rekonstruktionsansatzes nach Gewebereinigung

The murine incisor is an organ that grows continuously throughout the lifespan of the mouse. The epithelial and mesenchymal stem cells residing in the ...

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur in vivo und dreidimensionalen Visualisierung und Quantifizierung der markierungserhaltenden Zellen der Schneidezahn-Stammzellnische der Maus. Diese Technik ist zeitsparend und benutzerfreundlich für neue Lernende. Die 3D-Bilder werden aufgenommen, ohne das Gewebe zu beschädigen.Die 3D-Quantifizierung macht die Daten zuverlässiger und genauer. Sezieren Sie zunächst die Mandibeln. Fixieren Sie die Proben in 4% Paraformaldehyd und halten Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur.Entfernen Sie nach der Inkubation die Muskeln von den Mandibeln. Tauchen Sie sie in eine 0,5-molare Ethylendiamintetraessigsäurelösung, um sie vier Tage lang mit einem täglichen Medienwechsel auf einem 37-Grad-Celsius-Shaker zu entkalken. Entfärben Sie die Mandibeln einen Tag lang in 15 Millilitern 25%iger Quadrol-Lösung auf einem 37-Grad-Celsius-Shaker, um das restliche Bluthäm zu entfernen.Bereiten Sie für die 5-Ethinyl-2-Prime-Desoxyuridin-Färbung einen frischen 5-Ethinyl-2-Prime-Desoxyuridin-Etikettierungscocktail vor, wie im Text erwähnt. Spülen Sie die Mandibeln mit einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung mit Tween 20 oder PBST 30 Minuten lang auf einem 37-Grad-Celsius-Shaker ab. Wiederholen Sie das Spülen der Mandibeln mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung dreimal für jeweils drei Minuten, gefolgt von einer Inkubation in einem frisch zubereiteten 5-Ethinyl-2-Prime-Desoxyuridin-Markierungscocktail auf einem Shaker über Nacht.Wiederholen Sie die phosphatgepufferte Kochsalzlösung dreimal und führen Sie eine serielle Delipidierung durch, indem Sie die Mandibeln jeweils sechs Stunden lang in einem 37-Grad-Celsius-Shaker in die im Text genannten Lösungen legen. Dehydrieren Sie die Mandibeln in tert-Butanol-Polyethylenglykol oder tB-PEG-Lösung für zwei Tage bei 37 Grad Celsius mit dem täglichen Medienwechsel. Reinigen Sie den Unterkiefer nach zwei Tagen in Benzylbenzoat-Polyethylenglykol-Clearingmedium, das 75% Benzylbenzoat, 22% Polyethylenglykol-Methylethermethacrylat durchschnittlich 500 oder PEG-MMA500 und 3% Quadrol enthält, um eine Brechungsindexanpassung zu erhalten und bis die Transparenz erreicht ist.Montieren Sie den gewebegereinigten ganzen Unterkiefer auf Markenhohlraum-Objektträger im Benzylbenzoat-Polyethylenglykol-Reinigungsmedium und decken Sie ihn mit Glasabdeckobjektträgern ab. Stellen Sie in der konfokalen Bildgebungssoftware die gewünschten Bildaufnahmeparameter ein. Aktivieren Sie im Panel für die Fluoreszenzanregung den Laser, der zur optimalen Anregung von Fluorophoren erforderlich ist.Bewegen Sie im Bereich für die Fluoreszenzdetektion den Schieberegler, um die zu messenden Wellenlängen auszuwählen. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl mit einem Brechungsindex von 1,52 auf das Deckglas, um dem Brechungsindex des Glasdeckglases und des Objektivs zu entsprechen, und legen Sie den montierten Unterkiefer auf den Mikroskoptisch. Schalten Sie die Leuchtstofflampen ein und wählen Sie ein geeignetes Vergrößerungsobjektiv aus, um interessante Bereiche abzubilden.Identifizieren Sie im Live-Scan-Modus das Sichtfeld, um den gesamten Bereich des Unterkiefers in den X- und Y-Dimensionen zu visualisieren. Stellen Sie die Erfassungsparameter der oberen und unteren Z-Stufe ein, die das Volumen der Stammzellnische im Schneidezahn der Maus genau abdecken. Verwenden Sie eine Z-Schrittweite von zwei Mikrometern oder gemäß Ihrer Anforderung.Erfassen und speichern Sie Z-Stack-Bilddateien im lif-Format. Verwenden Sie einen Dateikonverter für Imaging-Software, um die Z-Stack-Image-Datei in den Dateityp des nativen Formats zu konvertieren. Klicken Sie in der Bildbearbeitungssoftware auf die Schaltfläche "Arena" und wählen Sie dann "Bild".Wählen Sie die ursprüngliche lif-Datei aus, und wählen Sie die zusammengeführte Datei aus. Die Bilder werden in die Bildbearbeitungssoftware importiert. Doppelklicken Sie auf die importierte Datei, um den Bilddatensatz zu öffnen.Rufen Sie in der Bildbearbeitungssoftware das Bedienfeld "Anzeigeanpassung" auf. Klicken Sie im Bereich Anzeigeanpassung auf den Namen des Kanals. Im Standardmodus wird es normalerweise als rot gekennzeichnet.Klicken Sie im Fenster Bildeigenschaften auf die Registerkarte Zugeordnete Farbe. Wählen Sie in der Option Color Tab File (Farbregisterkartendatei) die Option Fire Flow und klicken Sie dann auf OK. Wählen Sie die Anzeigefarbe aus, um die Hintergrundfluoreszenz und die positive Fluoreszenz von der Probe zu unterscheiden. Klicken Sie oben links auf dem Bildschirm im Bereich Szeneneigenschaften auf das blaue Symbol mit der Bezeichnung Neue Oberfläche hinzufügen.Deaktivieren Sie das Symbol "Lautstärke", um den größten Teil der Hintergrundfluoreszenz zu entfernen, was dazu führt, dass die positive Fluoreszenz bei der manuellen Segmentierung deutlich sichtbar ist. Starten Sie als Nächstes die manuelle Segmentierung der Region von Interesse oder ROI, indem Sie auf die Registerkarte Erstellen klicken und die Registerkarte Automatische Erstellung überspringen, manuell bearbeiten auswählen. Klicken Sie im manuellen Assistenten zur Flächenerstellung auf die Registerkarte Kontur, um die Ausrichtung basierend auf den Proben auszuwählen und den ROI einfach zu konturieren.Stellen Sie als Nächstes sicher, dass sich das Zeigermenü in der rechten Ecke im Auswahlmodus befindet. Passen Sie die Schnittposition an, um den ROI im Gewebe zu lokalisieren. Wie bereits erwähnt, ist der größte Teil der Hintergrundfluoreszenz bereits entfernt.Klicken Sie auf die Schaltfläche Zeichnen und zeichnen Sie einen vorläufigen Bereich von Interesse. Wählen Sie die Option Sichtbarkeit auf Keine, um Interferenzen aus anderen Bereichen als dem ROI zu vermeiden, gefolgt von der segmentweisen Segmentierung des interessierenden Bereichs. Nachdem die ROI-Zeichnung fertig ist, klicken Sie auf Oberfläche erstellen, um eine 3D-Geometrie des ROI zu erhalten.Klicken Sie im manuellen Assistenten zur Flächenerstellung auf die Schaltfläche Bearbeiten, und wählen Sie Alle maskieren aus. Wählen Sie im ausgeklappten Fenster "Kanal maskieren" in den Optionen für die Kanalauswahl Kanal 1 aus. Wählen Sie anschließend Kanal duplizieren, bevor Sie die Maske anwenden.Wählen Sie in den Maskeneinstellungen Konstante innen/außen aus, und setzen Sie die Voxel-Außenfläche auf Null. Heben Sie im Bereich Szeneneigenschaften die Auswahl des Surface-Objekts auf, und wählen Sie das Volume-Objekt aus. Deaktivieren Sie in der Anzeigeanpassung den ursprünglichen roten Kanal, und wählen Sie den maskierten roten Kanal aus.Und passen Sie die Farbintensitäten an, um den gewünschten 3D-gerenderten und positiv markierten Fluoreszenz-ROI zu erzielen. Erstellen Sie ein neues Punktobjekt, indem Sie auf das Symbol "Flecken" klicken, um die 3D-gerenderten Zellen mit Beschriftung zu quantifizieren, indem Sie 3D-Punkte erstellen, die sich vergleichbar mit 3D-gerenderten Zellen mit Beschriftung überlappen. Verwenden Sie die unteren Pfeile, um zwischen den Schritten im Spot-Erstellungsassistenten zu wechseln.Klicken Sie auf die Schaltfläche Fertig stellen und wählen Sie die Schaltfläche Statistik aus. Wählen Sie als Nächstes die Registerkarte Gesamt aus, um den Wert für die Gesamtzahl der Punkte im Bild zu ermitteln. Nach der Markierung von 5-Ethinyl-2-prime-desoxyuridin und dem Polyethylenglykol-assoziierten Lösungsmittelsystem wurde der transparente Unterkiefer erhalten.Die modifizierte Probe wurde mit einem normalen Unterkiefer ohne Gewebereinigungsprozess verglichen, und ein transparenter Unterkiefer mit 5-Ethinyl-2-prime-desoxyuridin-Markierung wurde einer konfokalen Bildgebung unterzogen. Der optische Schnitt des Schneidezahns zeigte markierungshaltende Zellen in der Stammzellnische der Schneidezahnspitze in der XY-Ebene. Die 3D-Bildkonstruktion einer Schneidezahnspitze zeigte 5-Ethinyl-2-prime-Desoxyuridin-positive Markierungs-haltende ruhende Stammzellen sowohl in der epithelialen als auch in der mesenchymalen Stammzellnische.Die 5-Ethinyl-2-prime-Desoxyuridin-positiven Zellen wurden zur Quantifizierung an Stellen übertragen, die sich vergleichbar mit den mesenchymalen Markierungszellen überlappten. Die Flecken, die nur für mesenchymale markierungserhaltende Zellen und nur für epitheliale markierungserhaltende Zellen erzeugt wurden, sind im Bild sichtbar. Die Quantifizierung von epithelialen und mesenchymalen Markierungszellen wurde ebenfalls durchgeführt.Die Verarbeitungs- und Reinigungseigenschaften sind die wichtigsten Schritte und sollten entsprechend der Verwendung des Gewebes optimiert werden, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen. Diese Methode kann auch modifiziert werden, um LRCs auf S2VGFP-Ebene zu visualisieren und in der Zelllinienverfolgung Details über den Standort der Nachkommen und ihre Quantifizierung oder Beiträge zu erhalten.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Die Herstellung von pluripotenten Stammzellen aus Maus Fruchtwasserzellen ein Transposon-System verwenden

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Ein standardisierter Ansatz für Multispezies Reinigung von männlichen männlichen Keimzellen durch mechanische Gewebedissoziation und Durchflusszytometrie

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Live Imaging der Maus Sekundärer Gaumen Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontale Ganze Mount: Ein neuartiges Verarbeitungs- und Imaging-Protokoll für dickes, dreidimensionales Gewebequerschnitt der Haut

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluoreszierende Etikettierung von Mikrotubuli und Centrosomal Proteine in Ex Vivo Darmgewebe und 3D In-vitro- Darm Organellen

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Dreidimensionales Angiogenese-Assay-System mit Co-Culture-Spheroiden, die von endotheliaalen Koloniebildenden Zellen und mesenchymalen Stammzellen gebildet werden

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Visualisierung und Analyse von Pharyngeal Arch Arterien mittels ganzer Immunhistochemie und 3D-Rekonstruktion

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Vorbereitung kleiner RNA-Bibliotheken für die Sequenzierung von frühen Mausembryonen

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...