Name: detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing
Uploaded: 2022-06-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing at JoVE.com

אנו מודים למייגן ק. הולט על עריכת כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי מענקי NIH/NIDCR DE026461 ו- DE028345 ומימון סטארט-אפ מבית הספר לרפואת שיניים A&M בטקסס לד"ר Xiaofang Wang.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) עבור המכללה לרפואת שיניים של אוניברסיטת טקסס A&M.
1. הכנת קוקטייל התיוג EdU
<ol><li>הכינו את תמיסות ציר הקוקטיילים כמתואר בטבלה 1.</li>
	<li>הכינו את קוקטייל הסימון של EdU כמתואר בטבל?...

<ol>
	<li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+incisor+through+gene+co-expression+analysis.">Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis.</a> eLife. 6, 24712 (2017).</li><li>Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+tooth+development,+growth,+repair,+and+regeneration.">Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).</li><li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quiescent+cell+population+replenishes+mesenchymal+stem+cells+to+drive+accelerated+growth+in+mouse+incisors.">A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors.</a> Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).</li><li>Biehs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMI1+represses+Ink4a/Arf+and+Hox+genes+to+regulate+stem+cells+in+the+rodent+incisor.">BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor.</a> Nature Cell Biology. 15 (7), 846-852 (2013).</li><li>Sharir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+pool+of+actively+cycling+progenitors+orchestrates+self-renewal+and+injury+repair+of+an+ectodermal+appendage.">A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage.</a> Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).</li><li>Terskikh, V. V., Vasiliev, A. V., Vorotelyak, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label+retaining+cells+and+cutaneous+stem+cells.">Label retaining cells and cutaneous stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 414-425 (2012).</li><li>de Miguel-Gomez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+the+endometrium:+From+the+discovery+of+adult+stem+cells+to+pre-clinical+models.">Stem cells and the endometrium: From the discovery of adult stem cells to pre-clinical models.</a> Cells. 10 (3), 595 (2021).</li><li>Ishikawa, Y., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+adult+stem+cells+in+murine+teeth+are+regulated+by+Shh+signaling.">Quiescent adult stem cells in murine teeth are regulated by Shh signaling.</a> Cell and Tissue Research. 369 (3), 497-512 (2017).</li><li>Chehrehasa, F., Meedeniya, A. C., Dwyer, P., Abrahamsen, G., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU,+a+new+thymidine+analogue+for+labelling+proliferating+cells+in+the+nervous+system.">EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 122-130 (2009).</li><li>Solius, G. M., Maltsev, D. I., Belousov, V. V., Podgorny, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+nucleotide+analogue-based+techniques+for+tracking+dividing+stem+cells:+An+overview.">Recent advances in nucleotide analogue-based techniques for tracking dividing stem cells: An overview.</a> The Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101345 (2021).</li><li>Ning, H., Albersen, M., Lin, G., Lue, T. F., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+EdU+labeling+on+mesenchymal+stem+cells.">Effects of EdU labeling on mesenchymal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (1), 57-63 (2013).</li><li>Lin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+tracking+of+mesenchymal+stromal+cells+with+EdU.">Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU.</a> Cytotherapy. 11 (7), 864-873 (2009).</li><li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Challen, G. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+expression+of+H2B-GFP+transgene+in+hematopoietic+stem+cells.">Promiscuous expression of H2B-GFP transgene in hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 3 (6), 2357 (2008).</li><li>Kopecky, B. J., Duncan, J. S., Elliott, K. L., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstructions+from+optical+sections+of+thick+mouse+inner+ears+using+confocal+microscopy.">Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).</li><li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+technique:+Recent+progress+and+biomedical+applications.">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing.">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+application+to+bone+and+dental+tissues.">Tissue clearing and its application to bone and dental tissues.</a> Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Fink, J., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cell+lineage+tracing+and+deep+tissue+imaging.">Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging.</a> BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).</li></ol>

מינונים מרובים של זריקות (BrdU, EdU) משמשים בדרך כלל על עכברים ילודים גדלים כדי לתייג תאים מתרבים ככל האפשר 1,6,13. תקופת המרדף נחשבת לצעד קריטי לגבי קצב ההתחדשות של רקמות 6,13. החותכת לעכבר מחדשת את עצמה מדי חודש. תכ...

החותכת לעכבר הגדלה ללא הרף היא מודל מצוין לחקר תאי גזע בוגרים1. תאי הגזע האפיתל (לולאה צווארית שפתית ולשונית) ותאי גזע מזנכימליים (בין הלולאה הצווארית השפתית והלשונית) השוכנים בצד הפרוקסימלי של החותכת מתמיינים לאמלובלסטים, אודונטובלסטים ותאי מוך השן. תהליך ייחודי זה מספק מקור תאים לפיצוי אובדן רקמות ותחלופת רקמה2. למרות מספר סמנים של תאי גזע כגון Sox2, Gli1, Thy1/CD90, Bmi1 וכו '. זוהו in vivo עבור תת-קבוצות של תאי גזע בוגרים בחותכות עכבר, הם אינם מספיקים בייצוג אוכלוסיות תאי הגזע כאשר משתמשים בהם לבד 1,3,4,5. הדמיה של תאים שקטים מאריכי חיים על ידי תיוג ושימור דנ"א אנלוגי של נוקלאוטידים יכולה לספק זיהוי בלתי משוחד עבור רוב תת-הקבוצות של תאי גזע בוגרים6. יתר על כן, גישה זו שימושית בקרב שיטות זיהוי תאי גזע רבות7 להבנת התנהגות התאים והומאוסטזיס של אוכלוסיות תאי גזע דנטליים 3,8. בעוד שתאי הגזע המתחלקים יאבדו את תיוג הדנ"א שלהם לאחר מרדף ניכר, תאי הגזע השקטים לכאורה שומרים על תווית הדנ"א שלהם, ורואים בהם תאים שומרי תוויות (LRCs)6. תיוג ושימור DNA על ידי תאי גזע שאינם מתחלקים יסמנו וימקמו את תאי הגזע הבוגרים לכאורה בנישות שלהם.
במהלך השנים האחרונות, תיוג אנלוגי של תימידין 5-ברומו-2′-דאוקסיורידין (BrdU) החליף את שיטת התיוג 3H-thymidine DNA המסורבלת, הגוזלת זמן רב וברזולוציה גבוהה שאינה תואמת 3H-thymidine DNA לבדיקות התפשטות תאים 6,9. בשנים האחרונות, טכניקת התיוג 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) נמצאת בשימוש הולך וגובר על BrdU. דפוס זה נוצר מכמה סיבות. ראשית, שיטת BrdU היא איטית ועתירת עבודה. תנאי המשתמש משתנים, והוא אינו מסוגל לשמר את מבנה העל בדגימות (עקב דנטורציה של DNA). כמו כן, שיטת BrdU מאבדת את האנטיגניות של תאים, ובכך הופכת אותה ללא יעילה עבור ניתוחים פונקציונליים במורד הזרם ובדיקות כגון ניסויי לוקליזציה משותפת והשתלת תאי גזע in vivo 3,7,9,10,11,12. BrdU הוא גם טרטוגן, שאינו מתאים לתיוג LRCs בהתפתחות עוברית6. כמו כן, שיטת BrdU אינה יעילה כאשר משתמשים בה בדגימות שלמות. החסרונות הם חדירה נמוכה של נוגדנים בחלק העמוק של הדגימות או דרישה לתקופת דגירה ארוכה של נוגדנים לחדירה עמוקה13. תיוג EdU חומק מהשלבים של דגימות דנטורציה, ובכך משמר את מבנה העל. תכונה זו מועילה לניתוחים פונקציונליים במורד הזרם, כגון ניסויי לוקליזציה משותפת והשתלת תאי גזע11,12. כמו כן, תיוג EdU רגיש ומהיר מאוד; חדירת הדגימות גבוהה הודות לשימוש באזידים פלואורסצנטיים נספגים במהירות ובגודל קטן יותר לזיהוי תוויות EdU באמצעות תגובת ציקלואיד (כימיית "קליק" Cu(I)-זרז [3 + 2]14.
שיטה נוספת לסימון דנ"א המיושמת יותר ויותר היא השימוש בעכברים טרנסגניים מהונדסים. עכברים אלה מבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק היסטון 2B (H2B-GFP) הנשלט על ידי אלמנט מווסת מגיב טטרציקלין 5,14. לאחר האכלת עכברים בטטרציקלין צ'או/מים למשך תקופת מרדף של 4 שבועות עד 4 חודשים, פלואורסצנטיות GFP תפחת בתאי מחזור ורק LRCs ישמרו על פלואורסצנטיות6. היתרון של שיטה זו הוא שניתן לבודד את ה- LRCs המסומנים ולהישאר בני קיימא עבור תרבית תאים או ניתוחים פונקציונליים במורד הזרם 6,7. כמה מחקרים דיווחו על תיוג לא מדויק של תאי גזע שקטים כאשר רדפו אחריהם לשימוש ארוך טווח. תוצאה זו נבעה מביטוי רקע דולף מזן H2B-GFP ולא מהתגובה המווסתת הטטרציקליןהמתאימה 15.
יתר על כן, רוב הספרות בעבר השתמשה בזיהוי LRCs בעיקר על שקופיות חתוכות, שהן דו-ממדיות ולעתים קרובות מוטות בטעות בהצגת המיקום והמספר המדויקים של LRCs. הגישה הציגה זוויות שגויות למקטעים של מבני רקמות מורכבים16. השיטה השנייה הייתה להשיג תמונות תלת ממדיות מקטעים טוריים ולבצע שחזורים לאחר התמונה. שלבים אלה לא היו מדויקים בגלל עיוות תמונה מווריאציות בכל קטע טורי עקב קטעים דחוסים או מתוחים, וכתוצאה מכך חסר מידע16,17,18. השיטה הייתה גם מייגעת וגוזלת זמן.
כדי להקל על הדמיה מלאה של LRCs, הדגימות צריכות להיות ברורות בזמן שהפלואורסצנטיות מתוחזקת היטב. ניתן לסווג את טכניקות ניקוי הרקמה הנוכחיות לשלוש קטגוריות עיקריות: טכניקות ניקוי רקמות מבוססות ממס אורגני, טכניקות ניקוי רקמות מבוססות מגיב מימי, וטכניקות ניקוי רקמות מבוססות הידרוג'ל17,19. מערכת הממסים הקשורה לפוליאתילן גליקול (PEG) (פגסוס) פותחה לאחרונה. גישה זו הופכת כמעט את כל סוגי הרקמות לשקופים ומשמרת פלואורסצנטיות אנדוגנית, כולל רקמות קשות כגון עצם ושיניים20. לשיטת פגסוס יתרונות על פני שיטות ניקוי רקמות אחרות, בעיקר בניקוי חומרי שן ועצם. רוב השיטות האחרות יכולות לנקות רקמות קשות רק באופן חלקי, בעלות זמני עיבוד ארוכים, או דורשות ריאגנטים יקרים21. כמו כן, שיטת פגסוס יכולה לשמר ביעילות פלואורסצנטיות אנדוגנית על פני שיטות אחרות.
ספרות זו הובילה אותנו ליצור שיטה חדשה לחקר התא. שילבנו את יתרונות זיהוי ה-LRCs של תיוג EdU עם ההדמיה התלת-ממדית המעולה ביותר של דגימות שעברו ניקוי רקמות; הדגימות עובדו בטכניקת ניקוי רקמות מתקדמת של מערכת ממס משויכת פוליאתילן גליקול (PEG) (PEGASOS)15. שקיפות רקמות קשות אפשרה לנו לשחזר את האות התלת-ממדי של פלואורסצנטיות LRCs in vivo מבלי לשבור את השיניים או הלסתות, וליצור דרך מדויקת יותר לדמיין ולכמת LRCs.
במחקר זה, אנו מספקים מדריך חדשני להמחשת LRCs בחותך העכבר. יצרנו גישה חזותית תלת-ממדית כדי לקבוע את המיקום והכמות של LRCs בתוך נישת תאי הגזע החותכים לעכבר. פרויקט זה השתמש בתיוג EdU, טכניקות ניקוי רקמות פגסוס ומיקרוסקופ קונפוקלי. השיטה שלנו של תיוג EdU של LRCs על רקמה שלמה ושימוש בדגימה מנוקה ושקופה מתגברת הן על המגבלות של שקופיות חתוכות מסורתיות והן על שיטות תיוג DNA חסרות אחרות. לכן, הטכניקה שלנו תתאים למחקרים על הומאוסטזיס של תאי גזע הדורשים זיהוי LRCs, במיוחד על רקמות קשות. הפרוטוקול יכול להיות מועיל באותה מידה לאלה המתמקדים בהומאוסטזיס של תאי גזע ברקמות ואיברים אחרים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#215; Objective/NA 0.9</td>
			<td>Leica</td>
			<td>507702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bezyl benzoate (BB)</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>409529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane 9.0.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND cavity slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>BR475505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation Pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>23609-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Carboynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Miiilipore Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X Software</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehye</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGMMA500</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>447943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfa-Cyanine 3 Azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>D1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-10X</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-butanol (tB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>360538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing

החותכת היא איבר הגדל ברציפות לאורך כל חיי העכבר. תאי הגזע האפיתל והמזנכימליים השוכנים ברקמות הפרוקסימליות של החותכות מולידים צאצאים שיתמינו לאמלובלסטים, אודונטובלסטים ופיברובלסטים של מוך השן. תאים אלה חיוניים לתמיכה בתחלופה מתמשכת של רקמות חותכות, מה שהופך את החותכת murine מודל מצוין לחקר הומאוסטזיס של תאי גזע בוגרים. מאמינים כי תאי גזע מכילים תאים שקטים מאריכי חיים שניתן לתייג על ידי אנלוגים של נוקלאוטידים כגון 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU). התאים שומרים על תווית זו לאורך זמן ובהתאם לכך נקראים תאים שומרי תוויות (LRCs). גישות להדמיה של LRCs in vivo מספקות כלי חזק לניטור הומאוסטזיס של תאי גזע. במחקר זה תיארנו שיטה להדמיה וניתוח של LRCs. הגישה החדשנית שלנו כוללת LRCs בחותכות עכבר לאחר ניקוי רקמות וצביעת EdU בהרכבה מלאה ולאחר מכן מיקרוסקופ קונפוקלי ושחזור תלת ממדי (3D) עם תוכנת ההדמיה. שיטה זו מאפשרת רכישת הדמיה תלת-ממדית וכימות לא מוטה בהשוואה לניתוח LRCs מסורתי על שקופיות חתוכות.

לאחר תיוג EdU ותהליך ניקוי רקמות פגסוס (איור 2), הלסת התחתונה השקופה התקבלה כפי שמוצג בתמונה שלנו (איור 3B). השווינו את הדגימה שעברה שינוי ללסת תחתונה רגילה ללא תהליך ניקוי רקמות (איור 3A). הלסת התחתונה השקופה (איור 3B) עם תיוג EdU עבר?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing at JoVE.com

Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing

החותכת לעכבר מכילה תאים שומרי תוויות יקרי ערך בנישת תאי הגזע שלה. יש לנו דרך חדשה לזהות ולכמת באופן בלתי משוחד את התאים שומרי התווית; המחקר שלנו השתמש בתיוג EdU ובגישת שחזור תלת ממדית לאחר ניקוי רקמות פגסוס של הלסת התחתונה.

זיהוי וכימות של תאים שומרי תוויות בחותכות עכבר באמצעות גישת שחזור תלת-ממדית לאחר ניקוי רקמות

The murine incisor is an organ that grows continuously throughout the lifespan of the mouse. The epithelial and mesenchymal stem cells residing in the ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה להדמיה וכימות in vivo ותלת ממדית של התאים שומרי התוויות של נישת תאי גזע חותכים בעכבר. טכניקה זו חוסכת זמן וידידותית למשתמש עבור לומדים חדשים. התמונות התלת ממדיות נרכשות מבלי לפגוע ברקמה.הכמות התלת-ממדית הופכת את הנתונים לאמינים ומדויקים יותר. כדי להתחיל, לנתח את הלסתות. תקן את הדגימות ב 4% paraformaldehyde, ולשמור אותם בטמפרטורת החדר במשך הלילה.לאחר הדגירה, להסיר את השרירים מן הלסתות. לטבול אותם בתמיסת חומצה אתילאנדיאמין טטראצטית 0.5 טוחנת כדי לבטל את ההסתיידות במשך ארבעה ימים עם שינוי בינוני יומי על שייקר של 37 מעלות צלזיוס. יש לצבוע את הלסת התחתונה ב-15 מיליליטר של תמיסת קוואדרול 25% על שייקר של 37 מעלות צלזיוס למשך יום אחד כדי להסיר את הדם שנותר.לצביעת הר שלם 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine, הכינו קוקטייל תיוג טרי 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine כפי שמוזכר בטקסט. שטפו את הלסת התחתונה במי מלח חוצצים פוספט עם Tween 20 או PBST במשך 30 דקות על שייקר של 37 מעלות צלזיוס. יש לחזור על שטיפת הלסת התחתונה במי מלח חוצצים בפוספט שלוש פעמים במשך שלוש דקות כל אחת, ולאחר מכן לדגור בקוקטייל סימון טרי של 5-אתיניל-2-פריים-דאוקסיורידין על שייקר למשך הלילה.חזור על שטיפת מי מלח חוצצת פוספט שלוש פעמים, ובצע דה-ליפדיציה סדרתית על ידי הנחת הלסת התחתונה בתמיסות המוזכרות בטקסט במשך שש שעות כל אחת בשייקר של 37 מעלות צלזיוס. יש לייבש את הלסתות בתמיסת טרט-בוטנול-פוליאתילן גליקול, או tB-PEG, למשך יומיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם שינוי בינוני יומי. לאחר יומיים, נקה את הלסת התחתונה במדיום ניקוי בנזיל בנזואט-פוליאתילן גליקול המכיל 75% בנזיל בנזואט, 22% פוליאתילן גליקול-מתיל-אתר מתקרילט ממוצע 500 או PEG-MMA500, ו-3%Quadrol כדי לקבל התאמת אינדקס שבירה ועד להשגת שקיפות.הרכיבו את הלסת התחתונה השלמה על מגלשות חלל המותג במדיום ניקוי בנזיל בנזואט-פוליאתילן גליקול, וכסו אותה בשקופיות כיסוי זכוכית. בתוכנת ההדמיה הקונפוקלית, הגדר את הפרמטרים הרצויים לרכישת תמונה. בלוח לעירור פלואורסצנטי, הפעל את הלייזר הדרוש כדי לעורר פלואורופורים בצורה אופטימלית.בחלונית לזיהוי פלואורסצנטי, הזז את המחוון כדי לבחור את אורכי הגל שיימדדו. מוסיפים טיפת שמן טבילה עם מקדם שבירה של 1.52 על גבי הכיסוי כדי להתאים למקדם השבירה של כיסוי הזכוכית ומטרה, ומניחים את הלסת התחתונה המותקנת על במת המיקרוסקופ. הפעילו את מנורות הפלואורסצנט ובחרו מטרת הגדלה מתאימה לתמונת אזורי עניין.במצב סריקה חיה, זהה את שדה הראייה כדי להמחיש את כל האזור של הלסת התחתונה בממדים X ו- Y. הגדר את פרמטרי הרכישה של שלב Z העליון והתחתון המכסים במדויק את נפח נישת תאי הגזע בחותך העכברים. השתמש בגודל צעד Z של שני מיקרומטר או לפי דרישתך.רכוש ושמור קובצי תמונה מסוג Z-stack בתבנית lif. השתמש בממיר קבצים של תוכנת הדמיה כדי להמיר את קובץ התמונה Z-stack לסוג הקובץ המקורי בתבנית המקורית. בתוכנת ההדמיה, לחץ/י על הכפתור ״ארנה״ ולאחר מכן בחר/י ״תמונה״.בחר בקובץ ה- lif המקורי ובחר בקובץ הממוזג. התמונות ייובאו לתוכנת ההדמיה. לחצו פעמיים על הקובץ המיובא לפתיחת ערכת נתוני התמונה.בתוכנת ההדמיה, בקר בחלונית Display Adjustment. בחלונית Display Adjustment, לחצו על שם הערוץ. הוא מסומן בדרך כלל כאדום במצב ברירת מחדל.בחלון מאפייני תמונה, לחץ על הכרטיסייה צבע ממופה. באפשרות Color Tab File, בחר Fire Flow ולאחר מכן לחץ על OK. בחר בצבע התצוגה כדי להבחין בין פלואורסצנטיות הרקע לבין הפלואורסצנטיות החיובית מהדגימה. בצד השמאלי העליון של המסך, בחלונית מאפייני סצינה, לחץ על הסמל הכחול שכותרתו הוסף משטח חדש.בטל את הבחירה בסמל עוצמת הקול כדי להסיר את רוב פלואורסצנטיות הרקע, וכתוצאה מכך הפלואורסצנטיות החיובית נראית בבירור במהלך סגמנטציה ידנית. לאחר מכן, התחל את הפילוח הידני של אזור העניין, או החזר השקעה, על ידי לחיצה על הכרטיסייה יצירה ובחירה בכרטיסייה דלג על יצירה אוטומטית, ערוך ידנית. באשף יצירת המשטחים הידני, לחץ על הכרטיסייה קונטור כדי לבחור את הכיוון בהתבסס על הדגימות כדי לעצב את קו המתאר של החזר ההשקעה בקלות.לאחר מכן, ודא שתפריט המצביע בפינה השמאלית נמצא במצב בחירה. התאימו את מיקום הפרוסה כדי לאתר את החזר ההשקעה ברקמה. כאמור, רוב פלואורסצנטיות הרקע כבר הוסרה.לחץ על כפתור ציור, וצייר אזור טנטטיבי של עניין. בחר באפשרות 'תצוגה' באפשרות 'ללא' כדי למנוע הפרעות מאזורים אחרים מלבד החזר ההשקעה, ולאחר מכן חלק את אזור העניין פרוסה אחר פרוסה. לאחר סיום ציור החזר ההשקעה, לחץ על צור משטח כדי לקבל גיאומטריה תלת-ממדית של החזר ההשקעה.לחץ על לערוך כפתור באשף יצירת פני השטח הידני, ובחר מסיכה הכל. בחלון 'ערוץ מסיכה' שהוקפץ, בחרו 'ערוץ 1' באפשרויות 'בחירת ערוץ'. לאחר מכן, בחרו 'שכפל ערוץ' לפני החלת המסיכה.בקביעות המסיכה, בחרו 'קבוע בפנים/בחוץ' וקבעו את משטח הווקסל החיצוני לאפס. בחלונית מאפייני סצינה, בטל את הבחירה בעצם Surface ובחר בעצם עוצמת הקול. ב'התאמת תצוגה', בטלו את הבחירה בערוץ האדום המקורי ובחרו בערוץ 'אדום מסיכה'.וכוונן את עוצמות הצבע כדי לקבל את החזר ההשקעה הרצוי על פלואורסצנטיות בעיבוד תלת-ממד ובתווית חיובית. צור אובייקט ספוט חדש על-ידי לחיצה על סמל הספוט כדי לכמת את התאים ששמרו על תוויות שעובדו בתלת-ממד על-ידי יצירת כתמים תלת-ממדיים החופפים באופן דומה לתאים ששמרו תוויות שעובדו בתלת-ממד. השתמש בחצים התחתונים כדי לעבור בין שלבים באשף יצירת הספוט.לחץ על כפתור סיום ובחר את סטטיסטיקה לחצן. לאחר מכן, בחרו בכרטיסייה 'כולל' כדי למצוא את הערך של מספר הכתמים הכולל בתמונה. לאחר תיוג 5-אתיניל-2-פריים-דאוקסיורידין ותהליך ניקוי הרקמה של מערכת הממס הקשור לפוליאתילן גליקול, התקבלה הלסת התחתונה השקופה.הדגימה ששונתה הושוותה ללסת רגילה ללא תהליך ניקוי רקמות, ולסתות שקופות עם תיוג 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine עברו הדמיה קונפוקלית. החלק האופטי של החותכת הראה תאים שומרי תווית בגומחת תאי הגזע של קודקוד החותכת במישור XY. בניית התמונה התלת-ממדית של קודקוד חותך הראתה 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine חיובי שמירה על תוויות תאי גזע שקטים הן בנישת תאי גזע אפיתל והן בנישת תאי גזע מזנכימליים.התאים החיוביים 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine הועברו לנקודות לכימות שחפפו באופן דומה לתאים שומרי התווית המזנכימליים. הכתמים שנוצרו רק עבור תאים שומרי תוויות מזנכימליים ורק עבור תאים שומרי תוויות אפיתל נראים בתמונה. כמו כן בוצע כימות של תאים שומרי תוויות אפיתל ומזנכימליים.מאפייני העיבוד והניקוי הם השלבים החשובים ביותר ויש לייעל אותם בהתאם לשימוש ברקמה כדי להשיג תוצאות משביעות רצון. ניתן גם לשנות שיטה זו כדי להמחיש LRCs ברמת S2VGFP ובמעקב אחר שושלת תאים כדי לקבל פרטים על מיקום הצאצאים וכימות או תרומות שלהם.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

את ייצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מתאי מי שפירים עכבר באמצעות מערכת transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

גישה סטנדרטית עבור multispecies טיהור תאים יונקים זכר יונקים על ידי דיסוציאציה רקמות מכנית זרימת cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

חיסונית-פלורסנט תיוג של Microtubules וחלבונים Centrosomal Vivo לשעבר רקמת המעי ו 3D במבחנה Organoids מעיים

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

3-מימדי אנגיוגנזה שיטת מערכת באמצעות Spheroids שיתוף תרבות נוצר על ידי ויוצרים מושבת המושבה תאים ותאי גזע Mesenchymal

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

הדמיה וניתוח עורקי קשת והלוע באמצעות שחזור-הר אימונוהיסטוכימיה ותלת מימד

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

הכנת ספריות RNA קטנות לצורך רצף של עוברי עכבר מוקדם

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...