Name: detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing
Uploaded: 2022-06-10T14:00:00
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原稿を編集してくれたメーガン・K・ホルトに感謝します。この研究は、NIH / NIDCR助成金DE026461およびDE028345、およびテキサスA&M歯学部からXiaofang Wang博士へのスタートアップ資金によってサポートされました。

ここに記載されているすべての方法は、テキサスA&M大学歯学部の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. EdUラベリングカクテルの準備
<ol><li>表1に記載のようにカクテルストック溶液を調製する。</li>
	<li>表1に記載されているようにEdUラベリングカクテルを準備します。</li>
</ol>2. ?...

<ol>
	<li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+incisor+through+gene+co-expression+analysis.">Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis.</a> eLife. 6, 24712 (2017).</li><li>Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+tooth+development,+growth,+repair,+and+regeneration.">Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).</li><li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quiescent+cell+population+replenishes+mesenchymal+stem+cells+to+drive+accelerated+growth+in+mouse+incisors.">A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors.</a> Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).</li><li>Biehs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMI1+represses+Ink4a/Arf+and+Hox+genes+to+regulate+stem+cells+in+the+rodent+incisor.">BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor.</a> Nature Cell Biology. 15 (7), 846-852 (2013).</li><li>Sharir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+pool+of+actively+cycling+progenitors+orchestrates+self-renewal+and+injury+repair+of+an+ectodermal+appendage.">A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage.</a> Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).</li><li>Terskikh, V. V., Vasiliev, A. V., Vorotelyak, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label+retaining+cells+and+cutaneous+stem+cells.">Label retaining cells and cutaneous stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 414-425 (2012).</li><li>de Miguel-Gomez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+the+endometrium:+From+the+discovery+of+adult+stem+cells+to+pre-clinical+models.">Stem cells and the endometrium: From the discovery of adult stem cells to pre-clinical models.</a> Cells. 10 (3), 595 (2021).</li><li>Ishikawa, Y., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+adult+stem+cells+in+murine+teeth+are+regulated+by+Shh+signaling.">Quiescent adult stem cells in murine teeth are regulated by Shh signaling.</a> Cell and Tissue Research. 369 (3), 497-512 (2017).</li><li>Chehrehasa, F., Meedeniya, A. C., Dwyer, P., Abrahamsen, G., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU,+a+new+thymidine+analogue+for+labelling+proliferating+cells+in+the+nervous+system.">EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 122-130 (2009).</li><li>Solius, G. M., Maltsev, D. I., Belousov, V. V., Podgorny, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+nucleotide+analogue-based+techniques+for+tracking+dividing+stem+cells:+An+overview.">Recent advances in nucleotide analogue-based techniques for tracking dividing stem cells: An overview.</a> The Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101345 (2021).</li><li>Ning, H., Albersen, M., Lin, G., Lue, T. F., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+EdU+labeling+on+mesenchymal+stem+cells.">Effects of EdU labeling on mesenchymal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (1), 57-63 (2013).</li><li>Lin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+tracking+of+mesenchymal+stromal+cells+with+EdU.">Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU.</a> Cytotherapy. 11 (7), 864-873 (2009).</li><li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Challen, G. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+expression+of+H2B-GFP+transgene+in+hematopoietic+stem+cells.">Promiscuous expression of H2B-GFP transgene in hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 3 (6), 2357 (2008).</li><li>Kopecky, B. J., Duncan, J. S., Elliott, K. L., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstructions+from+optical+sections+of+thick+mouse+inner+ears+using+confocal+microscopy.">Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).</li><li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+technique:+Recent+progress+and+biomedical+applications.">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing.">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+application+to+bone+and+dental+tissues.">Tissue clearing and its application to bone and dental tissues.</a> Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Fink, J., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cell+lineage+tracing+and+deep+tissue+imaging.">Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging.</a> BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).</li></ol>

複数回投与の注射(BrdU、EdU)は、通常、増殖細胞を可能な限り標識するために、成長中の新生児マウスに使用されます1、6、13。追跡期間は、組織の再生率に関する重要なステップと見なされます6,13。マウス切歯は毎月更新されます。この特性により、研究者は追跡期間を4週間以?...

継続的に成長するマウス切歯は、成体幹細胞を研究するための優れたモデルです1。切歯の近位側に存在する上皮(唇と舌の頸部ループ)と間葉系幹細胞(唇と舌の頸部ループの間)は、アメロブラスト、歯芽細胞、歯髄細胞に分化します。このユニークなプロセスは、組織の喪失と代謝回転を補償するための細胞の供給源を提供します2。Sox2、Gli1、Thy1 / CD90、Bmi1などのいくつかの幹細胞マーカーですが。マウス切歯における成体幹細胞のサブセットについてインビボで同定されているが、それらは単独で使用した場合の幹細胞集団を表すには不十分である1、3、4、5。ヌクレオチド類似体DNAの標識と保持によって長寿命の静止細胞を可視化することで、成体幹細胞のほとんどのサブセットを偏りなく検出できます6。さらに、このアプローチは、多くの幹細胞同定方法7の中で、歯科幹細胞集団の細胞挙動および恒常性を理解するために有用である3、8。分裂した幹細胞は、かなりの追跡の後にDNA標識を失いますが、推定静止幹細胞はDNA標識を保持し、ラベル保持細胞(LRC)と見なします6。非分裂幹細胞によるDNA標識と保持は、推定成体幹細胞をニッチにマークして配置します。
過去数年間、チミジン類似体5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)標識は、細胞増殖アッセイ用の面倒で時間のかかる高解像度顕微鏡法に適合しない3H-チミジンDNA標識法に取って代わりました6,9。近年、5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)標識技術がBrdUよりもますます使用されています。このパターンはいくつかの理由で現れました。まず、BrdU法は遅く、労働集約的です。使用条件はさまざまであり、検体の微細構造を保存することはできません(DNA変性のため)。同様に、BrdU法は細胞の抗原性を失うため、共局在実験やin vivo幹細胞移植などの下流の機能解析やアッセイには非効率的になります3、7、9、10、11、12。BrdUは催奇形性物質でもあり、胚発生におけるLRCの標識には適していません6。また、BrdU法は、ホールマウント試験片に使用すると非効率的です。欠点は、検体の深部での抗体の浸透性が低いこと、または深部浸透のために抗体のインキュベーション期間が長いことです13。EdU標識は、試料を変性させるステップを回避し、微細構造を保存します。この特徴は、共局在実験や幹細胞移植などの下流の機能解析に有利です11,12。また、EdUラベリングは非常に感度が高く迅速です。Cu(I)触媒による[3 + 2]環化付加反応(「クリック」化学)を介してEdU標識を検出するために、急速に吸収され、より小さなサイズの蛍光アジドを使用しているため、試料の浸透率は高くなります14。
ますます適用されている別のDNA標識法は、操作されたトランスジェニックマウスの使用です。これらのマウスは、テトラサイクリン応答性調節因子5,14によって制御されるヒストン2B緑色蛍光タンパク質(H2B-GFP)を発現する。マウスにテトラサイクリンチャウ/水を4週間から4ヶ月の追跡期間与えた後、GFP蛍光はサイクリング細胞で減少し、LRCのみが蛍光を保持します6。この方法の利点は、標識されたLRCを単離し、細胞培養または下流の機能解析のために生存し続けることができることです6,7。いくつかの研究は、長期使用のために追いかけられたときの静止幹細胞の不正確な標識を報告した。この結果は、H2B-GFP株からの漏出したバックグラウンド発現によるものであり、適切なテトラサイクリン調節応答によるものではなかった15。
さらに、過去のほとんどの文献では、LRCの検出を主に切片化されたスライドで使用していましたが、これは2次元であり、LRCの正確な位置と数を示すのに誤って偏っていることがよくあります。アプローチは、複雑な組織構造の切片に対して誤った角度を表示しました16。もう一つは、連続切片から3D画像を取得し、ポスト画像再構成を行う方法であった。これらのステップは、圧縮または引き伸ばされたセクションによる各シリアルセクションの変動による画像の歪みのために不正確であり、その結果、情報が欠落した16、17、18。この方法はまた、面倒で時間がかかりました。
LRCのホールマウントイメージングを容易にするには、蛍光を十分に維持しながらサンプルを透明化する必要があります。現在の組織透明化技術は、3つの主要なカテゴリーに分類することができる:有機溶媒ベースの組織透明化技術、水性試薬ベースの組織透明化技術、およびヒドロゲルベースの組織透明化技術17,19。ポリエチレングリコール(PEG)関連溶剤系(PEGASOS)が最近開発されました。このアプローチは、ほぼすべてのタイプの組織を透明にし、骨や歯などの硬組織を含む内因性蛍光を維持します20。PEGASOS法は、特に歯や骨の材料の除去において、他の組織透明化方法よりも優れています。他のほとんどの方法は、硬組織を部分的にしか除去できず、処理時間が長く、または高価な試薬を必要とする21。また、PEGASOS法は、他の方法よりも内因性蛍光を効率的に保存することができます。
この文献により、細胞研究のための新しい方法を作成しました。EdU標識のLRC検出の利点と、組織クリア標本の最も優れた3Dホールマウントイメージングを組み合わせました。サンプルは、高度なポリエチレングリコール(PEG)関連溶媒システム(PEGASOS)組織透明化技術15で処理されました。硬組織の透明性により、歯や下顎骨を壊すことなく、 in vivoで LRCの蛍光の3Dシグナルを再構築することができ、LRCをより正確に視覚化および定量する方法を作成しました。
この研究では、マウス切歯のLRCを視覚化するための革新的なガイドを提供します。マウス切歯幹細胞ニッチ内のLRCの位置と量を決定するために、3D視覚的アプローチを行いました。このプロジェクトでは、EdUラベリング、PEGASOS組織透明化技術、および共焦点顕微鏡を使用しました。ホールマウント組織上のLRCをEdU標識する方法と、透明で透明な標本を使用することで、従来の切片スライドの制限やその他の不利なDNA標識方法の両方を克服します。したがって、私たちの技術は、LRCの検出を必要とする幹細胞恒常性、特に硬組織の研究に適しています。このプロトコルは、他の組織や臓器における幹細胞の恒常性に焦点を当てている人にとっても同様に有利であり得る。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#215; Objective/NA 0.9</td>
			<td>Leica</td>
			<td>507702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bezyl benzoate (BB)</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>409529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane 9.0.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND cavity slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>BR475505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation Pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>23609-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Carboynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Miiilipore Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X Software</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehye</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGMMA500</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>447943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfa-Cyanine 3 Azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>D1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-10X</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-butanol (tB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>360538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing

マウス切歯は、マウスの寿命を通して継続的に成長する器官です。切歯の近位組織に存在する上皮幹細胞および間葉系幹細胞は、アメロブラスト、歯芽細胞、および歯髄線維芽細胞に分化する子孫を生じさせる。これらの細胞は、切歯組織の持続的なターンオーバーをサポートする上で非常に重要であり、マウス切歯を成体幹細胞の恒常性を研究するための優れたモデルにします。幹細胞は、5−エチニル−2'−デオキシウリジン(EdU)などのヌクレオチド類似体によって標識することができる長寿命の静止細胞を含むと考えられている。細胞は長期にわたってこのラベルを保持し、それに応じてラベル保持細胞(LRC)と呼ばれます。 LRCをin vivoで 可視化するアプローチは、幹細胞の恒常性をモニタリングするための堅牢なツールを提供します。本研究では、LRCを可視化・解析する手法について述べる。私たちの革新的なアプローチは、組織透明化後のマウス切歯のLRCとホールマウントEdU染色、それに続く共焦点顕微鏡検査、およびイメージングソフトウェアによる3次元(3D)再構成を特徴としています。この方法では、セクション化されたスライドでの従来のLRC分析と比較して、3Dイメージングの取得とバイアスのない定量が可能になります。

EdU標識とPEGASOS組織透明化プロセス(図2)の後、画像(図3B)に示すように透明な下顎骨が得られました。修正されたサンプルを、組織クリアリングプロセスのない通常の下顎骨と比較しました(図3A)。EdU標識を施した透明下顎骨(図3B)を共焦点イメージングに供した。我々は、(補足図1)に示すよう?...

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Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing

マウス切歯には、幹細胞ニッチに貴重なラベル保持細胞が含まれています。私たちは、ラベル保持細胞を偏りなく検出して定量化する新しい方法を持っています。私たちの研究では、下顎骨のPEGASOS組織除去後のEdU標識と3D再構成アプローチを使用しました。

組織透明化後の3D再構成アプローチを用いたマウス切歯の標識保持細胞の検出と定量(英語)

The murine incisor is an organ that grows continuously throughout the lifespan of the mouse. The epithelial and mesenchymal stem cells residing in the ...

このプロトコルは、マウス切歯幹細胞ニッチのラベル保持細胞のin vivoおよび3次元可視化および定量化のための方法を記載する。この手法は、時間を節約し、新しい学習者にとってユーザーフレンドリーです。3D画像は、組織に損傷を与えることなく取得されます。3D定量により、データの信頼性と精度が向上します。はじめに、下顎骨を解剖します。サンプルを4%パラホルムアルデヒドに固定し、室温で一晩保管します。孵卵後、下顎骨から筋肉を取り除きます。それらを0.5モルのエチレンジアミン四酢酸溶液に浸し、摂氏37度の振とう機で毎日培地を交換しながら4日間脱灰します。下顎骨を摂氏37度のシェーカーで15ミリリットルの25%Quadrol溶液で1日間脱色し、残りの血液ヘムを除去します。マウント全体の5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジン染色の場合は、本文に記載されているように、新しい5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジンラベルカクテルを準備します。下顎骨をリン酸緩衝生理食塩水でTween 20またはPBSTで摂氏37度のシェーカーで30分間すすぎます。下顎骨をリン酸緩衝生理食塩水でそれぞれ3分間繰り返し、続いて、新たに調製した5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジン標識カクテルでシェーカーで一晩インキュベートします。リン酸緩衝生理食塩水洗浄を3回繰り返し、下顎骨を本文に記載されている溶液に摂氏37度のシェーカーでそれぞれ6時間入れて連続脱脂質化を行います。下顎骨をtert-ブタノール-ポリエチレングリコール(tB-PEG)溶液で摂氏37度で2日間脱水し、毎日培地を交換します。2日後、安息香酸ベンジル75%、ポリエチレングリコール-メチルエーテルメタクリレート平均500またはPEG-MMA500、および3%クアドロールを含む安息香酸ベンジル-ポリエチレングリコール透明媒体で下顎骨をクリアして、屈折率マッチングを取得し、透明性が得られるまで。組織で透明化された下顎骨全体を、安息香酸ベンジル-ポリエチレングリコール透明媒体のブランドキャビティスライドに取り付け、ガラスカバースライドで覆います。共焦点イメージングソフトウェアで、目的の画像取得パラメータを設定します。蛍光励起パネルで、蛍光色素を最適に励起するために必要なレーザーを活性化します。蛍光検出パネルで、スライダーを動かして測定する波長を選択します。ガラスカバーガラスと対物レンズの屈折率に合わせて、カバーガラスの上に屈折率1.52の液浸オイルを一滴加え、取り付けた下顎骨を顕微鏡ステージに置きます。蛍光灯をオンにし、関心領域を画像化するための適切な倍率対物レンズを選択します。ライブスキャンモードでは、視野を特定して、下顎骨の領域全体をX次元とY次元で視覚化します。マウス切歯における幹細胞ニッチの体積を正確にカバーする上下のZステージ取得パラメータを設定する。2マイクロメートルのZステップサイズを使用するか、要件に応じて使用します。Zスタック画像ファイルをlif形式で取得して保存します。イメージングソフトウェアファイルコンバータを使用して、Zスタックイメージファイルをネイティブ形式のファイルタイプに変換します。イメージングソフトウェアで、「アリーナ」ボタンをクリックしてから、「イメージ」を選択します。元の lif ファイルを選択し、マージされたファイルを選択します。画像はイメージングソフトウェアにインポートされます。インポートしたファイルをダブルクリックして、画像データセットを開きます。イメージングソフトウェアで、ディスプレイ調整パネルにアクセスします。ディスプレイ調整パネルで、チャンネルの名前をクリックします。通常、デフォルトモードでは赤とラベル付けされます。[画像のプロパティ]ウィンドウで、[マップされた色]タブをクリックします。[カラー タブ ファイル] オプションで [Fire Flow] を選択し、[OK] をクリックします。サンプルから背景蛍光と陽性蛍光を区別するために、表示色を選択します。画面の左上の [シーン プロパティ] ウィンドウで、[Add New Surface] というラベルの付いた青いアイコンをクリックします。ボリュームアイコンの選択を解除すると、バックグラウンド蛍光の大部分が除去され、手動セグメンテーション中に正の蛍光がはっきりと表示されます。次に、[作成]タブをクリックし、[自動作成をスキップして手動で編集]タブを選択して、関心領域またはROIの手動セグメンテーションを開始します。手動サーフェス作成ウィザードで、[コンター]タブをクリックしてサンプルに基づいて方向を選択し、ROIを簡単にコンター化します。次に、右隅のポインタメニューが選択モードになっていることを確認します。スライス位置を調整して、組織内のROIを見つけます。前述のように、ほとんどのバックグラウンド蛍光はすでに除去されています。[描画] ボタンをクリックし、一時的な関心領域を描画します。ROI 以外の領域からの干渉を避けるために [可視性] オプションを [なし] に選択し、関心領域をスライスごとにセグメント化します。ROIの描画が完了したら、[サーフェスの作成]をクリックしてROIの3Dジオメトリを取得します。手動サーフェス作成ウィザードの「編集」(Edit) ボタンをクリックし、「すべてマスク」(Mask All) を選択します。ポップアウトされたマスクチャンネルウィンドウで、チャンネル選択オプションのチャンネル1を選択します。その後、マスクを適用する前に[チャンネルを複製]を選択します。マスク設定で、[内側/外側に一定]を選択し、ボクセルの外側サーフェスをゼロに設定します。[シーン プロパティ]ペインで、[サーフェス]オブジェクトの選択を解除し、[ボリューム]オブジェクトを選択します。ディスプレイ調整で、元の赤チャンネルの選択を解除し、マスクされた赤チャンネルを選択します。また、色の強度を調整して、目的の3Dレンダリングおよび陽性標識された蛍光ROIを取得します。スポットアイコンをクリックして新しいスポットオブジェクトを作成し、3Dレンダリングされたラベル保持セルと比較的重なる3Dスポットを作成して、3Dレンダリングされたラベル保持セルを定量化します。下の矢印を使用して、スポット作成ウィザードのステップ間を移動します。[完了] ボタンをクリックし、[統計] ボタンを選択します。次に、[全体] タブを選択して、画像内のスポットの総数の値を見つけます。5−エチニル−2−プライム−デオキシウリジン標識およびポリエチレングリコール関連溶媒系組織透明化処理の後、透明な下顎骨が得られた。修飾サンプルを組織透明化プロセスのない通常の下顎骨と比較し、5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジン標識を施した透明な下顎骨を共焦点イメージングに供した。切歯の光学切片は、XY平面における切歯頂部の幹細胞ニッチに標識保持細胞を示した。切歯頂点の3D画像構築は、上皮および間葉系幹細胞ニッチの両方で5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジン陽性ラベル保持静止幹細胞を示した。5-エチニル-2-プライム-デオキシウリジン陽性細胞を、間葉系標識保持細胞と同等に重複する定量用スポットに移した。間葉系ラベル保持細胞のみおよび上皮ラベル保持細胞に対してのみ作成されたスポットが画像に表示されます。上皮および間葉系ラベル保持細胞の定量も行った。処理と透明化の特性は最も重要なステップであり、満足のいく結果を得るには、組織の用途に応じて最適化する必要があります。この方法は、S2VGFPレベルのLRCを視覚化したり、細胞系譜追跡で子孫の位置とその定量または寄与の詳細を取得したりするように変更することもできます。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

loss-が及び着床前マウス胚の初期の細胞運命決定要因を調査するための機能獲得型のアプローチ

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

トランスポゾンのシステムを用いたマウスの羊水細胞から多能性幹細胞の作製

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

機械的組織解離およびフローサイトメトリーによる哺乳動物雄胚細胞のマルチシード精製のための標準的アプローチ

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

微小管と 3 D培養腸 Organoids とEx Vivo腸組織における Centrosomal 蛋白質の免疫蛍光ラベリング

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

内皮コロニー形成細胞と間葉系幹細胞によって形成された共培養スフェロイドを用いた3次元血管新生アッセイ系

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

全実装免疫学化学と3D再構成を用いた咽頭弓動脈の可視化と解析

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

初期マウス胚からのシーケンシングのための小型RNAライブラリーの調製

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...