Name: detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing
Uploaded: 2022-06-10T14:00:00
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원고를 편집해 주신 Meghann K. Holt에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH/NIDCR 보조금 DE026461 및 DE028345와 텍사스 A&M 치과대학에서 Xiaofang Wang 박사에게 지원하는 스타트업 자금의 지원을 받았습니다.

여기에 설명된 모든 방법은 Texas A&M University College of Dentistry의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.
1. EdU 라벨링 칵테일의 제조
<ol><li>표 1에 기재된 바와 같이 칵테일 스톡 용액을 준비한다.</li>
	<li>표 1에 설명된 대로 EdU 라벨링 칵테일을 준비합니다.</li>
</ol>2. 마우스 및 EdU 용액의 제조</stro...

<ol>
	<li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+incisor+through+gene+co-expression+analysis.">Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis.</a> eLife. 6, 24712 (2017).</li><li>Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+tooth+development,+growth,+repair,+and+regeneration.">Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).</li><li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quiescent+cell+population+replenishes+mesenchymal+stem+cells+to+drive+accelerated+growth+in+mouse+incisors.">A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors.</a> Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).</li><li>Biehs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMI1+represses+Ink4a/Arf+and+Hox+genes+to+regulate+stem+cells+in+the+rodent+incisor.">BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor.</a> Nature Cell Biology. 15 (7), 846-852 (2013).</li><li>Sharir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+pool+of+actively+cycling+progenitors+orchestrates+self-renewal+and+injury+repair+of+an+ectodermal+appendage.">A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage.</a> Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).</li><li>Terskikh, V. V., Vasiliev, A. V., Vorotelyak, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label+retaining+cells+and+cutaneous+stem+cells.">Label retaining cells and cutaneous stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 414-425 (2012).</li><li>de Miguel-Gomez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+the+endometrium:+From+the+discovery+of+adult+stem+cells+to+pre-clinical+models.">Stem cells and the endometrium: From the discovery of adult stem cells to pre-clinical models.</a> Cells. 10 (3), 595 (2021).</li><li>Ishikawa, Y., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+adult+stem+cells+in+murine+teeth+are+regulated+by+Shh+signaling.">Quiescent adult stem cells in murine teeth are regulated by Shh signaling.</a> Cell and Tissue Research. 369 (3), 497-512 (2017).</li><li>Chehrehasa, F., Meedeniya, A. C., Dwyer, P., Abrahamsen, G., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU,+a+new+thymidine+analogue+for+labelling+proliferating+cells+in+the+nervous+system.">EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 122-130 (2009).</li><li>Solius, G. M., Maltsev, D. I., Belousov, V. V., Podgorny, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+nucleotide+analogue-based+techniques+for+tracking+dividing+stem+cells:+An+overview.">Recent advances in nucleotide analogue-based techniques for tracking dividing stem cells: An overview.</a> The Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101345 (2021).</li><li>Ning, H., Albersen, M., Lin, G., Lue, T. F., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+EdU+labeling+on+mesenchymal+stem+cells.">Effects of EdU labeling on mesenchymal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (1), 57-63 (2013).</li><li>Lin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+tracking+of+mesenchymal+stromal+cells+with+EdU.">Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU.</a> Cytotherapy. 11 (7), 864-873 (2009).</li><li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Challen, G. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+expression+of+H2B-GFP+transgene+in+hematopoietic+stem+cells.">Promiscuous expression of H2B-GFP transgene in hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 3 (6), 2357 (2008).</li><li>Kopecky, B. J., Duncan, J. S., Elliott, K. L., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstructions+from+optical+sections+of+thick+mouse+inner+ears+using+confocal+microscopy.">Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).</li><li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+technique:+Recent+progress+and+biomedical+applications.">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing.">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+application+to+bone+and+dental+tissues.">Tissue clearing and its application to bone and dental tissues.</a> Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Fink, J., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cell+lineage+tracing+and+deep+tissue+imaging.">Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging.</a> BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).</li></ol>

증식하는 세포를 가능한 한 많이 표지하기 위해 성장하는 신생아 마우스에 다회 투여(BrdU, EdU)를 다회 투여한다 1,6,13. 추격 기간은 조직의 재생율 6,13에 관한 중요한 단계로 간주된다. 마우스 앞니는 매달 스스로 갱신됩니다. 이 특성을 통해 연구자는 추적 기간을 4주 이상으로 설정?...

지속적으로 성장하는 쥐 앞니는 성체 줄기 세포 연구를 위한 훌륭한 모델이다1. 앞니의 근위부에 상피(순순 및 설측 자궁경부 루프)와 중간엽 줄기세포(순순과 설측 경추 루프 사이)는 아멜로모세포, 치모세포, 치수 세포로 분화합니다. 이 독특한 과정은 조직 손실과 회전율을 보상하기 위한 세포의 공급원을 제공한다2. Sox2, Gli1, Thy1/CD90, Bmi1 등과 같은 여러 줄기 세포 마커가 있지만. 마우스 앞니에서 성체 줄기 세포의 서브세트에 대해 생체 내에서 확인되었으며, 이들은 단독으로 사용될 때 줄기 세포 집단을 나타내는데 부적절하다 1,3,4,5. 뉴클레오티드 유사체 DNA 라벨링 및 보존에 의해 수명이 긴 정지 세포를 시각화하면 대부분의 성체 줄기 세포 하위 집합에 대해 편견 없는 검출을 제공할 수있습니다 6. 또한, 이러한 접근법은 세포 거동과 치아 줄기 세포 집단3,8의 항상성을 이해하기 위한 많은 줄기 세포 식별 방법7 중에서 유용하다. 분열하는 줄기 세포는 상당한 추적 후에 DNA 라벨링을 잃게 되지만, 추정되는 정지 줄기 세포는 DNA 라벨을 유지하여 라벨 유지 세포(LRC)로 간주합니다6. 분열하지 않는 줄기 세포에 의한 DNA 라벨링 및 보유는 틈새 시장에서 추정되는 성체 줄기 세포를 표시하고 찾습니다.
지난 몇 년 동안 티미딘 유사체 5-브로모-2′-데옥시유리딘(BrdU) 표지는 세포 증식 분석을 위한 번거롭고 시간이 많이 소요되는 고해상도 현미경 비호환 3H-티미딘 DNA 표지 방법을 대체했습니다 6,9. 최근 몇 년 동안 5-ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU) 표지 기술이 BrdU보다 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 이 패턴은 몇 가지 이유로 나타났습니다. 첫째, BrdU 방법은 느리고 노동 집약적입니다. 사용자 조건은 가변적이며 검체의 미세 구조를 보존할 수 없습니다(DNA 변성으로 인해). 마찬가지로, BrdU 방법은 세포의 항원성을 상실하여 공동 국소화 실험 및 생체 내 줄기 세포 이식 3,7,9,10,11,12와 같은 다운스트림 기능 분석 및 분석에 비효율적입니다. BrdU는 또한 기형 유발 물질로, 배아 발달에서 LRC를 표지하는 데 적합하지 않다6. 또한 BrdU 방법은 전체 장착 시편에 사용할 때 비효율적입니다. 단점은 검체의 깊은 부분에서의 항체 침투율이 낮거나 깊은 침투를 위해 긴 항체 배양 기간이 필요하다는 점이다13. EdU 라벨링은 표본을 변성시키는 단계를 벗어나 미세 구조를 보존합니다. 이 특징은 co-localization 실험 및 줄기 세포 이식과 같은 다운스트림 기능 분석에 유리합니다11,12. 또한 EdU 라벨링은 매우 민감하고 빠릅니다. Cu(I) 촉매 [3 + 2] 고리첨가 반응("클릭" 화학)14을 통해 EdU 라벨을 검출하기 위해 빠르게 흡수되고 더 작은 크기의 형광 아지드를 사용하기 때문에 시편 침투율이 높습니다.
점점 더 많이 적용되는 또 다른 DNA 라벨링 방법은 조작된 형질전환 마우스를 사용하는 것입니다. 이 마우스는 테트라사이클린 반응성 조절 요소 5,14에 의해 제어되는 히스톤 2B 녹색 형광 단백질(H2B-GFP)을 발현합니다. 4주에서 4개월의 추적 기간 동안 생쥐에게 테트라사이클린 차우/물을 먹인 후, GFP 형광은 사이클링 세포에서 감소하고 LRC만이 형광을 유지합니다6. 이 방법의 장점은 표지된 LRC를 분리할 수 있고 세포 배양 또는 다운스트림 기능 분석에 사용할 수 있다는 것입니다 6,7. 일부 연구에서는 장기간 사용을 위해 추적했을 때 정지 줄기 세포의 부정확한 라벨링을 보고했습니다. 이 결과는 H2B-GFP 균주에서 새는 배경 발현으로 인한 것이지 적절한 테트라사이클린 조절 반응이 아니었기 때문이다15.
더욱이 과거의 대부분의 문헌은 주로 단면 슬라이드에서 LRC 검출을 사용했는데, 이는 2차원이며 LRC의 정확한 위치와 수를 표시하는 데 종종 잘못 편향되어 있습니다. 이 접근법은 복잡한 조직 구조의 절편에 대해 부정확한 각도를 표시하였다16. 다른 방법은 직렬 섹션에서 3D 이미지를 얻고 사후 이미지 재구성을 수행하는 것이었습니다. 이들 단계들은 압축되거나 늘어난 섹션들로 인한 각각의 시리얼 섹션들의 변형으로 인한 이미지 왜곡 때문에 부정확하였고, 그 결과 정보(16,17,18)가 누락되었다. 이 방법은 또한 힘들고 시간이 많이 걸렸습니다.
LRC의 전체 마운트 이미징을 용이하게 하려면 형광이 잘 유지되는 동안 샘플을 선명하게 해야 합니다. 현재의 조직 투명화 기술은 세 가지 주요 범주로 분류할 수 있다: 유기 용매 기반 조직 투명화 기술, 수성 시약 기반 조직 투명화 기술, 및 하이드로겔 기반 조직 투명화 기술17,19. 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 관련 용매 시스템(PEGASOS)이 최근에 개발되었습니다. 이 접근법은 거의 모든 유형의 조직을 투명하게 만들고 뼈와 치아와 같은 경조직을 포함한 내인성 형광을 보존한다20. PEGASOS 방법은 특히 치아 및 뼈 재료를 청소할 때 다른 조직 청소 방법에 비해 장점이 있습니다. 대부분의 다른 방법들은 경조직을 부분적으로만 제거할 수 있거나, 처리 시간이 길거나, 값비싼 시약을 필요로 한다21. 또한 PEGASOS 분석법은 다른 분석법에 비해 내인성 형광을 효율적으로 보존할 수 있습니다.
이 문헌은 우리로 하여금 세포 연구를 위한 새로운 방법을 만들도록 이끌었습니다. 우리는 EdU 라벨링의 LRC 검출 이점과 조직 투명 표본의 가장 우수한 3D 전체 마운트 이미징을 결합했습니다. 샘플을 고급 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 관련 용매 시스템(PEGASOS) 조직 투명화 기술15로 처리하였다. 경조직 투명성을 통해 치아나 하악골을 부러뜨리지 않고 생체 내에서 LRC 형광의 3D 신호를 재구성할 수 있어 LRC를 시각화하고 정량화하는 보다 정확한 방법을 만들 수 있었습니다.
이 연구에서는 마우스 앞니에서 LRC를 시각화하는 혁신적인 가이드를 제공합니다. 우리는 마우스 앞니 줄기 세포 틈새 내에서 LRC의 위치와 양을 결정하기 위해 3D 시각적 접근 방식을 만들었습니다. 이 프로젝트에서는 EdU 라벨링, PEGASOS 조직 투명화 기술 및 컨포칼 현미경을 사용했습니다. 전체 마운트 조직에 LRC를 EdU로 라벨링하는 당사의 방법과 투명하고 투명한 표본을 사용하는 방법은 기존의 절편 슬라이드와 기타 불리한 DNA 라벨링 방법의 한계를 모두 극복합니다. 따라서 우리의 기술은 LRC 검출이 필요한 줄기 세포 항상성 연구, 특히 경조직에 적합 할 것입니다. 이 프로토콜은 다른 조직과 기관의 줄기 세포 항상성에 초점을 맞춘 사람들에게도 똑같이 유리할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#215; Objective/NA 0.9</td>
			<td>Leica</td>
			<td>507702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bezyl benzoate (BB)</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>409529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane 9.0.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND cavity slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>BR475505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation Pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>23609-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Carboynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Miiilipore Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X Software</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehye</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGMMA500</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>447943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfa-Cyanine 3 Azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>D1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-10X</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-butanol (tB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>360538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing

쥐 앞니는 마우스의 수명 동안 지속적으로 성장하는 기관입니다. 앞니의 근위 조직에 존재하는 상피 및 중간엽 줄기 세포는 아멜로아세포, 치모세포 및 치수 섬유아세포로 분화할 자손을 생성합니다. 이 세포는 앞니 조직의 지속적인 회전율을 지원하는 데 중요하므로 쥐 앞니는 성체 줄기 세포의 항상성을 연구하기 위한 훌륭한 모델입니다. 줄기 세포는 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU)과 같은 뉴클레오티드 유사체에 의해 표지 될 수있는 수명이 긴 정지 세포를 함유하고있는 것으로 여겨진다. 셀은 시간이 지남에 따라 이 레이블을 유지하며 그에 따라 레이블 유지 셀(LRC)로 명명됩니다. 생체 내에서 LRC를 시각화하기 위한 접근 방식은 줄기 세포 항상성을 모니터링하기 위한 강력한 도구를 제공합니다. 본 연구에서는 LRC를 시각화하고 분석하는 방법에 대해 설명하였다. 당사의 혁신적인 접근 방식은 조직 세척 후 마우스 앞니의 LRC와 전체 장착 EdU 염색 후 컨포칼 현미경 및 이미징 소프트웨어를 사용한 3차원(3D) 재구성을 특징으로 합니다. 이 방법은 단면 슬라이드에 대한 기존 LRC 분석과 비교하여 3D 이미징 획득 및 비편향 정량화를 가능하게 합니다.

EdU 라벨링 및 PEGASOS 조직 투명화 과정(그림 2) 후, 이미지와 같이 투명한 하악골을 얻었습니다(그림 3B). 우리는 변형된 샘플을 조직 투명화 과정 없이 정상 하악과 비교했습니다(그림 3A). EdU 표지가 있는 투명한 하악골(그림 3B)을 공초점 이미징을 실시했습니다. 우리는 (보충 그림 1)에서 볼 수 있?...

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Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing

마우스 앞니는 줄기 세포 틈새에 귀중한 표지 유지 세포를 포함합니다. 우리는 라벨 유지 세포를 편견 없이 검출하고 정량화하는 새로운 방법을 가지고 있습니다. 우리의 연구는 하악의 PEGASOS 조직 제거 후 EdU 라벨링과 3D 재구성 접근법을 사용했습니다.

The murine incisor is an organ that grows continuously throughout the lifespan of the mouse. The epithelial and mesenchymal stem cells residing in the ...

이 프로토콜은 생체 내 및 마우스 앞니 줄기 세포 틈새의 표지 유지 세포의 3차원 시각화 및 정량화 방법을 설명합니다. 이 기술은 새로운 학습자에게 시간을 절약하고 사용자 친화적입니다. 3D 이미지는 조직을 손상시키지 않고 획득됩니다.3D 정량 분석은 데이터를 보다 신뢰성 있고 정확하게 만듭니다. 시작하려면 하악골을 해부하십시오. 샘플을 4% 파라포름알데히드에 고정하고 밤새 실온에 보관합니다.부화 후 하악골에서 근육을 제거하십시오. 0.5몰 에틸렌디아민테트라아세트산 용액에 담가 섭씨 37도 셰이커에서 매일 배지를 교체하면서 4일 동안 석회질을 제거합니다. 섭씨 37도 셰이커에서 하루 동안 25% Quadrol 용액 15ml에 하악골을 탈색하여 남은 헴을 제거합니다.전체 마운트 5-에티닐-2-프라임-데옥시우리딘 염색을 위해, 본문에 언급된 바와 같이 신선한 5-에티닐-2-프라임-데옥시우리딘 표지 칵테일을 제조한다. 섭씨 37도 셰이커에서 Tween 20 또는 PBST를 사용하여 인산염 완충 식염수로 하악골을 30분 동안 헹굽니다. 하악골을 인산염 완충 식염수로 각각 3분 동안 세 번 헹구는 것을 반복한 다음, 새로 제조된 5-에티닐-2-프라임-데옥시유리딘 표지 칵테일에서 밤새 진탕에서 배양합니다.인산염 완충 식염수 세척을 3회 반복하고 섭씨 37도 셰이커에서 각각 6시간 동안 텍스트에 언급된 용액에 하악골을 넣어 연속 지질 제거를 수행합니다. tert- 부탄올 - 폴리에틸렌 글리콜 또는 tB-PEG 용액에서 하악골을 섭씨 37도에서 2 일 동안 탈수하고 매일 배지를 교체합니다. 이틀 후, 75 % 벤질 벤조 에이트, 22 % 폴리에틸렌 글리콜-메틸 에테르 메타 크릴 레이트 평균 500 또는 PEG-MMA500 및 3 % Quadrol을 함유 한 벤질 벤조 에이트-폴리에틸렌 글리콜 클리어링 배지에서 하악을 깨끗이하여 굴절률 일치를 얻고 투명성이 달성 될 때까지.벤질 벤조에이트-폴리에틸렌 글리콜 투명 매체의 브랜드 캐비티 슬라이드에 조직 투명 전체 하악골을 장착하고 유리 커버 슬라이드로 덮습니다. 컨포칼 이미징 소프트웨어에서 원하는 이미지 획득 파라미터를 설정합니다. 형광 여기 패널에서 형광단을 최적으로 여기시키는 데 필요한 레이저를 활성화합니다.형광 검출용 패널에서 슬라이더를 움직여 측정할 파장을 선택합니다. 커버슬립 위에 굴절률이 1.52인 침지 오일 한 방울을 추가하여 유리 커버슬립과 대물렌즈의 굴절률과 일치시키고 장착된 하악을 현미경 스테이지에 놓습니다. 형광등을 켜고 적절한 배율 대물렌즈를 선택하여 관심 영역을 이미지화합니다.라이브 스캔 모드에서 시야를 식별하여 하악의 전체 영역을 X 및 Y 차원으로 시각화합니다. 마우스 앞니에서 줄기 세포 틈새의 부피를 정확하게 커버하는 상위 및 하단 Z 단계 획득 매개 변수를 설정합니다. 2마이크로미터의 Z 스텝 크기를 사용하거나 요구 사항에 따라 사용하십시오.Z-stack 이미지 파일을 lif 형식으로 획득하고 저장합니다. 이미징 소프트웨어 파일 변환기를 사용하여 Z 스택 이미지 파일을 네이티브 형식 파일 형식으로 변환합니다. 이미징 소프트웨어에서 Arena 버튼을 클릭한 다음 Image를 선택합니다.원본 lif 파일을 선택하고 병합된 파일을 선택합니다. 이미지를 이미징 소프트웨어로 가져옵니다. 가져온 파일을 두 번 클릭하여 이미지 데이터 세트를 엽니다.이미징 소프트웨어에서 디스플레이 조정 패널을 방문하십시오. 디스플레이 조정 패널에서 채널 이름을 클릭합니다. 일반적으로 기본 모드에서는 빨간색으로 표시됩니다.Image Properties(이미지 속성) 창에서 Mapped Color(매핑된 색상) 탭을 클릭합니다. Color Tab File(색상 탭 파일) 옵션에서 Fire Flow(Fire Flow)를 선택한 다음 OK(확인)를 클릭합니다. 배경 형광과 양성 형광을 샘플과 구별하기 위해 표시 색상을 선택합니다. 화면 왼쪽 상단의 Scene Properties 창에서 Add New Surface라는 파란색 아이콘을 클릭합니다.볼륨 아이콘을 선택 취소하면 대부분의 배경 형광이 제거되어 수동 분할 중에 양성 형광이 뚜렷하게 표시됩니다. 그런 다음 Create 탭을 클릭하고 Skip automatic creation, edit manually 탭을 선택하여 관심 영역 또는 ROI의 수동 세분화를 시작합니다. 수동 서피스 작성 마법사에서 등고선 탭을 클릭하여 샘플을 기반으로 방향을 선택하여 ROI를 쉽게 컨투어링할 수 있습니다.그런 다음 오른쪽 모서리에 있는 포인터 메뉴가 선택 모드인지 확인합니다. 슬라이스 위치를 조정하여 조직에서 ROI를 찾습니다. 앞서 언급했듯이 대부분의 배경 형광은 이미 제거되었습니다.그리기 버튼을 클릭하고 잠정 관심 영역을 그립니다. ROI 이외의 다른 영역으로부터의 간섭을 피하기 위해 가시성(Visibility) 옵션을 없음(None)으로 선택한 다음, 관심 영역을 슬라이스별로 세그먼트화합니다. ROI 도면이 완료되면 표면 생성을 클릭하여 ROI의 3D 지오메트리를 가져옵니다.수동 서피스 작성 마법사에서 편집(Edit) 버튼을 클릭하고 전체 마스크(Mask All)를 선택합니다. 튀어나온 마스크 채널 창의 채널 선택 옵션에서 채널 1을 선택합니다. 그런 다음 마스크를 적용하기 전에 채널 복제를 선택합니다.마스크 설정에서 내부/외부 일정(Constant inside/outside)을 선택하고 복셀 외부 표면을 0으로 설정합니다. 장면 속성(Scene Properties) 창에서 서피스(Surface) 오브젝트를 선택 취소하고 볼륨(Volume) 오브젝트를 선택합니다. [디스플레이 조정]에서 원래 [빨강] 채널을 선택 해제하고 [마스크 빨강] 채널을 선택합니다.그리고 색상 강도를 조정하여 원하는 3D 렌더링 및 포지티브 라벨링된 형광 ROI를 얻을 수 있습니다. 스팟 아이콘을 클릭하여 새 별색 오브젝트를 만들면 3D 렌더링된 레이블 유지 셀과 비슷하게 겹치는 3D 스팟을 만들어 3D 렌더링된 레이블 유지 셀을 수량화할 수 있습니다. 아래쪽 화살표를 사용하여 스팟 생성 마법사의 단계 사이를 이동합니다.Finish(마침) 버튼을 클릭하고 Statistic(통계) 버튼을 선택합니다. 그런 다음 전체 탭을 선택하여 이미지의 총 스팟 수에 대한 값을 찾습니다. 5-에티닐-2-프라임-데옥시유리딘 표지 및 폴리에틸렌 글리콜-관련 용매 시스템 조직-투명 하악골 처리 후, 투명한 하악골을 수득하였다.변형된 샘플을 조직 투명화 과정 없이 정상 하악과 비교하고, 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine-labeling으로 투명한 하악골을 공초점 이미징을 실시하였다. 앞니의 광학 섹션은 XY 평면에서 앞니 정점의 줄기 세포 틈새에서 표지 유지 세포를 보여주었습니다. 앞니 정점의 3D 이미지 구성은 상피 및 중간엽 줄기 세포 틈새 모두에서 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine 양성 표지 유지 정지 줄기 세포를 보여주었습니다.5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine 양성 세포는 정량화를 위해 중간엽 표지 유지 세포와 비교적 겹치는 지점으로 옮겨졌습니다. 중간엽 표지 유지 세포와 상피 표지 유지 세포에 대해서만 생성된 반점이 이미지에서 볼 수 있습니다. 상피 및 중간엽 표지 유지 세포의 정량화도 수행하였다.가공 및 제거에 대한 특성은 가장 중요한 단계이며 만족스러운 결과를 얻으려면 조직의 용도에 따라 최적화해야 합니다. 이 방법은 또한 S2VGFP 수준 LRC를 시각화하고 세포 계통 추적에서 자손 위치 및 정량 또는 기여도에 대한 세부 정보를 얻기 위해 수정할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

연구

발생학

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

기계 조직 해리 및 유동 세포 계측법에 의한 포유 동물 수컷 세포의 다중 종 정제에 대한 표준화 된 접근법

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Microtubules 및 전 비보 장 조직 및 장 Organoids 3 차원 생체 외에서 Centrosomal 단백질의 면역 형광 라벨

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

내피 콜로니 형성 세포및 중간엽 줄기 세포에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드를 이용한 3차원 혈관신생 분석 시스템

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

전체 마운트 면역 조직 화학 및 3D 재건을 사용하여 인두 아치 동맥의 시각화 및 분석

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...