Name: detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing
Uploaded: 2022-06-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing at JoVE.com

Vi takker Meghann K. Holt for redigering av manuskriptet. Denne studien ble støttet av NIH / NIDCR-tilskudd DE026461 og DE028345 og oppstartsfinansieringen fra Texas A &M School of Dentistry til Dr. Xiaofang Wang.

Alle metodene beskrevet her er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) for Texas A &M University College of Dentistry.
1. Tilberedning av EdU-merkingscocktailen
<ol><li>Forbered cocktaillagerløsningene som beskrevet i tabell 1.</li>
	<li>Forbered EdU-merkingscocktailen som beskrevet i tabell 1.</li>
</ol>2. Fremstilling av musene og EdU-løsningen
<ol><li>Forbered EdU-løsni...

<ol>
	<li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+incisor+through+gene+co-expression+analysis.">Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis.</a> eLife. 6, 24712 (2017).</li><li>Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+tooth+development,+growth,+repair,+and+regeneration.">Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).</li><li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quiescent+cell+population+replenishes+mesenchymal+stem+cells+to+drive+accelerated+growth+in+mouse+incisors.">A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors.</a> Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).</li><li>Biehs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMI1+represses+Ink4a/Arf+and+Hox+genes+to+regulate+stem+cells+in+the+rodent+incisor.">BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor.</a> Nature Cell Biology. 15 (7), 846-852 (2013).</li><li>Sharir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+pool+of+actively+cycling+progenitors+orchestrates+self-renewal+and+injury+repair+of+an+ectodermal+appendage.">A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage.</a> Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).</li><li>Terskikh, V. V., Vasiliev, A. V., Vorotelyak, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label+retaining+cells+and+cutaneous+stem+cells.">Label retaining cells and cutaneous stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 414-425 (2012).</li><li>de Miguel-Gomez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+the+endometrium:+From+the+discovery+of+adult+stem+cells+to+pre-clinical+models.">Stem cells and the endometrium: From the discovery of adult stem cells to pre-clinical models.</a> Cells. 10 (3), 595 (2021).</li><li>Ishikawa, Y., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+adult+stem+cells+in+murine+teeth+are+regulated+by+Shh+signaling.">Quiescent adult stem cells in murine teeth are regulated by Shh signaling.</a> Cell and Tissue Research. 369 (3), 497-512 (2017).</li><li>Chehrehasa, F., Meedeniya, A. C., Dwyer, P., Abrahamsen, G., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU,+a+new+thymidine+analogue+for+labelling+proliferating+cells+in+the+nervous+system.">EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 122-130 (2009).</li><li>Solius, G. M., Maltsev, D. I., Belousov, V. V., Podgorny, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+nucleotide+analogue-based+techniques+for+tracking+dividing+stem+cells:+An+overview.">Recent advances in nucleotide analogue-based techniques for tracking dividing stem cells: An overview.</a> The Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101345 (2021).</li><li>Ning, H., Albersen, M., Lin, G., Lue, T. F., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+EdU+labeling+on+mesenchymal+stem+cells.">Effects of EdU labeling on mesenchymal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (1), 57-63 (2013).</li><li>Lin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+tracking+of+mesenchymal+stromal+cells+with+EdU.">Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU.</a> Cytotherapy. 11 (7), 864-873 (2009).</li><li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Challen, G. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+expression+of+H2B-GFP+transgene+in+hematopoietic+stem+cells.">Promiscuous expression of H2B-GFP transgene in hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 3 (6), 2357 (2008).</li><li>Kopecky, B. J., Duncan, J. S., Elliott, K. L., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstructions+from+optical+sections+of+thick+mouse+inner+ears+using+confocal+microscopy.">Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).</li><li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+technique:+Recent+progress+and+biomedical+applications.">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing.">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+application+to+bone+and+dental+tissues.">Tissue clearing and its application to bone and dental tissues.</a> Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Fink, J., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cell+lineage+tracing+and+deep+tissue+imaging.">Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging.</a> BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).</li></ol>

Flere doser injeksjoner (BrdU, EdU) brukes vanligvis på voksende nyfødte mus for å merke prolifererende celler så mye som mulig 1,6,13. Jaktperioden regnes som et kritisk skritt med hensyn til fornyelseshastigheten for vev 6,13. Musesnittet fornyer seg rundt hver måned. Denne egenskapen gjør det mulig for forskere å sette jaktperioden til 4 uker eller lenger <sup ...

Den kontinuerlig voksende musesnittet er en utmerket modell for å studere voksne stamceller1. Epitelet (labial og lingual cervical loop) og mesenkymale stamceller (mellom labial og lingual cervical loop) som ligger på den proksimale siden av snittet, skiller seg ut i ameloblaster, odontoblaster og tannpulpceller. Denne unike prosessen gir en kilde til celler for kompensasjon av vevstap og omsetning2. Selv om flere stamcellemarkører som Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1, etc. har blitt identifisert in vivo for undergrupper av voksne stamceller i musefortenner, er de utilstrekkelige til å representere stamcellepopulasjonene når de brukes alene 1,3,4,5. Visualisering av langlivede hvilende celler ved nukleotidanalog DNA-merking og retensjon kan gi objektiv deteksjon for de fleste undergrupper av voksne stamceller6. Videre er denne tilnærmingen nyttig blant mange stamcelleidentifikasjonsmetoder7 for å forstå celleadferd og homeostase av dental stamcellepopulasjoner 3,8. Mens de delende stamcellene ville miste DNA-merkingen etter en betydelig jakt, beholder de antatte hvilende stamcellene sin DNA-etikett, og anser dem som etikettbeholdende celler (LRC)6. DNA-merking og oppbevaring av ikke-delende stamceller vil markere og lokalisere de antatte voksne stamceller i sine nisjer.
I løpet av de siste årene har tymidinanalog 5-brom-2'-deoksyuridin (BrdU) merking erstattet den tungvinte, tidkrevende og høyoppløselige mikroskopien inkompatibel 3H-tymidin DNA-merkingsmetode for celleproliferasjonsanalyser 6,9. I de senere år har 5-etynyl-2'-deoksyuridin (EdU) merkingsteknikken blitt stadig mer brukt over BrdU. Dette mønsteret oppsto av flere grunner. For det første er BrdU-metoden langsom og arbeidskrevende. Brukerforholdene er varierende, og det er ikke i stand til å bevare ultrastrukturen i prøver (på grunn av DNA-denaturering). På samme måte mister BrdU-metoden cellens antigenisitet, noe som gjør den ineffektiv for nedstrøms funksjonelle analyser og analyser som samlokaliseringseksperimenter og in vivo stamcelletransplantasjon 3,7,9,10,11,12. BrdU er også et teratogen, som ikke er egnet for merking av LRC i embryonal utvikling6. BrdU-metoden er også ineffektiv når den brukes i helmonterte prøver. Ulempene er lav penetrasjon av antistoffer i den dype delen av prøvene eller kravet om en lang antistoffinkubasjonsperiode for dyp penetrasjon13. EdU-merking unnslipper trinnene til denaturerende prøver, og bevarer dermed ultrastrukturen. Denne funksjonen er fordelaktig for nedstrøms funksjonelle analyser som samlokaliseringseksperimenter og stamcelletransplantasjon11,12. EdU-merking er også svært følsom og rask; prøvepenetrasjonen er høy på grunn av bruk av raskt absorberte og mindre fluorescerende azider for påvisning av EdU-etiketter gjennom en Cu(I)-katalysert [3 + 2] cykloaddisjonsreaksjon ("klikk" kjemi)14.
En annen stadig mer anvendt DNA-merkingsmetode er bruken av konstruerte transgene mus. Disse musene uttrykker histon 2B grønt fluorescerende protein (H2B-GFP) kontrollert av et tetracyklin-responsivt regulatorelement 5,14. Etter å ha matet mus med tetracyklin chow / vann i en 4-ukers til 4-måneders jaktperiode, vil GFP-fluorescensen avta i sykkelceller, og bare LRC beholder fluorescensen6. Fordelen med denne metoden er at de merkede LRC-ene kan isoleres og forbli levedyktige for cellekultur eller nedstrøms funksjonelle analyser 6,7. Noen studier rapporterte unøyaktig merking av hvilende stamceller når de ble jaget for langvarig bruk. Dette resultatet skyldtes et lekkende bakgrunnsuttrykk fra H2B-GFP-stammen og ikke den passende tetracyklinregulerte responsen15.
Videre brukte de fleste litteratur tidligere LRC-deteksjonen hovedsakelig på seksjonerte lysbilder, som er todimensjonale og ofte feilaktig partisk når det gjelder å vise nøyaktig plassering og antall LRC-er. Tilnærmingen viste feil vinkler for seksjoner av komplekse vevsstrukturer16. Den andre metoden var å skaffe 3D-bilder fra serielle seksjoner og utføre rekonstruksjoner etter bildet. Disse trinnene var unøyaktige på grunn av bildeforvrengning fra variasjoner i hver serieseksjon på grunn av komprimerte eller strakte seksjoner, noe som resulterte i manglende informasjon16,17,18. Metoden var også arbeidskrevende og tidkrevende.
For å legge til rette for helmontert avbildning av LRC, må prøvene gjøres klare mens fluorescensen er godt vedlikeholdt. Nåværende vevsfjerningsteknikker kan klassifiseres i tre hovedkategorier: organiske løsningsmiddelbaserte vevsfjerningsteknikker, vandige reagensbaserte vevsrensingsteknikker og hydrogelbaserte vevsfjerningsteknikker17,19. Det polyetylenglykol (PEG)-assosierte løsningsmiddelsystemet (PEGASOS) er nylig utviklet. Denne tilnærmingen gjør nesten alle typer vev gjennomsiktige og bevarer endogen fluorescens, inkludert hardt vev som bein og tenner20. PEGASOS-metoden har fordeler i forhold til andre vevsfjerningsmetoder, spesielt når det gjelder å rydde tann- og beinmaterialer. De fleste andre metoder kunne bare delvis fjerne hardt vev, ha lang behandlingstid eller kreve kostbare reagenser21. PEGASOS-metoden kan også effektivt bevare endogen fluorescens over andre metoder.
Denne litteraturen førte oss til å skape en ny metode for cellestudier. Vi kombinerte LRC-deteksjonsfordelene ved EdU-merking med den mest overlegne 3D-helmonterte avbildningen av vevsklarerte prøver; prøvene ble behandlet med avansert polyetylenglykol (PEG)-assosiert løsningsmiddelsystem (PEGASOS) vevsclearing teknikk15. Gjennomsiktighet i hardt vev gjorde det mulig for oss å rekonstruere 3D-signalet til LRCs fluorescens in vivo uten å bryte tennene eller kjeven, noe som skaper en mer nøyaktig måte å visualisere og kvantifisere LRC på.
I denne studien gir vi en innovativ guide for å visualisere LRC i musesnittet. Vi laget en 3D-visuell tilnærming for å bestemme plasseringen og mengden av LRC-er i musens fortennende stamcellenisje. Dette prosjektet brukte EdU-merking, PEGASOS vevsryddingsteknikker og konfokalmikroskopi. Vår metode for EdU-merking av LRC-ene på helmontert vev og bruk av en ryddet og gjennomsiktig prøve overvinner både begrensningene i tradisjonelle seksjonerte lysbilder og andre ufordelaktige DNA-merkingsmetoder. Dermed vil vår teknikk være egnet for studier på stamcellehomeostase som krever LRC-deteksjon, spesielt på hardt vev. Protokollen kan være like fordelaktig for de som fokuserer på stamcellehomeostase i andre vev og organer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#215; Objective/NA 0.9</td>
			<td>Leica</td>
			<td>507702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bezyl benzoate (BB)</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>409529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane 9.0.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND cavity slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>BR475505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation Pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>23609-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Carboynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Miiilipore Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X Software</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehye</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGMMA500</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>447943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfa-Cyanine 3 Azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>D1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-10X</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-butanol (tB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>360538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing

Murine incisor er et organ som vokser kontinuerlig gjennom musens levetid. De epitel- og mesenkymale stamcellene som ligger i det proksimale vevet i fortennene, gir opphav til avkom som vil differensiere til ameloblaster, odontoblaster og massefibroblaster. Disse cellene er avgjørende for å støtte den vedvarende omsetningen av snittvev, noe som gjør murine incisor til en utmerket modell for å studere homeostase av voksne stamceller. Stamceller antas å inneholde langlivede hvilende celler som kan merkes av nukleotidanaloger som 5-etynyl-2'-deoksyuridin (EdU). Cellene beholder denne etiketten over tid og kalles følgelig etikettbeholdende celler (LRC). Tilnærminger for visualisering av LRC in vivo gir et robust verktøy for overvåking av stamcellehomeostase. I denne studien beskrev vi en metode for å visualisere og analysere LRC. Vår innovative tilnærming har LRC-er i musefortenner etter vevsrydding og helmontert EdU-farging etterfulgt av konfokalmikroskopi og en 3-dimensjonal (3D) rekonstruksjon med bildebehandlingsprogramvaren. Denne metoden muliggjør 3D-bildeinnsamling og ikke-partisk kvantifisering sammenlignet med tradisjonell LRC-analyse på inndelte lysbilder.

Etter EdU-merking og PEGASOS-vevsclearingprosessen (figur 2) ble den gjennomsiktige kjeven oppnådd som vist på vårt bilde (figur 3B). Vi sammenliknet den modifiserte prøven med en normal kjeve uten vevsryddingsprosess (figur 3A). Den gjennomsiktige kjeven (figur 3B) med EdU-merking ble utsatt for konfokal avbildning. Vi fokuserte på fortennspissen som viser stamcellenisjen som vist i (tille...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing at JoVE.com

Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing

Musen incisor inneholder verdifulle etikett-beholde celler i sin stamcelle nisje. Vi har en ny måte å objektivt oppdage og kvantifisere de etikettbeholdende cellene på; vår studie brukte EdU-merking og en 3D-rekonstruksjonstilnærming etter PEGASOS-vevsrydding av kjeven.

Deteksjon og kvantifisering av etikettbeholdende celler i musesnitt ved hjelp av en 3D-rekonstruksjonstilnærming etter vevsrydding

The murine incisor is an organ that grows continuously throughout the lifespan of the mouse. The epithelial and mesenchymal stem cells residing in the ...

Denne protokollen beskriver en metode for in vivo og tredimensjonal visualisering og kvantifisering av etikettholdende celler av mus incisor stamcelle nisje. Denne teknikken er tidsbesparende og brukervennlig for nye elever. 3D-bildene er anskaffet uten å skade vevet.3D-kvantifiseringen gjør dataene mer pålitelige og nøyaktige. For å begynne, dissekere mandiblene. Fest prøvene i 4% paraformaldehyd, og hold dem ved romtemperatur over natten.Etter inkubasjonen, fjern musklene fra mandiblene. Fordyp dem i 0,5-molar etylendiamintetraeddiksyreoppløsning for å avkalke i fire dager med en daglig middelsendring på en 37-graders Celsius-shaker. Decolorize mandiblene i 15 ml 25% Quadrol-løsning på en 37-graders Celsius shaker i en dag for å fjerne gjenværende blodheme.For helmontering 5-etynyl-2-prime-deoksyuridinfarging, tilbered en fersk 5-etynyl-2-prime-deoksyuridin-merkingscocktail som nevnt i teksten. Skyll mandiblene med en fosfatbufret saltvann med Tween 20 eller PBST i 30 minutter på en 37-graders Celsius shaker. Gjenta skylling av mandiblene med fosfatbufret saltvann tre ganger i tre minutter hver, etterfulgt av inkubering i en nylaget 5-etynyl-2-prime-deoksyuridin-merkingscocktail på en shaker over natten.Gjenta fosfatbufret saltvannsvask tre ganger, og utfør seriell de-lipidering ved å plassere mandiblene i løsningene nevnt i teksten i seks timer hver i 37-graders Celsius shaker. Dehydrer mandiblene i tert-butanol-polyetylenglykol, eller tB-PEG, oppløsning i to dager ved 37 grader Celsius med den daglige mediumendringen. Etter to dager, fjern kjeven i benzylbenzoat-polyetylenglykolclearingsmedium inneholdende 75 % benzylbenzoat, 22 % polyetylenglykol-metyleter metakrylat gjennomsnittlig 500 eller PEG-MMA500 og 3 % Quadrol for å oppnå samsvar med brytningsindeks og inntil gjennomsiktighet oppnås.Monter den vevsryddede hele mandibelen på merkehulrom i benzylbenzoat-polyetylenglykol-clearingmediet, og dekk det med glassdekselglass. I konfokalbildebehandlingsprogramvaren angir du de ønskede parameterne for bildeoppkjøp. I panelet for fluorescerende eksitasjon, aktiver laseren som kreves for å opphisse fluoroforer optimalt.I panelet for fluorescerende deteksjon, flytt glidebryteren for å velge bølgelengdene som skal måles. Legg til en dråpe nedsenkningsolje med en brytningsindeks på 1,52 på toppen av dekselet for å matche brytningsindeksen til glassdekselet og objektivet, og plasser den monterte mandibelen på mikroskopstadiet. Slå på lysrørene, og velg et passende forstørrelsesmål for å vise interessante områder.I live scan-modus, identifiser synsfeltet for å visualisere hele regionen av mandibelen i X- og Y-dimensjonene. Angi øvre og nedre Z-trinns oppkjøpsparametere som nøyaktig dekker volumet av stamcellenisjen i mussnittet. Bruk en Z-trinnstørrelse på to mikrometer eller i henhold til dine krav.Skaff og lagre Z-stack-bildefiler i lif-format. Bruk et bildebehandlingsprogramvarefilkonverteringsprogram til å konvertere Z-stack-bildefilen til filtypen i opprinnelig format. I bildebehandlingsprogramvaren klikker du på Arena-knappen og velger deretter Bilde.Velg den opprinnelige lif-filen, og velg den sammenslåtte filen. Bildene vil bli importert til bildebehandlingsprogramvaren. Dobbeltklikk på den importerte filen for å åpne bildedatasettet.I bildebehandlingsprogramvaren går du til skjermjusteringspanelet. I skjermjusteringspanelet klikker du på navnet på kanalen. Det er vanligvis merket som rødt i standardmodus.I vinduet Bildeegenskaper klikker du på kategorien Kartlagt farge. I alternativet Fargefanefil velger du Brannstrøm, og klikker deretter på OK. Velg visningsfargen for å skille bakgrunnsfluorescensen og den positive fluorescensen fra prøven. Øverst til venstre på skjermen, i ruten Sceneegenskaper, klikker du på det blå ikonet merket Legg til ny overflate.Fjern merket for Volum-ikonet for å fjerne mesteparten av bakgrunnsfluorescensen, noe som resulterer i at den positive fluorescensen er tydelig synlig under manuell segmentering. Deretter starter du den manuelle segmenteringen av interesseområdet, eller avkastningen, ved å klikke på Opprett-fanen og velge kategorien Hopp over automatisk oppretting, rediger manuelt. I veiviseren for manuell overflateoppretting klikker du på kategorien Kontur for å velge retning basert på prøvene for å enkelt konturere avkastningen.Deretter må du kontrollere at pekermenyen i høyre hjørne er i valgmodus. Juster stykkeposisjonen for å finne avkastningen i vevet. Som nevnt tidligere er det meste av bakgrunnsfluorescensen allerede fjernet.Klikk på Tegn-knappen, og tegn et foreløpig interesseområde. Velg alternativet Synlighet til Ingen for å unngå forstyrrelser fra andre områder enn ROI, etterfulgt av segmentering av interesseområdet bit for skive. Etter at ROI-tegningen er ferdig, klikker du på Opprett overflate for å få en 3D-geometri av avkastningen.Klikk på Rediger-knappen i veiviseren for manuell overflateoppretting, og velg Masker alle. I vinduet Mask Channel (maskekanal) velger du Kanal 1 i alternativene for kanalvalg. Velg deretter Dupliser kanal før du bruker masken.I maskeinnstillingene velger du Konstant innvendig/utvendig, og setter voxelens utvendige overflate til null. I ruten Sceneegenskaper fjerner du merket for Surface-objektet og velger Volume-objektet. I Skjermjustering fjerner du merket for den opprinnelige røde kanalen og velger den maskerte røde kanalen.Og juster fargeintensitetene for å få ønsket 3D-gjengitt og positivt merket fluorescensavkastning. Opprett et nytt spotobjekt ved å klikke Spots-ikonet for å kvantifisere de 3D-gjengitte etikettbeholdende cellene ved å opprette 3D-punkter som sammenlignbart overlapper med 3D-gjengitte etikettbeholdende celler. Bruk de nederste pilene til å flytte mellom trinnene i veiviseren for oppretting av flekker.Klikk på Fullfør-knappen, og velg Statistikk-knappen. Velg deretter kategorien Generelt for å finne verdien for totalt antall flekker i bildet. Etter 5-etynyl-2-prime-deoksyuridinmerking og polyetylenglykolassosiert løsningsmiddelsystem vevsclearingprosess, ble den gjennomsiktige mandibelen oppnådd.Den modifiserte prøven ble sammenlignet med en normal mandible uten vevsfjerningsprosess, og en gjennomsiktig mandible med 5-etynyl-2-prime-deoksyuridin-merking ble utsatt for konfokal avbildning. Den optiske delen av fortennen viste etikettholdende celler i stamcellenisjen til fortennspissen i XY-planet. 3D-bildekonstruksjonen av et fortenntoppunkt viste 5-etynyl-2-prime-deoksyuridin-positive etikettbevarende hvilende stamceller i både epitel- og mesenkymal stamcellenisje.De 5-etynyl-2-prime-deoksyuridin-positive cellene ble overført til flekker for kvantifisering som sammenlignbart overlappet med de mesenkymale etikettholdende cellene. Flekkene som bare er opprettet for mesenkymale etikettbeholdende celler og bare for epiteletikettbeholdende celler, er synlige i bildet. Kvantifisering av epitel- og mesenkymale etikettholdende celler ble også utført.Egenskaper til prosessering og rydding er de viktigste trinnene og bør optimaliseres i henhold til vevets bruk for å oppnå tilfredsstillende resultater. Denne metoden kan også modifiseres for å visualisere LRC-er på S2VGFP-nivå og i sporing av cellelinjer for å få detaljer om avkomplassering og deres kvantifisering eller bidrag.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Taps og Gain-of-funksjon tilnærming for å undersøke Tidlig Cell Fate Determinanter i Før implantasjon Mouse Embryoer

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produksjonen av Pluripotent stamceller fra mus fostervann Cells Ved hjelp av en Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

En standardisert tilnærming til multispecies Rensing av mammaliske mannlige kimceller ved hjelp av mekanisk vævsdissosiasjon og flytcytometri

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal helmontering: En romanbehandlings- og bildeprotokoll for tykke, tredimensjonale vev Tverrsnitt av huden

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescerende merking av piskehale som henger og Centrosomal proteiner i Ex Vivo tarmen Tissue og 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Tredimensjonale angiogenese analysen system bruker co-kultur Spheroids dannet av endothelial Colony forming celler og Mesenchymal stamceller

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Visualisering og analyse av farynle arterier ved hjelp av hele mount immunohistokjemi og 3D rekonstruksjon

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Utarbeidelse av små RNA biblioteker for sekvensering fra tidlig mus embryoer

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...