Name: detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing
Uploaded: 2022-06-10T14:00:00
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Agradecemos a Meghann K. Holt pela edição do manuscrito. Este estudo foi apoiado pelos subsídios do NIH/NIDCR DE026461 e DE028345 e o financiamento inicial da Faculdade de Odontologia do Texas A&M ao Dr. Xiaofang Wang.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) para a Texas A&M University College of Dentistry.
1. Preparação do coquetel de rotulagem EdU
<ol><li>Preparar as soluções de coquetel conforme descrito na Tabela 1.</li>
	<li>Preparar o coquetel de rotulagem da EdU conforme descrito na Tabela 1.</li>
</ol>2. Preparação dos ratos e da solução de EdU</...

<ol>
	<li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+incisor+through+gene+co-expression+analysis.">Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis.</a> eLife. 6, 24712 (2017).</li><li>Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+tooth+development,+growth,+repair,+and+regeneration.">Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).</li><li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quiescent+cell+population+replenishes+mesenchymal+stem+cells+to+drive+accelerated+growth+in+mouse+incisors.">A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors.</a> Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).</li><li>Biehs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMI1+represses+Ink4a/Arf+and+Hox+genes+to+regulate+stem+cells+in+the+rodent+incisor.">BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor.</a> Nature Cell Biology. 15 (7), 846-852 (2013).</li><li>Sharir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+pool+of+actively+cycling+progenitors+orchestrates+self-renewal+and+injury+repair+of+an+ectodermal+appendage.">A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage.</a> Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).</li><li>Terskikh, V. V., Vasiliev, A. V., Vorotelyak, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label+retaining+cells+and+cutaneous+stem+cells.">Label retaining cells and cutaneous stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 414-425 (2012).</li><li>de Miguel-Gomez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+the+endometrium:+From+the+discovery+of+adult+stem+cells+to+pre-clinical+models.">Stem cells and the endometrium: From the discovery of adult stem cells to pre-clinical models.</a> Cells. 10 (3), 595 (2021).</li><li>Ishikawa, Y., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+adult+stem+cells+in+murine+teeth+are+regulated+by+Shh+signaling.">Quiescent adult stem cells in murine teeth are regulated by Shh signaling.</a> Cell and Tissue Research. 369 (3), 497-512 (2017).</li><li>Chehrehasa, F., Meedeniya, A. C., Dwyer, P., Abrahamsen, G., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU,+a+new+thymidine+analogue+for+labelling+proliferating+cells+in+the+nervous+system.">EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 122-130 (2009).</li><li>Solius, G. M., Maltsev, D. I., Belousov, V. V., Podgorny, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+nucleotide+analogue-based+techniques+for+tracking+dividing+stem+cells:+An+overview.">Recent advances in nucleotide analogue-based techniques for tracking dividing stem cells: An overview.</a> The Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101345 (2021).</li><li>Ning, H., Albersen, M., Lin, G., Lue, T. F., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+EdU+labeling+on+mesenchymal+stem+cells.">Effects of EdU labeling on mesenchymal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (1), 57-63 (2013).</li><li>Lin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+tracking+of+mesenchymal+stromal+cells+with+EdU.">Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU.</a> Cytotherapy. 11 (7), 864-873 (2009).</li><li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Challen, G. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+expression+of+H2B-GFP+transgene+in+hematopoietic+stem+cells.">Promiscuous expression of H2B-GFP transgene in hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 3 (6), 2357 (2008).</li><li>Kopecky, B. J., Duncan, J. S., Elliott, K. L., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstructions+from+optical+sections+of+thick+mouse+inner+ears+using+confocal+microscopy.">Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).</li><li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+technique:+Recent+progress+and+biomedical+applications.">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing.">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+application+to+bone+and+dental+tissues.">Tissue clearing and its application to bone and dental tissues.</a> Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Fink, J., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cell+lineage+tracing+and+deep+tissue+imaging.">Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging.</a> BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).</li></ol>

Doses múltiplas de injeções (BrdU, EdU) são geralmente usadas em camundongos neonatais em crescimento para marcar ao máximo as células em proliferação 1,6,13. O período de perseguição é considerado uma etapa crítica em relação à taxa de renovação dos tecidos 6,13. O incisivo do rato renova-se todos os meses. Essa característica permite que os pesquisad...

O incisivo de camundongo em crescimento contínuo é um excelente modelo para o estudo de células-tronco adultas1. As células-tronco epiteliais (alça cervical labial e lingual) e mesenquimais (entre a alça cervical labial e lingual) que residem na face proximal do incisivo diferenciam-se em ameloblastos, odontoblastos e células da polpa dentária. Este processo único fornece uma fonte de células para compensação da perda e turnover tecidual2. Embora vários marcadores de células-tronco como Sox2, Gli1, Thy1/CD90, Bmi1, etc. foram identificadas in vivo para os subgrupos de células-tronco adultas em incisivos de camundongos, que são inadequadas para representar as populações de células-tronco quando usadas isoladamente 1,3,4,5. A visualização de células quiescentes de vida longa por marcação e retenção de DNA análogo a nucleotídeos poderia fornecer detecção imparcial para a maioria dos subconjuntos de células-tronco adultas6. Além disso, essa abordagem é útil entre muitos métodos de identificação de células-tronco7 para entender o comportamento celular e a homeostase de populações de células-tronco dentárias 3,8. Enquanto as células-tronco em divisão perderiam sua marcação de DNA após uma perseguição considerável, as supostas células-tronco quiescentes retêm seu rótulo de DNA, considerando-as células retentoras de marcação (LRCs)6. A marcação e retenção do DNA por células-tronco não em divisão marcará e localizará as células-tronco adultas putativas em seus nichos.
Nos últimos anos, a marcação com 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) análogo da timidina substituiu o método pesado, demorado e incompatível de marcação de DNA 3H-timidina por microscopia de alta resolução para ensaios de proliferação celular 6,9. Nos últimos anos, a técnica de marcação com 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) tem sido cada vez mais utilizada em relação à BrdU. Esse padrão surgiu por vários motivos. Primeiro, o método BrdU é lento e trabalhoso. As condições do usuário são variáveis, e é incapaz de preservar a ultraestrutura nos espécimes (devido à desnaturação do DNA). Da mesma forma, o método BrdU perde a antigenicidade das células, tornando-o ineficiente para análises funcionais a jusante e ensaios como os experimentos de co-localização e transplante in vivo de células-tronco 3,7,9,10,11,12. O BrdU também é um teratógeno, que não é adequado para marcação de LRCs no desenvolvimento embrionário6. Além disso, o método BrdU é ineficiente quando usado em amostras de montagem inteira. As desvantagens são a baixa penetração de anticorpos na parte profunda dos espécimes ou a necessidade de um longo período de incubação de anticorpos para penetração profunda13. A marcação EdU escapa das etapas de desnaturação dos espécimes, preservando assim a ultraestrutura. Essa característica é vantajosa para análises funcionais a jusante, como experimentos de co-localização e transplante de células-tronco11,12. Além disso, a marcação EdU é altamente sensível e rápida; A penetração do espécime é alta devido ao uso de azidas fluorescentes de menor tamanho e rápida absorção para detecção de etiquetas de EdU através de uma reação de cicloadição [3 + 2] catalisada por(I) ("química de clique")14.
Outro método de marcação de DNA cada vez mais aplicado é o uso de camundongos transgênicos modificados. Esses camundongos expressam a proteína fluorescente verde da histona 2B (H2B-GFP) controlada por um elemento regulador responsivo à tetraciclina 5,14. Depois de alimentar camundongos com ração/água de tetraciclina por um período de perseguição de 4 semanas a 4 meses, a fluorescência da GFP diminuirá nas células cicladoras e apenas as LRCs reterão a fluorescência6. A vantagem desse método é que as LRCs marcadas podem ser isoladas e permanecem viáveis para cultura celular ou análises funcionais a jusante 6,7. Alguns estudos relataram marcação imprecisa de células-tronco quiescentes quando perseguidas para uso a longo prazo. Esse resultado foi devido a uma expressão de fundo vazada da cepa H2B-GFP e não à resposta apropriada regulada por tetraciclina15.
Além disso, a maioria da literatura no passado usava a detecção de LRCs principalmente em lâminas seccionadas, que são bidimensionais e muitas vezes erroneamente enviesadas para mostrar a localização precisa e o número de LRCs. A abordagem mostrou ângulos incorretos para cortes de estruturas teciduais complexas16. O outro método foi obter imagens 3D a partir de cortes seriados e realizar reconstruções pós-imagem. Esses passos foram imprecisos devido à distorção da imagem a partir de variações em cada corte seriado devido a cortes comprimidos ou esticados, resultando em informações ausentes16,17,18. O método também era trabalhoso e demorado.
Para facilitar a obtenção de imagens de montagem completa de LRCs, as amostras precisam ser esclarecidas enquanto a fluorescência é bem mantida. As técnicas atuais de limpeza de tecidos podem ser classificadas em três grandes categorias: técnicas de limpeza de tecidos à base de solventes orgânicos, técnicas de limpeza de tecidos à base de reagentes aquosos e técnicas de limpeza de tecidos à base de hidrogel17,19. O sistema solvente associado ao polietilenoglicol (PEG) (PEGASOS) foi recentemente desenvolvido. Essa abordagem torna quase todos os tipos de tecidos transparentes e preserva a fluorescência endógena, incluindo tecidos duros, como osso e dentes20. O método PEGASOS apresenta vantagens sobre outros métodos de limpeza tecidual, especialmente na limpeza de materiais dentários e ósseos. A maioria dos outros métodos poderia limpar apenas parcialmente tecidos duros, ter longos tempos de processamento ou exigir reagentes dispendiosos21. Além disso, o método PEGASOS pode preservar eficientemente a fluorescência endógena em relação a outros métodos.
Essa literatura nos levou a criar um novo método para o estudo celular. Combinamos as vantagens de detecção de LRCs da marcação de EdU com a imagem 3D de montagem completa mais superior de espécimes desembaraçados de tecido; amostras foram processadas com técnica avançada de limpeza tecidual do sistema solvente associado ao polietilenoglicol (PEG) (PEGASOS)15. A transparência do tecido duro nos permitiu reconstruir o sinal 3D da fluorescência das LRCs in vivo sem quebrar os dentes ou a mandíbula, criando uma maneira mais precisa de visualizar e quantificar as LRCs.
Neste estudo, fornecemos um guia inovador para visualização de LRCs no incisivo de camundongos. Fizemos uma abordagem visual 3D para determinar a localização e a quantidade de LRCs dentro do nicho de células-tronco incisivas de camundongos. Este projeto utilizou marcação com EdU, técnicas de limpeza tecidual PEGASOS e microscopia confocal. Nosso método de marcação de EdU as LRCs em tecido montado inteiro e o uso de um espécime limpo e transparente superam as limitações das lâminas seccionadas tradicionais e outros métodos desvantajosos de marcação de DNA. Assim, nossa técnica será adequada para estudos sobre homeostase de células-tronco que necessitem de detecção de LRCs, especialmente em tecidos duros. O protocolo pode ser igualmente vantajoso para aqueles que enfocam a homeostase de células-tronco em outros tecidos e órgãos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#215; Objective/NA 0.9</td>
			<td>Leica</td>
			<td>507702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bezyl benzoate (BB)</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>409529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane 9.0.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND cavity slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>BR475505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation Pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>23609-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Carboynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Miiilipore Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X Software</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehye</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGMMA500</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>447943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfa-Cyanine 3 Azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>D1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-10X</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-butanol (tB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>360538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing

O incisivo murino é um órgão que cresce continuamente ao longo da vida útil do rato. As células-tronco epiteliais e mesenquimais que residem nos tecidos proximais dos incisivos dão origem à progênie que se diferenciará em ameloblastos, odontoblastos e fibroblastos pulpar. Essas células são cruciais para suportar o turnover sustentado dos tecidos incisivos, tornando o incisivo murino um excelente modelo para estudar a homeostase de células-tronco adultas. Acredita-se que as células-tronco contenham células quiescentes de vida longa que podem ser marcadas por análogos de nucleotídeos, como 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU). As células retêm esse rótulo ao longo do tempo e, consequentemente, são chamadas de células de retenção de rótulo (LRCs). Abordagens para visualização de LRCs in vivo fornecem uma ferramenta robusta para monitorar a homeostase de células-tronco. Neste estudo, descrevemos um método para visualização e análise de LRCs. Nossa abordagem inovadora apresenta LRCs em incisivos de camundongos após limpeza do tecido e coloração de EdU de montagem total, seguida de microscopia confocal e reconstrução 3D (3D) com o software de imagem. Este método permite a aquisição de imagens 3D e quantificação não enviesada em comparação com a análise tradicional de LRCs em lâminas seccionadas.

Após a marcação da EdU e o processo de limpeza tecidual PEGASOS (Figura 2), a mandíbula transparente foi obtida como mostrado em nossa imagem (Figura 3B). Comparamos a amostra modificada com uma mandíbula normal sem processo de limpeza tecidual (Figura 3A). A mandíbula transparente (Figura 3B) com marcação de EdU foi submetida a imagens confocais. Focamos no ápice do incisivo mostrando o nicho ...

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Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing

O incisivo de camundongo contém valiosas células retentoras de marcação em seu nicho de células-tronco. Temos uma nova maneira de detectar e quantificar imparcialmente as células de retenção de marcação; nosso estudo utilizou marcação com EdU e uma abordagem de reconstrução 3D após a limpeza tecidual da mandíbula pelo PEGASOS.

Detecção e Quantificação de Células Retentoras de Marcação em Incisivos de Camundongos utilizando uma Abordagem de Reconstrução 3D após Limpeza de Tecidos

The murine incisor is an organ that grows continuously throughout the lifespan of the mouse. The epithelial and mesenchymal stem cells residing in the ...

Este protocolo descreve um método para visualização e quantificação in vivo e tridimensional das células marcadoras do nicho de células-tronco incisivas de camundongos. Esta técnica economiza tempo e é fácil de usar para novos alunos. As imagens 3D são adquiridas sem danificar o tecido.A quantificação 3D torna os dados mais confiáveis e precisos. Para começar, disseque as mandíbulas. Fixar as amostras em paraformaldeído a 4% e mantê-las à temperatura ambiente durante a noite.Após a incubação, remova os músculos das mandíbulas. Mergulhá-los em solução de ácido etilenodiaminotetracético 0,5 molar para descalcificar por quatro dias com uma troca diária de meio em um agitador de 37 graus Celsius. Descolorir as mandíbulas em 15 mililitros de solução de 25% Quadrol em um agitador de 37 graus Celsius por um dia para remover o heme sanguíneo restante.Para a coloração de 5-etinil-2-prime-desoxiuridina, prepare um coquetel de rotulagem de 5-etinil-2-prime-desoxiuridina, conforme mencionado no texto. Enxaguar as mandíbulas com um soro fisiológico tamponada com fosfato com Tween 20 ou PBST por 30 minutos em um agitador de 37 graus Celsius. Repetir o enxágue das mandíbulas com soro fisiológico tamponada com fosfato três vezes por três minutos cada, seguido de incubação em um coquetel recém-preparado com rotulagem de 5-etinil-2-prime-desoxiuridina em uma coqueteleira durante a noite.Repetir a lavagem com soro fisiológico tamponada com fosfato três vezes e realizar a deslipidação seriada colocando as mandíbulas nas soluções mencionadas no texto por seis horas cada em agitador de 37 graus Celsius. Desidratar as mandíbulas em solução de terc-butanol-polietilenoglicol, ou tB-PEG, por dois dias a 37 graus Celsius com a troca diária do meio. Após dois dias, limpar a mandíbula em meio de limpeza benzoato de benzila-polietilenoglicol contendo benzoato de benzila a 75%, metacrilato de polietilenoglicol-metil-éter médio de 500 ou PEG-MMA500 e quadro de 3% para obter correspondência do índice de refração e até que a transparência seja alcançada.Monte a mandíbula inteira limpa de tecido em lâminas de cavidade de marca no meio de limpeza benzoato de benzila-polietilenoglicol e cubra-a com lâminas de cobertura de vidro. No software de imagem confocal, defina os parâmetros de aquisição de imagem desejados. No painel para excitação fluorescente, ative o laser necessário para excitar os fluoróforos de forma otimizada.No painel para detecção de fluorescentes, mova o controle deslizante para selecionar os comprimentos de onda a serem medidos. Adicione uma gota de óleo de imersão com um índice de refração de 1,52 sobre a lamínula para corresponder ao índice de refração da tampa de vidro e da objetiva, e coloque a mandíbula montada no estágio do microscópio. Ligue as lâmpadas fluorescentes e escolha uma objetiva de ampliação apropriada para as regiões de interesse da imagem.No modo live scan, identifique o campo de visão para visualizar toda a região da mandíbula nas dimensões X e Y. Defina os parâmetros de aquisição do estágio Z superior e inferior que cobrem com precisão o volume do nicho de células-tronco no incisivo de camundongos. Use um tamanho de passo Z de dois micrômetros ou conforme sua necessidade.Adquira e salve arquivos de imagem Z-stack no formato lif. Use um conversor de arquivos de software de imagem para converter o arquivo de imagem Z-stack para o tipo de arquivo de formato nativo. No software de geração de imagens, clique no botão Arena e escolha Imagem.Selecione o arquivo lif original e escolha o arquivo mesclado. As imagens serão importadas para o software de imagem. Clique duas vezes no arquivo importado para abrir o conjunto de dados da imagem.No software de geração de imagens, visite o painel Ajuste de Vídeo. No painel Ajuste de Exibição, clique no nome do canal. Geralmente é rotulado como vermelho no modo padrão.Na janela Propriedades da imagem, clique na guia Cor mapeada. Na opção Arquivo da guia Cor, escolha Fluxo de Fogo e clique em OK. Selecione a cor da tela para distinguir a fluorescência de fundo e a fluorescência positiva da amostra. No lado superior esquerdo da tela, no painel Propriedades da cena, clique no ícone azul denominado Adicionar nova superfície.Desmarque o ícone Volume para remover a maior parte da fluorescência de fundo, resultando na fluorescência positiva nitidamente visível durante a segmentação manual. Em seguida, inicie a segmentação manual da região de interesse, ou ROI, clicando na guia Criar e selecionando a guia Ignorar criação automática, editar manualmente. No assistente de criação manual de superfície, clique na guia Contorno para escolher a orientação com base nas amostras para contornar o ROI facilmente.Em seguida, verifique se o menu de ponteiro no canto direito está no modo Selecionar. Ajuste a posição do corte para localizar a ROI no tecido. Como mencionado anteriormente, a maioria das fluorescências de fundo já foi removida.Clique no botão Desenhar e desenhe uma região de interesse provisória. Selecione a opção Visibilidade como Nenhum para evitar interferência de outras áreas além do ROI, seguido de segmentar a região de interesse fatia por fatia. Depois que o desenho do ROI for concluído, clique em Criar superfície para obter uma geometria 3D do ROI.Clique no botão Editar no assistente de criação de superfície manual e selecione Mascarar tudo. Na janela pop-out Canal de máscara, selecione Canal 1 nas opções de Seleção de canal. Depois, selecione Canal duplicado antes de aplicar a máscara.Nas configurações da máscara, selecione Constante dentro/fora e defina a superfície externa do voxel como zero. No painel Propriedades da cena, desmarque o objeto Surface e selecione o objeto Volume. No Ajuste de Vídeo, desmarque o canal vermelho original e selecione o canal vermelho mascarado.E ajuste as intensidades de cor para obter o ROI de fluorescência renderizado em 3D e rotulado positivamente desejado. Crie um novo objeto spot clicando no ícone Pontos para quantificar as células de retenção de rótulo renderizadas em 3D, criando pontos 3D que se sobrepõem comparativamente às células de retenção de rótulo renderizadas em 3D. Use as setas inferiores para mover-se entre as etapas no assistente de criação de ponto.Clique no botão Concluir e selecione o botão Estatística. Em seguida, selecione a guia Geral para localizar o valor do número total de pontos na imagem. Após marcação com 5-etinil-2-prime-desoxiuridina e o processo de limpeza tecidual do sistema solvente associado ao polietilenoglicol, obteve-se a mandíbula transparente.A amostra modificada foi comparada com uma mandíbula normal sem processo de limpeza tecidual, e uma mandíbula transparente com marcação com 5-etinil-2-prime-desoxiuridina foi submetida a imagens confocais. A seção óptica do incisivo mostrou células retentoras de marcação no nicho de células-tronco do ápice do incisivo no plano XY. A construção da imagem 3D de um ápice incisivo mostrou células-tronco quiescentes com retenção de marcação positiva para 5-etinil-2-prime-desoxiuridina tanto no nicho de células-tronco epiteliais quanto mesenquimais.As células positivas para 5-etinil-2-prime-desoxiuridina foram transferidas para pontos para quantificação que se sobrepunham comparativamente às células mesenquimais retentoras de marcação. As manchas criadas apenas para células retentoras de marcação mesenquimal e apenas para células retentoras de marcação epitelial são visíveis na imagem. A quantificação das células epitélias e mesenquimais retentoras também foi realizada.As propriedades de processamento e clareamento são as etapas mais importantes e devem ser otimizadas de acordo com o uso do tecido para obtenção de resultados satisfatórios. Este método também pode ser modificado para visualizar LRCs em nível de S2VGFP e no rastreamento de linhagens celulares para obter detalhes sobre a localização da progênie e sua quantificação ou contribuições.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Deficitária e Abordagem de ganho de função para Investigar celular precoce Destino Determinantes na pré-implantação embriões de camundongos

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Biologia do Desenvolvimento

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

A produção de células-tronco pluripotentes de rato amniótico células do líquido Usando um Sistema Transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Uma abordagem padronizada para a purificação multiespecífica de células germinais masculinas de mamíferos por dissociação mecânica do tecido e citometria de fluxo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontal Whole Mount: um protocolo de processamento e imagem de Novel para secções transversais grossas de tecidos tridimensionais

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Imuno-fluorescente rotulagem de microtúbulos e proteínas Centrosomal em tecido Intestinal Ex Vivo e 3D em Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Sistema tridimensional do ensaio da angiogênese usando spheroids da co-cultura dados forma pela colônia endothelial que dá forma a pilhas e às pilhas de haste mesenchymal

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Visualização e Análise de Artérias ariníngeos usando Imunohistoquímica de montagem integral e Reconstrução 3D

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Preparação de Pequenas Bibliotecas de RNA para Sequenciamento de Embriões de Camundongos Primitivos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...