Name: detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing
Uploaded: 2022-06-10T14:00:00
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Agradecemos a Meghann K. Holt por editar el manuscrito. Este estudio fue apoyado por las subvenciones DE026461 y DE028345 de los NIH / NIDCR y el financiamiento inicial de la Facultad de Odontología de Texas A&M al Dr. Xiaofang Wang.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Odontología de la Universidad de Texas A&M.
1. Preparación del cóctel de etiquetado EdU
<ol><li>Prepare las soluciones de caldo de cóctel como se describe en la Tabla 1.</li>
	<li>Prepare el cóctel de etiquetado EdU como se describe en la Tabla 1.</li>
</ol>2. Preparació...

<ol>
	<li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+incisor+through+gene+co-expression+analysis.">Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis.</a> eLife. 6, 24712 (2017).</li><li>Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+tooth+development,+growth,+repair,+and+regeneration.">Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).</li><li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quiescent+cell+population+replenishes+mesenchymal+stem+cells+to+drive+accelerated+growth+in+mouse+incisors.">A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors.</a> Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).</li><li>Biehs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMI1+represses+Ink4a/Arf+and+Hox+genes+to+regulate+stem+cells+in+the+rodent+incisor.">BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor.</a> Nature Cell Biology. 15 (7), 846-852 (2013).</li><li>Sharir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+pool+of+actively+cycling+progenitors+orchestrates+self-renewal+and+injury+repair+of+an+ectodermal+appendage.">A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage.</a> Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).</li><li>Terskikh, V. V., Vasiliev, A. V., Vorotelyak, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label+retaining+cells+and+cutaneous+stem+cells.">Label retaining cells and cutaneous stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 414-425 (2012).</li><li>de Miguel-Gomez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+the+endometrium:+From+the+discovery+of+adult+stem+cells+to+pre-clinical+models.">Stem cells and the endometrium: From the discovery of adult stem cells to pre-clinical models.</a> Cells. 10 (3), 595 (2021).</li><li>Ishikawa, Y., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+adult+stem+cells+in+murine+teeth+are+regulated+by+Shh+signaling.">Quiescent adult stem cells in murine teeth are regulated by Shh signaling.</a> Cell and Tissue Research. 369 (3), 497-512 (2017).</li><li>Chehrehasa, F., Meedeniya, A. C., Dwyer, P., Abrahamsen, G., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU,+a+new+thymidine+analogue+for+labelling+proliferating+cells+in+the+nervous+system.">EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 122-130 (2009).</li><li>Solius, G. M., Maltsev, D. I., Belousov, V. V., Podgorny, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+nucleotide+analogue-based+techniques+for+tracking+dividing+stem+cells:+An+overview.">Recent advances in nucleotide analogue-based techniques for tracking dividing stem cells: An overview.</a> The Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101345 (2021).</li><li>Ning, H., Albersen, M., Lin, G., Lue, T. F., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+EdU+labeling+on+mesenchymal+stem+cells.">Effects of EdU labeling on mesenchymal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (1), 57-63 (2013).</li><li>Lin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+tracking+of+mesenchymal+stromal+cells+with+EdU.">Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU.</a> Cytotherapy. 11 (7), 864-873 (2009).</li><li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Challen, G. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+expression+of+H2B-GFP+transgene+in+hematopoietic+stem+cells.">Promiscuous expression of H2B-GFP transgene in hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 3 (6), 2357 (2008).</li><li>Kopecky, B. J., Duncan, J. S., Elliott, K. L., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstructions+from+optical+sections+of+thick+mouse+inner+ears+using+confocal+microscopy.">Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).</li><li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+technique:+Recent+progress+and+biomedical+applications.">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing.">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+application+to+bone+and+dental+tissues.">Tissue clearing and its application to bone and dental tissues.</a> Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Fink, J., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cell+lineage+tracing+and+deep+tissue+imaging.">Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging.</a> BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).</li></ol>

Las dosis múltiples de inyecciones (BrdU, EdU) se utilizan generalmente en ratones neonatales en crecimiento para etiquetar las células proliferantes tanto como sea posible 1,6,13. El período de persecución es considerado un paso crítico con respecto a la tasa de renovación de los tejidos 6,13. El incisivo del ratón se renueva cada mes. Este rasgo permite a los in...

El incisivo de ratón en continuo crecimiento es un excelente modelo para estudiar células madre adultas1. Las células madre epiteliales (asa cervical labial y lingual) y mesenquimales (entre el asa cervical labial y lingual) que residen en el lado proximal del incisivo se diferencian en ameloblastos, odontoblastos y células de la pulpa dental. Este proceso único proporciona una fuente de células para compensar la pérdida y el recambio tisular2. Aunque varios marcadores de células madre como Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1, etc. se han identificado in vivo para los subconjuntos de células madre adultas en incisivos de ratón, son inadecuadas para representar las poblaciones de células madre cuando se usan solas 1,3,4,5. La visualización de células quiescentes de larga vida mediante el etiquetado y la retención de ADN análogo de nucleótidos podría proporcionar una detección imparcial para la mayoría de los subconjuntos de células madre adultas6. Además, este enfoque es útil entre muchos métodos de identificación de células madre7 para comprender el comportamiento celular y la homeostasis de las poblaciones de células madre dentales 3,8. Mientras que las células madre en división perderían su etiquetado de ADN después de una persecución considerable, las células madre quiescentes putativas conservan su etiqueta de ADN, considerándolas células de retención de etiquetas (LRC)6. El etiquetado y la retención del ADN por células madre no divididas marcarán y localizarán las células madre adultas putativas en sus nichos.
En los últimos años, el etiquetado análogo de timidina 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) reemplazó el engorroso, lento y de alta resolución método de marcado de ADN 3H-timidina incompatible con microscopía para ensayos de proliferación celular 6,9. En los últimos años, la técnica de etiquetado de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) se ha utilizado cada vez más sobre BrdU. Este patrón surgió debido a varias razones. En primer lugar, el método BrdU es lento y requiere mucha mano de obra. Las condiciones del usuario son variables, y es incapaz de preservar la ultraestructura en las muestras (debido a la desnaturalización del ADN). Del mismo modo, el método BrdU pierde la antigenicidad de las células, lo que lo hace ineficiente para análisis funcionales posteriores y ensayos, como los experimentos de colocalización y el trasplante de células madre in vivo 3,7,9,10,11,12. BrdU es también un teratógeno, que no es adecuado para el etiquetado de LRC en el desarrollo embrionario6. Además, el método BrdU es ineficiente cuando se utiliza en las muestras de montaje completo. Las desventajas son la baja penetración de anticuerpos en la parte profunda de las muestras o la necesidad de un largo período de incubación de anticuerpos para la penetración profunda13. El etiquetado EdU escapa a los pasos de desnaturalización de las muestras, preservando así la ultraestructura. Esta característica es ventajosa para los análisis funcionales posteriores, como los experimentos de colocalización y el trasplante de células madre11,12. Además, el etiquetado EdU es altamente sensible y rápido; La penetración de la muestra es alta debido al uso de azidas fluorescentes de absorción rápida y de menor tamaño para detectar etiquetas de EdU a través de una reacción de cicloadición catalizada por Cu(I) [3 + 2] (química "click")14.
Otro método de etiquetado de ADN cada vez más aplicado es el uso de ratones transgénicos modificados. Estos ratones expresan la proteína fluorescente verde histona 2B (H2B-GFP) controlada por un elemento regulador sensible a la tetraciclina 5,14. Después de alimentar a los ratones con tetraciclina durante un período de persecución de 4 semanas a 4 meses, la fluorescencia GFP disminuirá en las células cíclicas y solo las LRC retendrán la fluorescencia6. La ventaja de este método es que las LRC marcadas pueden aislarse y permanecer viables para cultivos celulares o análisis funcionales posteriores 6,7. Algunos estudios informaron un etiquetado inexacto de las células madre quiescentes cuando se persiguieron para su uso a largo plazo. Este resultado se debió a una expresión de fondo con fugas de la cepa H2B-GFP y no a la respuesta apropiada regulada por tetraciclina15.
Además, la mayoría de la literatura en el pasado utilizó la detección de LRC principalmente en diapositivas seccionadas, que son bidimensionales y a menudo erróneamente sesgadas al mostrar la ubicación precisa y el número de LRC. El enfoque mostró ángulos incorrectos para secciones de estructuras tisulares complejas16. El otro método era obtener imágenes 3D de secciones seriales y realizar reconstrucciones posteriores a la imagen. Estos pasos fueron inexactos debido a la distorsión de la imagen debido a las variaciones en cada sección serie debido a secciones comprimidas o estiradas, lo que resultó en información faltante16,17,18. El método también era laborioso y consumía mucho tiempo.
Para facilitar la obtención de imágenes de montaje completo de los LRC, las muestras deben ser claras mientras que la fluorescencia debe mantenerse bien. Las técnicas actuales de depuración tisular pueden clasificarse en tres grandes categorías: técnicas de depuración tisular a base de disolventes orgánicos, técnicas de depuración tisular a base de reactivos acuosos y técnicas de depuración tisular basadas en hidrogel17,19. El sistema de disolvente asociado al polietilenglicol (PEG) (PEGASOS) se ha desarrollado recientemente. Este enfoque hace que casi todos los tipos de tejidos sean transparentes y preserva la fluorescencia endógena, incluidos los tejidos duros como el hueso y los dientes20. El método PEGASOS tiene ventajas sobre otros métodos de limpieza de tejidos, especialmente en la limpieza de materiales dentales y óseos. La mayoría de los otros métodos sólo podían eliminar parcialmente los tejidos duros, tener largos tiempos de procesamiento o requerir reactivos costosos21. Además, el método PEGASOS puede preservar eficientemente la fluorescencia endógena sobre otros métodos.
Esta literatura nos llevó a crear un nuevo método para el estudio celular. Combinamos las ventajas de detección de LRC del etiquetado EdU con las imágenes 3D de montaje completo más superiores de muestras limpiadas con tejido; las muestras se procesaron con la técnica avanzada de limpieza de tejidos del sistema de disolvente asociado al polietilenglicol (PEG) (PEGASOS)15. La transparencia del tejido duro nos permitió reconstruir la señal 3D de la fluorescencia de las LRC in vivo sin romper los dientes o la mandíbula, creando una forma más precisa de visualizar y cuantificar las LRC.
En este estudio, proporcionamos una guía innovadora para visualizar las LRC en el incisivo del ratón. Hicimos un enfoque visual 3D para determinar la ubicación y cantidad de LRC dentro del nicho de células madre incisivas de ratón. Este proyecto utilizó el etiquetado EdU, técnicas de limpieza de tejidos PEGASOS y microscopía confocal. Nuestro método de etiquetado EdU de los LRC en tejido de montaje completo y el uso de una muestra transparente y transparente supera tanto las limitaciones de los portaobjetos seccionados tradicionales como otros métodos desventajosos de etiquetado de ADN. Por lo tanto, nuestra técnica será adecuada para estudios sobre homeostasis de células madre que requieran detección de LRC, especialmente en tejidos duros. El protocolo puede ser igualmente ventajoso para aquellos que se centran en la homeostasis de las células madre en otros tejidos y órganos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#215; Objective/NA 0.9</td>
			<td>Leica</td>
			<td>507702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bezyl benzoate (BB)</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>409529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane 9.0.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND cavity slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>BR475505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation Pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>23609-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Carboynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Miiilipore Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X Software</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehye</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGMMA500</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>447943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfa-Cyanine 3 Azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>D1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-10X</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-butanol (tB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>360538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing

El incisivo murino es un órgano que crece continuamente a lo largo de la vida útil del ratón. Las células madre epiteliales y mesenquimales que residen en los tejidos proximales de los incisivos dan lugar a una progenie que se diferenciará en ameloblastos, odontoblastos y fibroblastos pulpares. Estas células son cruciales para apoyar la renovación sostenida de los tejidos incisivos, lo que hace que el incisivo murino sea un excelente modelo para estudiar la homeostasis de las células madre adultas. Se cree que las células madre contienen células quiescentes de larga vida que pueden ser marcadas por análogos de nucleótidos como 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU). Las celdas conservan esta etiqueta a lo largo del tiempo y, en consecuencia, se denominan células de retención de etiquetas (LRC). Los enfoques para visualizar las LRC in vivo proporcionan una herramienta sólida para monitorear la homeostasis de las células madre. En este estudio, describimos un método para visualizar y analizar las LRC. Nuestro enfoque innovador presenta LRC en incisivos de ratón después de la limpieza del tejido y la tinción EdU de montaje completo, seguida de microscopía confocal y una reconstrucción tridimensional (3D) con el software de imágenes. Este método permite la adquisición de imágenes 3D y la cuantificación no sesgada en comparación con el análisis tradicional de LRC en diapositivas seccionadas.

Después del etiquetado de EdU y el proceso de limpieza de tejido PEGASOS (Figura 2), se obtuvo la mandíbula transparente como se muestra en nuestra imagen (Figura 3B). Comparamos la muestra modificada con una mandíbula normal sin un proceso de limpieza tisular (Figura 3A). La mandíbula transparente (Figura 3B) con etiquetado EdU se sometió a imágenes confocales. Nos centramos en el ápice incisivo...

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Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing

El incisivo del ratón contiene valiosas células que retienen etiquetas en su nicho de células madre. Tenemos una forma novedosa de detectar y cuantificar de manera imparcial las células que retienen la etiqueta; nuestro estudio utilizó el etiquetado EdU y un enfoque de reconstrucción 3D después de la limpieza del tejido PEGASOS de la mandíbula.

Detección y cuantificación de células que retienen etiquetas en incisivos de ratón utilizando un enfoque de reconstrucción 3D después de la limpieza de tejidos

The murine incisor is an organ that grows continuously throughout the lifespan of the mouse. The epithelial and mesenchymal stem cells residing in the ...

Este protocolo describe un método para la visualización y cuantificación in vivo y tridimensional de las células que retienen etiquetas del nicho de células madre incisivas de ratón. Esta técnica ahorra tiempo y es fácil de usar para los nuevos estudiantes. Las imágenes 3D se adquieren sin dañar el tejido.La cuantificación 3D hace que los datos sean más fiables y precisos. Para empezar, disecciona las mandíbulas. Fijar las muestras en paraformaldehído al 4% y mantenerlas a temperatura ambiente durante la noche.Después de la incubación, retire los músculos de las mandíbulas. Sumérjalos en una solución de ácido etilendiaminotetraacético 0,5 molares para descalcificar durante cuatro días con un cambio medio diario en una agitadora de 37 grados centígrados. Decolorar las mandíbulas en 15 mililitros de solución de 25% Quadrol en un agitador de 37 grados centígrados durante un día para eliminar el hemo sanguíneo restante.Para la tinción de 5-etinil-2-prime-desoxiuridina de montaje entero, prepare un cóctel fresco de etiquetado de 5-etinil-2-prime-desoxiuridina como se menciona en el texto. Enjuague las mandíbulas con una solución salina tamponada con fosfato con Tween 20 o PBST durante 30 minutos en una coctelera de 37 grados centígrados. Repita el enjuague de las mandíbulas con solución salina tamponada con fosfato tres veces durante tres minutos cada una, seguido de la incubación en un cóctel de etiquetado de 5-etinil-2-desoxiuridina recién preparado en una coctelera durante la noche.Repita el lavado salino tamponado con fosfato tres veces y realice la deslipidación en serie colocando las mandíbulas en las soluciones mencionadas en el texto durante seis horas cada una en un agitador de 37 grados centígrados. Deshidratar las mandíbulas en solución de terc-butanol-polietilenglicol, o tB-PEG, durante dos días a 37 grados centígrados con el cambio medio diario. Después de dos días, limpie la mandíbula en un medio de limpieza de benzoato de bencilo-polietilenglicol que contenga 75% de benzoato de bencilo, 22% de metacrilato de polietilenglicol-metil-éter promedio 500 o PEG-MMA500, y 3% de Quadrol para obtener la coincidencia del índice de refracción y hasta que se logre la transparencia.Monte la mandíbula entera despejada de tejido en portaobjetos de cavidad de marca en el medio de limpieza de benzoato de bencilo-polietilenglicol y cúbrala con portaobjetos de cubierta de vidrio. En el software de imágenes confocales, establezca los parámetros de adquisición de imágenes deseados. En el panel para excitación fluorescente, active el láser necesario para excitar los fluoróforos de manera óptima.En el panel para la detección de fluorescentes, mueva el control deslizante para seleccionar las longitudes de onda que se van a medir. Agregue una gota de aceite de inmersión con un índice de refracción de 1.52 en la parte superior del cubreobjetos para que coincida con el índice de refracción del cubreobjetos de vidrio y el objetivo, y coloque la mandíbula montada en la etapa del microscopio. Encienda las lámparas fluorescentes y elija un objetivo de ampliación adecuado para obtener imágenes de las regiones de interés.En el modo de escaneo en vivo, identifique el campo de visión para visualizar toda la región de la mandíbula en las dimensiones X e Y. Establezca los parámetros de adquisición de la etapa Z superior e inferior que cubran con precisión el volumen del nicho de células madre en el incisivo de los ratones. Utilice un tamaño de paso Z de dos micrómetros o según sus requisitos.Adquiera y guarde archivos de imagen Z-stack en formato lif. Utilice un convertidor de archivos de software de imágenes para convertir el archivo de imagen Z-stack al tipo de archivo de formato nativo. En el software de imágenes, haga clic en el botón Arena y, a continuación, seleccione Imagen.Seleccione el archivo lif original y elija el archivo combinado. Las imágenes se importarán al software de imágenes. Haga doble clic en el archivo importado para abrir el conjunto de datos de imagen.En el software de imágenes, visite el panel Ajuste de pantalla. En el panel Ajuste de pantalla, haga clic en el nombre del canal. Por lo general, se etiqueta como rojo en el modo predeterminado.En la ventana Propiedades de imagen, haga clic en la pestaña Color asignado. En la opción Color Tab File, elija Fire Flow y luego haga clic en OK. Seleccione el color de la pantalla para distinguir la fluorescencia de fondo y la fluorescencia positiva de la muestra. En la parte superior izquierda de la pantalla, en el panel Propiedades de escena, haga clic en el icono azul con la etiqueta Agregar nueva superficie.Anule la selección del icono Volumen para eliminar la mayor parte de la fluorescencia de fondo, lo que da como resultado la fluorescencia positiva claramente visible durante la segmentación manual. A continuación, inicie la segmentación manual de la región de interés, o ROI, haciendo clic en la pestaña Crear y seleccionando la pestaña Omitir creación automática, editar manualmente. En el asistente de creación manual de superficies, haga clic en la pestaña Contorno para elegir la orientación basada en las muestras para contornear el ROI fácilmente.A continuación, asegúrese de que el menú del puntero en la esquina derecha esté en modo Seleccionar. Ajuste la posición del corte para localizar el ROI en el tejido. Como se mencionó anteriormente, la mayor parte de la fluorescencia de fondo ya se ha eliminado.Haga clic en el botón Dibujar y dibuje una región tentativa de interés. Seleccione la opción Visibilidad en Ninguno para evitar interferencias de otras áreas que no sean ROI, seguido de segmentar la región de interés segmento por segmento. Una vez finalizado el dibujo del ROI, haga clic en Crear superficie para obtener una geometría 3D del ROI.Haga clic en el botón Editar del asistente de creación manual de superficies y seleccione Enmascarar todo. En la ventana emergente Canal de máscara, seleccione Canal 1 en las opciones de Selección de canales. Después, seleccione Duplicar canal antes de aplicar la máscara.En la configuración de la máscara, seleccione Constante interior/exterior y establezca la superficie exterior del vóxel en cero. En el panel Propiedades de escena, anule la selección del objeto Surface y seleccione el objeto Volumen. En Ajuste de pantalla, anule la selección del canal rojo original y seleccione el canal rojo enmascarado.Y ajuste las intensidades de color para obtener el ROI de fluorescencia deseado renderizado en 3D y etiquetado positivamente. Cree un nuevo objeto de spot haciendo clic en el icono Spots para cuantificar las celdas de retención de etiquetas renderizadas en 3D creando manchas 3D que se superponen de forma comparable con las celdas de retención de etiquetas renderizadas en 3D. Utilice las flechas inferiores para desplazarse entre los pasos del asistente para la creación de puntos.Haga clic en el botón Finalizar y seleccione el botón Estadística. A continuación, seleccione la pestaña General para encontrar el valor del número total de puntos en la imagen. Después del marcado de 5-etinil-2-prime-desoxiuridina y el proceso de limpieza tisular del sistema solvente asociado al polietilenglicol, se obtuvo la mandíbula transparente.La muestra modificada se comparó con una mandíbula normal sin un proceso de limpieza de tejido, y una mandíbula transparente con marcado de 5-etinil-2-prime-desoxiuridina se sometió a imágenes confocales. La sección óptica del incisivo mostró células que retienen la etiqueta en el nicho de células madre del ápice incisivo en el plano XY. La construcción de la imagen 3D de un ápice incisivo mostró células madre quiescentes positivas de retención de etiquetas 5-etinil-2-prime-desoxiuridina tanto en el nicho de células madre epiteliales como mesenquimales.Las células positivas para 5-etinil-2-prime-desoxiuridina se transfirieron a puntos para la cuantificación que se superpusieron de manera comparable con las células mesenquimales que retienen la etiqueta. Las manchas creadas solo para las células mesenquimales que retienen etiquetas y solo para las células epiteliales que retienen etiquetas son visibles en la imagen. También se realizó la cuantificación de las células que retienen el marcador epitelial y mesenquimal.Las propiedades para el procesamiento y la limpieza son los pasos más importantes y deben optimizarse de acuerdo con el uso del tejido para obtener resultados satisfactorios. Este método también se puede modificar para visualizar LRC de nivel S2VGFP y en el rastreo de linaje celular para obtener detalles sobre la ubicación de la progenie y su cuantificación o contribuciones.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Deficitaria y en el enfoque de ganancia de función de investigar la célula destino temprano Determinantes de preimplantación embriones de ratón

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Investigación

Biología del Desarrollo

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

La producción de células madre pluripotentes a partir de células de ratón amniótico líquido mediante un sistema de transposón

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Un enfoque estandarizado para la purificación multiespecífica de células germinales masculinas de mamíferos por disociación mecánica de tejidos y citometría de flujo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Imágenes en vivo de la fusión secundaria del paladar del ratón

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Montaje entero horizontal: un nuevo protocolo de procesamiento e imágenes para tejidos gruesos y tridimensionales Secciones transversales de la piel

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Inmuno-fluorescente etiquetado de microtúbulos y proteínas centrosómicas en tejido Intestinal Ex Vivo y 3D In Vitro Intestinal organitas

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

En la generación de Vitro del Somite derivados humanos inducida por células madre pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Sistema de ensayo de angiogénesis tridimensional utilizando esferoides de cocultura formados por células formadoras de colonias endoteliales y células madre mesenquimales

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Visualización y análisis de arterias de arco faríngeo utilizando inmunohistoquímica de montaje completo y reconstrucción 3D

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Preparación de pequeñas bibliotecas de ARN para la secuenciación de embriones de ratón tempranos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...