Name: detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing
Uploaded: 2022-06-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing at JoVE.com

Vi tackar Meghann K. Holt för redigeringen av manuskriptet. Denna studie stöddes av NIH / NIDCR-bidrag DE026461 och DE028345 och startfinansieringen från Texas A &M School of Dentistry till Dr. Xiaofang Wang.

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) för Texas A&M University College of Dentistry.
1. Beredning av EdU-märkningscocktail
<ol><li>Bered cocktaillösningarna enligt beskrivningen i tabell 1.</li>
	<li>Förbered EdU-märkningscocktailen enligt beskrivningen i tabell 1.</li>
</ol>2. Beredning av möss och EdU-lösning
<ol><li>Förbered Ed...

<ol>
	<li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+incisor+through+gene+co-expression+analysis.">Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis.</a> eLife. 6, 24712 (2017).</li><li>Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+tooth+development,+growth,+repair,+and+regeneration.">Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).</li><li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quiescent+cell+population+replenishes+mesenchymal+stem+cells+to+drive+accelerated+growth+in+mouse+incisors.">A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors.</a> Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).</li><li>Biehs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMI1+represses+Ink4a/Arf+and+Hox+genes+to+regulate+stem+cells+in+the+rodent+incisor.">BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor.</a> Nature Cell Biology. 15 (7), 846-852 (2013).</li><li>Sharir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+pool+of+actively+cycling+progenitors+orchestrates+self-renewal+and+injury+repair+of+an+ectodermal+appendage.">A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage.</a> Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).</li><li>Terskikh, V. V., Vasiliev, A. V., Vorotelyak, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label+retaining+cells+and+cutaneous+stem+cells.">Label retaining cells and cutaneous stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 414-425 (2012).</li><li>de Miguel-Gomez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+the+endometrium:+From+the+discovery+of+adult+stem+cells+to+pre-clinical+models.">Stem cells and the endometrium: From the discovery of adult stem cells to pre-clinical models.</a> Cells. 10 (3), 595 (2021).</li><li>Ishikawa, Y., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+adult+stem+cells+in+murine+teeth+are+regulated+by+Shh+signaling.">Quiescent adult stem cells in murine teeth are regulated by Shh signaling.</a> Cell and Tissue Research. 369 (3), 497-512 (2017).</li><li>Chehrehasa, F., Meedeniya, A. C., Dwyer, P., Abrahamsen, G., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU,+a+new+thymidine+analogue+for+labelling+proliferating+cells+in+the+nervous+system.">EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 122-130 (2009).</li><li>Solius, G. M., Maltsev, D. I., Belousov, V. V., Podgorny, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+nucleotide+analogue-based+techniques+for+tracking+dividing+stem+cells:+An+overview.">Recent advances in nucleotide analogue-based techniques for tracking dividing stem cells: An overview.</a> The Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101345 (2021).</li><li>Ning, H., Albersen, M., Lin, G., Lue, T. F., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+EdU+labeling+on+mesenchymal+stem+cells.">Effects of EdU labeling on mesenchymal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (1), 57-63 (2013).</li><li>Lin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+tracking+of+mesenchymal+stromal+cells+with+EdU.">Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU.</a> Cytotherapy. 11 (7), 864-873 (2009).</li><li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Challen, G. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+expression+of+H2B-GFP+transgene+in+hematopoietic+stem+cells.">Promiscuous expression of H2B-GFP transgene in hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 3 (6), 2357 (2008).</li><li>Kopecky, B. J., Duncan, J. S., Elliott, K. L., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstructions+from+optical+sections+of+thick+mouse+inner+ears+using+confocal+microscopy.">Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).</li><li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+technique:+Recent+progress+and+biomedical+applications.">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing.">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+application+to+bone+and+dental+tissues.">Tissue clearing and its application to bone and dental tissues.</a> Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Fink, J., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cell+lineage+tracing+and+deep+tissue+imaging.">Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging.</a> BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).</li></ol>

Flera doser av injektioner (BrdU, EdU) används vanligtvis på växande neonatala möss för att märka prolifererande celler så mycket som möjligt 1,6,13. Jaktperioden anses vara ett kritiskt steg när det gäller förnyelsehastigheten för vävnader 6,13. Mussnittet förnyar sig varje månad. Denna egenskap gör det möjligt för forskare att ställa in jaktperioden ...

Den kontinuerligt växande mussnittet är en utmärkt modell för att studera vuxna stamceller1. Epiteliala (labial och lingual cervikal slinga) och mesenkymala stamceller (mellan den labiala och linguala cervikala slingan) som ligger på den proximala sidan av snittet differentieras till ameloblaster, odontoblaster och tandmassaceller. Denna unika process ger en källa till celler för kompensation av vävnadsförlust och omsättning2. Även om flera stamcellsmarkörer som Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1, etc. har identifierats in vivo för undergrupper av vuxna stamceller i musframtänder, är de otillräckliga för att representera stamcellspopulationerna när de används ensamma 1,3,4,5. Visualisering av långlivade vilande celler genom nukleotidanalog DNA-märkning och retention kan ge opartisk detektion för de flesta undergrupper av vuxna stamceller6. Vidare är detta tillvägagångssätt användbart bland många stamcellsidentifieringsmetoder7 för att förstå cellbeteende och homeostas hos dentala stamcellspopulationer 3,8. Medan de delande stamcellerna skulle förlora sin DNA-märkning efter en betydande jakt, behåller de förmodade vilande stamcellerna sin DNA-etikett och anser att de är etiketthållande celler (LRC)6. DNA-märkning och retention av icke-delande stamceller kommer att markera och lokalisera de förmodade vuxna stamcellerna i sina nischer.
Under de senaste åren har tymidinanalog 5-brom-2′-deoxiuridin (BrdU) märkning ersatt den besvärliga, tidskrävande och högupplösta mikroskopiinkompatibla 3H-tymidin-DNA-märkningsmetoden för cellproliferationsanalyser 6,9. Under de senaste åren har märkningstekniken 5-etynyl-2'-deoxiuridin (EdU) använts alltmer över BrdU. Detta mönster uppstod på grund av flera skäl. För det första är BrdU-metoden långsam och arbetsintensiv. Användarvillkoren är varierande och det går inte att bevara ultrastrukturen i prover (på grund av DNA-denaturering). På samma sätt förlorar BrdU-metoden cellernas antigenicitet, vilket gör den ineffektiv för nedströms funktionella analyser och analyser såsom samlokaliseringsexperimenten och in vivo stamcellstransplantation 3,7,9,10,11,12. BrdU är också en teratogen, som inte är lämplig för märkning av LRC i embryonal utveckling6. BrdU-metoden är också ineffektiv när den används i helmonterade prover. Nackdelarna är låg penetration av antikroppar i den djupa delen av proverna eller kravet på en lång antikroppsinkubationsperiod för djup penetration13. EdU-märkning undgår stegen för denaturering av prover, vilket bevarar ultrastrukturen. Denna funktion är fördelaktig för nedströms funktionella analyser såsom samlokaliseringsexperiment och stamcellstransplantation11,12. Dessutom är EdU-märkning mycket känslig och snabb; provpenetrationen är hög på grund av användningen av snabbt absorberade och mindre fluorescerande azider för detektering av EdU-etiketter genom en Cu (I) -katalyserad [3 + 2] cykloadditionsreaktion ("klick" kemi)14.
En annan alltmer tillämpad DNA-märkningsmetod är användningen av konstruerade transgena möss. Dessa möss uttrycker histon 2B grönt fluorescerande protein (H2B-GFP) som styrs av ett tetracyklinresponsivt regulatorelement 5,14. Efter att ha matat möss med tetracyklinsoppa / vatten under en 4-veckors till 4-månaders jaktperiod kommer GFP-fluorescensen att minska i cykelceller och endast LRC behåller fluorescensen6. Fördelen med denna metod är att de märkta LRC:erna kan isoleras och förbli livskraftiga för cellodling eller nedströms funktionella analyser 6,7. Vissa studier rapporterade felaktig märkning av vilande stamceller när de jagas för långvarig användning. Detta resultat berodde på ett läckande bakgrundsuttryck från H2B-GFP-stammen och inte det lämpliga tetracyklinreglerade svaret15.
Dessutom använde de flesta litteratur tidigare LRC-detektering huvudsakligen på snittade objektglas, som är tvådimensionella och ofta felaktigt partiska när det gäller att visa den exakta platsen och antalet LRC. Tillvägagångssättet visade felaktiga vinklar för sektioner av komplexa vävnadsstrukturer16. Den andra metoden var att hämta 3D-bilder från seriella sektioner och utföra rekonstruktioner efter bild. Dessa steg var felaktiga på grund av bildförvrängning från variationer i varje seriell sektion på grund av komprimerade eller utsträckta sektioner, vilket resulterade i saknad information16,17,18. Metoden var också mödosam och tidskrävande.
För att underlätta helmonterad avbildning av LRC måste prover klargöras medan fluorescensen bibehålls väl. Nuvarande vävnadsrensningstekniker kan klassificeras i tre huvudkategorier: organiska lösningsmedelsbaserade vävnadsrensningstekniker, vattenhaltiga reagensbaserade vävnadsrensningstekniker och hydrogelbaserade vävnadsrensningstekniker17,19. PEGASOS (polyetylenglykol) associerade lösningsmedelssystem (PEGASOS) har nyligen utvecklats. Detta tillvägagångssätt gör nästan alla typer av vävnader transparenta och bevarar endogen fluorescens, inklusive hårda vävnader som ben och tänder20. PEGASOS-metoden har fördelar jämfört med andra vävnadsrensningsmetoder, särskilt vid rensning av tand- och benmaterial. De flesta andra metoder kan endast delvis rensa hårda vävnader, ha långa bearbetningstider eller kräva kostsamma reagens21. PEGASOS-metoden kan också effektivt bevara endogen fluorescens över andra metoder.
Denna litteratur ledde oss till att skapa en ny metod för cellstudier. Vi kombinerade LRC: s detektionsfördelar med EdU-märkning med den mest överlägsna 3D-helmonterade avbildningen av vävnadsrensade prover; Proverna bearbetades med PEGASOS (Advanced Polyethylene glycol (PEG)-associated solvent system (PEGASOS) vävnadsrensningsteknik15. Hårdvävnadstransparens gjorde det möjligt för oss att rekonstruera 3D-signalen för LRC-fluorescens in vivo utan att bryta tänderna eller underkäken, vilket skapade ett mer exakt sätt att visualisera och kvantifiera LRC.
I denna studie tillhandahåller vi en innovativ guide för att visualisera LRC i musframtänderna. Vi gjorde ett 3D-visuellt tillvägagångssätt för att bestämma platsen och kvantiteten av LRC inom musframtändernas stamcellsnisch. Detta projekt använde EdU-märkning, PEGASOS vävnadsrensningstekniker och konfokalmikroskopi. Vår metod för EdU-märkning av LRC på helmonterad vävnad och användningen av ett rensat och transparent prov övervinner både begränsningarna hos traditionella snittade glas och andra ofördelaktiga DNA-märkningsmetoder. Således kommer vår teknik att vara lämplig för studier på stamcellshomeostas som kräver LRC-detektion, särskilt på hårda vävnader. Protokollet kan vara lika fördelaktigt för dem som fokuserar på stamcellshomeostas i andra vävnader och organ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#215; Objective/NA 0.9</td>
			<td>Leica</td>
			<td>507702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bezyl benzoate (BB)</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>409529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane 9.0.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND cavity slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>BR475505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation Pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>23609-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Carboynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Miiilipore Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X Software</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehye</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGMMA500</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>447943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfa-Cyanine 3 Azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>D1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-10X</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-butanol (tB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>360538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing

Murina snittet är ett organ som växer kontinuerligt under musens livslängd. Epitel- och mesenkymala stamceller som finns i framtändernas proximala vävnader ger upphov till avkomma som kommer att differentieras till ameloblaster, odontoblaster och massafibroblaster. Dessa celler är avgörande för att stödja den fortsatta omsättningen av framtänder, vilket gör murina framtänder till en utmärkt modell för att studera homeostas hos vuxna stamceller. Stamceller antas innehålla långlivade vilande celler som kan märkas av nukleotidanaloger såsom 5-etynyl-2'-deoxiuridin (EdU). Cellerna behåller denna etikett över tid och kallas följaktligen etiketthållande celler (LRC). Metoder för att visualisera LRC in vivo ger ett robust verktyg för övervakning av stamcellshomeostas. I denna studie beskrev vi en metod för att visualisera och analysera LRC. Vårt innovativa tillvägagångssätt har LRC i musframtänder efter vävnadsrensning och helmonterad EdU-färgning följt av konfokalmikroskopi och en 3-dimensionell (3D) rekonstruktion med bildprogramvaran. Denna metod möjliggör 3D-bildinsamling och icke-partisk kvantifiering jämfört med traditionell LRC-analys på snittade objektglas.

Efter EdU-märkning och PEGASOS vävnadsrensningsprocess (figur 2) erhölls den transparenta underkäken som visas i vår bild (figur 3B). Vi jämförde det modifierade provet med en normal underkäke utan vävnadsrensningsprocess (figur 3A). Den transparenta underkäken (figur 3B) med EdU-märkning utsattes för konfokal avbildning. Vi fokuserade på framkanten som visar stamcellsnischen som visas i (<...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing at JoVE.com

Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing

Mussnittet innehåller värdefulla etiketthållande celler i sin stamcellsnisch. Vi har ett nytt sätt att opartiskt upptäcka och kvantifiera de etiketthållande cellerna; vår studie använde EdU-märkning och en 3D-rekonstruktionsmetod efter PEGASOS vävnadsrensning av underkäken.

Detektion och kvantifiering av etiketthållande celler i musframtänder med hjälp av en 3D-rekonstruktionsmetod efter vävnadsrensning

The murine incisor is an organ that grows continuously throughout the lifespan of the mouse. The epithelial and mesenchymal stem cells residing in the ...

Detta protokoll beskriver en metod för in vivo och tredimensionell visualisering och kvantifiering av de etiketthållande cellerna i musframtändernas stamcellsnisch. Denna teknik är tidsbesparande och användarvänlig för nya elever. 3D-bilderna förvärvas utan att skada vävnaden.3D-kvantifieringen gör data mer tillförlitliga och korrekta. Börja med att dissekera mandiblarna. Fixera proverna i 4% paraformaldehyd och förvara dem vid rumstemperatur över natten.Efter inkubationen, ta bort musklerna från mandiblarna. Sänk ner dem i 0,5-molar etylendiamintetraättiksyralösning för att avkalka i fyra dagar med en daglig medelförändring på en 37-graders Celsius-shaker. Avfärga mandiblarna i 15 ml 25% Quadrol-lösning på en 37-graders Celsius-shaker under en dag för att ta bort det återstående blodhemmet.För färgning av hela berget 5-etynyl-2-prime-deoxyuridin, förbered en färsk 5-etynyl-2-prime-deoxyuridin-märkningscocktail som nämns i texten. Skölj mandiblarna med en fosfatbuffrad saltlösning med Tween 20 eller PBST i 30 minuter på en 37-graders Celsius-shaker. Skölj underkäken med fosfatbuffrad saltlösning tre gånger i tre minuter vardera, följt av inkubation i en nyberedd 5-etynyl-2-prime-deoxiuridin-märkningscocktail på en shaker över natten.Upprepa den fosfatbuffrade saltlösningstvätten tre gånger och utför seriell avlipidering genom att placera mandiblarna i lösningarna som nämns i texten i sex timmar vardera i 37-graders Celsius-skakare. Dehydrera mandiblarna i tert-butanol-polyetylenglykol, eller tB-PEG, lösning i två dagar vid 37 grader Celsius med den dagliga medieförändringen. Efter två dagar, rensa underkäken i bensylbensoat-polyetylenglykolrensningsmedium innehållande 75% bensylbensoat, 22% polyetylenglykol-metyletermetakrylatgenomsnitt 500 eller PEG-MMA500 och 3% Quadrol för att erhålla brytningsindexmatchning och tills transparens uppnås.Montera den vävnadsrensade hela underkäken på märkeshålans glasrutor i bensylbensoat-polyetylenglykolrensningsmediet och täck det med glaslock. Ställ in önskade bildinsamlingsparametrar i programvaran för konfokal bildbehandling. I panelen för fluorescerande excitation, aktivera den laser som krävs för att excitera fluoroforer optimalt.I panelen för fluorescerande detektering flyttar du skjutreglaget för att välja de våglängder som ska mätas. Tillsätt en droppe doppolja med ett brytningsindex på 1,52 ovanpå täckglaset för att matcha brytningsindexet för glastäcket och objektivet och placera den monterade underkäken på mikroskopsteget. Slå på lysrören och välj ett lämpligt förstoringsmål för att avbilda intressanta områden.I direktsökningsläget identifierar du synfältet för att visualisera hela underkäkens område i X- och Y-dimensionerna. Ställ in de övre och nedre Z-stegsförvärvsparametrarna som exakt täcker volymen av stamcellsnischen i mösssnittet. Använd en Z-stegstorlek på två mikrometer eller enligt dina krav.Hämta och spara Z-stack-bildfiler i lif-format. Använd en bildprogramvarufilkonverterare för att konvertera Z-stack-bildfilen till filtypen i ursprungligt format. I bildhanteringsprogrammet klickar du på knappen Arena och väljer Bild.Markera den ursprungliga lif-filen och välj den sammanslagna filen. Bilderna importeras till bildhanteringsprogrammet. Dubbelklicka på den importerade filen för att öppna bilddatauppsättningen.Öppna panelen Skärmjustering i bildprogramvaran. På panelen Skärmjustering klickar du på kanalens namn. Det är vanligtvis märkt som rött i standardläge.I fönstret Bildegenskaper klickar du på fliken Mappad färg. I alternativet Färgflikfil väljer du Brandflöde och klickar sedan på OK. Välj visningsfärg för att skilja bakgrundsfluorescensen och den positiva fluorescensen från provet. På skärmens övre vänstra sida, i rutan Scenegenskaper, klickar du på den blå ikonen märkt Lägg till ny yta.Avmarkera volymikonen för att ta bort det mesta av bakgrundsfluorescensen, vilket resulterar i att den positiva fluorescensen syns tydligt under manuell segmentering. Starta sedan den manuella segmenteringen av regionen av intresse, eller ROI, genom att klicka på fliken Skapa och välja fliken Hoppa över automatisk skapande, redigera manuellt. I guiden för att skapa ytor klickar du på fliken Kontur för att välja orientering baserat på exemplen för att enkelt konturera ROI.Se sedan till att pekarmenyn i det högra hörnet är i Select-läge. Justera segmentpositionen för att hitta avkastningen i vävnaden. Som tidigare nämnts är de flesta bakgrundsfluorescensen redan borttagna.Klicka på knappen Rita och rita en preliminär region av intresse. Välj alternativet Synlighet till Ingen för att undvika störningar från andra områden än ROI, följt av segmentering av intresseområdet segment för segment. När ROI-ritningen är klar klickar du på Skapa yta för att få en 3D-geometri för avkastningen.Klicka på knappen Redigera i guiden för att skapa ytor manuellt och välj Maskera alla. I fönstret Maskera kanal väljer du Kanal 1 i alternativen för kanalval. Välj sedan Duplicera kanal innan du applicerar masken.I maskinställningarna väljer du Konstant insida/utsida och ställer in voxelytans yta på noll. I fönstret Egenskaper för scen avmarkerar du Surface-objektet och markerar volymobjektet. I Visningsjustering avmarkerar du den ursprungliga röda kanalen och väljer kanalen Maskerad röd.Och justera färgintensiteterna för att få önskad 3D-renderad och positivt märkt fluorescens-ROI. Skapa ett nytt dekorobjekt genom att klicka på ikonen Fläckar för att kvantifiera de 3D-renderade etiketthållande cellerna genom att skapa 3D-dekorpunkter som överlappar varandra på ett jämförbart sätt med celler som behåller 3D-etiketter. Använd de nedre pilarna för att flytta mellan stegen i guiden för att skapa platser.Klicka på knappen Slutför och välj knappen Statistik. Välj sedan fliken Övergripande för att hitta värdet för det totala antalet fläckar i bilden. Efter 5-etynyl-2-prime-deoxyuridinmärkning och vävnadsrensningsprocessen för polyetylenglykolassocierat lösningsmedelssystem erhölls den transparenta underkäken.Det modifierade provet jämfördes med en normal underkäke utan vävnadsrensningsprocess, och en transparent underkäke med 5-etynyl-2-prime-deoxyuridin-märkning utsattes för konfokal avbildning. Den optiska sektionen av snittet visade etiketthållande celler i stamcellsnischen i snittspetsen i XY-planet. 3D-bildkonstruktionen av en framtand topp visade 5-etynyl-2-prime-deoxyuridin positiva etiketthållande vilande stamceller i både epitelial och mesenkymal stamcellsnisch.De 5-etynyl-2-prime-deoxiuridinpositiva cellerna överfördes till fläckar för kvantifiering som jämförbart överlappade med de mesenkymala etiketthållande cellerna. De fläckar som skapas endast för mesenkymala etiketthållande celler och endast för epiteliala etiketthållande celler är synliga i bilden. Kvantifiering av epiteliala och mesenkymala etiketthållande celler utfördes också.Egenskaper för bearbetning och rensning är de viktigaste stegen och bör optimeras enligt vävnadens användning för att uppnå tillfredsställande resultat. Denna metod kan också modifieras för att visualisera LRC på S2VGFP-nivå och i cellinjespårning för att få detaljer om avkommans plats och deras kvantifiering eller bidrag.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Förlust- och Gain-of-funktionsansatsen att undersöka tidiga Cell Fate bestämmelse i preimplantatorisk musembryon

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produktionen av pluripotenta stamceller från mus fostervatten celler med användning av en transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

En standardiserad tillvägagångssätt för multispecies Rening av mammaliska manliga cellceller genom mekanisk vävnadsdissociation och flödescytometri

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontell helmontering: Ett nytt bearbetnings- och bildprotokoll för tjocka, tredimensionella vävnads tvärsnitt av huden

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescerande märkning av mikrotubuli och Centrosomal proteiner i Ex Vivo Tarmvävnaden och 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Tredimensionellt Angiogeneshämningssystem med hjälp av Samkulturspheroider som bildas av Endotelkolonibildande celler och mesenkymala stamceller

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Visualisering och analys av faryngala Arch Artärer med hela berget Immunohistochemistry och 3D-rekonstruktion

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Beredning av små RNA-bibliotek för sekvensering från tidiga musembryon

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...