Name: detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing
Uploaded: 2022-06-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing at JoVE.com

Meghann K. Holt'a makaleyi düzenlediği için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH / NIDCR hibeleri DE026461 ve DE028345 ve Texas A &M Diş Hekimliği Fakültesi'nden Dr. Xiaofang Wang'a başlangıç fonu ile desteklenmiştir.

Burada açıklanan tüm yöntemler, Texas A&M Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi için Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. EdU etiketleme kokteylinin hazırlanması
<ol><li>Kokteyl stok çözümlerini Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın.</li>
	<li>EdU etiketleme kokteylini Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın.</li>
</ol>2. Farelerin v...

<ol>
	<li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+incisor+through+gene+co-expression+analysis.">Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis.</a> eLife. 6, 24712 (2017).</li><li>Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+tooth+development,+growth,+repair,+and+regeneration.">Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).</li><li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quiescent+cell+population+replenishes+mesenchymal+stem+cells+to+drive+accelerated+growth+in+mouse+incisors.">A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors.</a> Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).</li><li>Biehs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMI1+represses+Ink4a/Arf+and+Hox+genes+to+regulate+stem+cells+in+the+rodent+incisor.">BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor.</a> Nature Cell Biology. 15 (7), 846-852 (2013).</li><li>Sharir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+pool+of+actively+cycling+progenitors+orchestrates+self-renewal+and+injury+repair+of+an+ectodermal+appendage.">A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage.</a> Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).</li><li>Terskikh, V. V., Vasiliev, A. V., Vorotelyak, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label+retaining+cells+and+cutaneous+stem+cells.">Label retaining cells and cutaneous stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 414-425 (2012).</li><li>de Miguel-Gomez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+the+endometrium:+From+the+discovery+of+adult+stem+cells+to+pre-clinical+models.">Stem cells and the endometrium: From the discovery of adult stem cells to pre-clinical models.</a> Cells. 10 (3), 595 (2021).</li><li>Ishikawa, Y., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+adult+stem+cells+in+murine+teeth+are+regulated+by+Shh+signaling.">Quiescent adult stem cells in murine teeth are regulated by Shh signaling.</a> Cell and Tissue Research. 369 (3), 497-512 (2017).</li><li>Chehrehasa, F., Meedeniya, A. C., Dwyer, P., Abrahamsen, G., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU,+a+new+thymidine+analogue+for+labelling+proliferating+cells+in+the+nervous+system.">EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 122-130 (2009).</li><li>Solius, G. M., Maltsev, D. I., Belousov, V. V., Podgorny, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+nucleotide+analogue-based+techniques+for+tracking+dividing+stem+cells:+An+overview.">Recent advances in nucleotide analogue-based techniques for tracking dividing stem cells: An overview.</a> The Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101345 (2021).</li><li>Ning, H., Albersen, M., Lin, G., Lue, T. F., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+EdU+labeling+on+mesenchymal+stem+cells.">Effects of EdU labeling on mesenchymal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (1), 57-63 (2013).</li><li>Lin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+tracking+of+mesenchymal+stromal+cells+with+EdU.">Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU.</a> Cytotherapy. 11 (7), 864-873 (2009).</li><li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Challen, G. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+expression+of+H2B-GFP+transgene+in+hematopoietic+stem+cells.">Promiscuous expression of H2B-GFP transgene in hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 3 (6), 2357 (2008).</li><li>Kopecky, B. J., Duncan, J. S., Elliott, K. L., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstructions+from+optical+sections+of+thick+mouse+inner+ears+using+confocal+microscopy.">Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).</li><li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+technique:+Recent+progress+and+biomedical+applications.">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing.">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+application+to+bone+and+dental+tissues.">Tissue clearing and its application to bone and dental tissues.</a> Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Fink, J., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cell+lineage+tracing+and+deep+tissue+imaging.">Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging.</a> BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).</li></ol>

Çoklu enjeksiyon dozları (BrdU, EdU) genellikle çoğalan hücreleri mümkün olduğunca etiketlemek için büyüyen yenidoğan farelerde kullanılır 1,6,13. Kovalama süresi, dokuların yenilenme hızı açısından kritik bir adım olarak kabul edilir 6,13. Fare kesici ucu her ay kendini yeniler. Bu özellik, araştırmacıların kovalama süresini 4 hafta<sup class...

Sürekli büyüyen fare kesici ucu, yetişkin kök hücreleri incelemek için mükemmel bir modeldir1. Kesici dişin proksimal tarafında bulunan epitel (labial ve lingual servikal loop) ve mezenkimal kök hücreler (labial ve lingual servikal loop arasında) ameloblastlara, odontoblastlara ve diş pulpası hücrelerine farklılaşır. Bu eşsiz süreç, doku kaybının ve cironun telafisi için bir hücre kaynağı sağlar2. Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1 gibi birkaç kök hücre belirteci olmasına rağmen. fare kesici dişlerinde yetişkin kök hücrelerin alt kümeleri için in vivo olarak tanımlanmıştır, tek başına kullanıldığında kök hücre popülasyonlarını temsil etmede yetersizdir 1,3,4,5. Uzun ömürlü sessiz hücrelerin nükleotid analog DNA etiketleme ve retansiyonu ile görselleştirilmesi, yetişkin kök hücrelerin çoğu alt kümesi için tarafsız tespit sağlayabilir6. Ayrıca, bu yaklaşım birçok kök hücre tanımlama yöntemiarasında yararlıdır 7 hücre davranışını ve diş kök hücre popülasyonlarının homeostazını anlamak için 3,8. Bölünen kök hücreler kayda değer bir kovalamacadan sonra DNA etiketlerini kaybederken, varsayılan sessiz kök hücreler DNA etiketlerini korur ve onları etiket tutucu hücreler (LRC'ler) olarak kabul eder6. Bölünmeyen kök hücreler tarafından DNA etiketlemesi ve tutulması, varsayılan yetişkin kök hücreleri nişlerinde işaretleyecek ve bulacaktır.
Son yıllarda, timidin analog 5-bromo-2′-deoksiüridin (BrdU) etiketlemesi, hücre proliferasyon testleri 6,9 için hantal, zaman alıcı ve yüksek çözünürlüklü mikroskopi uyumsuz 3H-timidin DNA etiketleme yönteminin yerini almıştır. Son yıllarda, 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) etiketleme tekniği BrdU üzerinde giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu model birkaç nedenden dolayı ortaya çıkmıştır. İlk olarak, BrdU yöntemi yavaş ve emek yoğundur. Kullanıcı koşulları değişkendir ve örneklerdeki ultrayapıyı koruyamaz (DNA denatürasyonu nedeniyle). Benzer şekilde, BrdU yöntemi hücrelerin antijenitesini kaybeder, böylece ko-lokalizasyon deneyleri ve in vivo kök hücrenakli 3,7,9,10,11,12 gibi aşağı akış fonksiyonel analizleri ve tahlilleri için verimsiz hale getirir. BrdU ayrıca embriyonik gelişim6'da LRC'leri etiketlemek için uygun olmayan bir teratojendir. Ayrıca, BrdU yöntemi tüm montajlı numunelerde kullanıldığında verimsizdir. Dezavantajları, numunelerin derin kısmında antikorların düşük penetrasyonu veya derin penetrasyon için uzun bir antikor inkübasyon süresinin gerekliliğidir13. EdU etiketleme, numunelerin denatüre edilmesi adımlarından kaçar, böylece ultra yapıyı korur. Bu özellik, ko-lokalizasyon deneyleri ve kök hücre nakli gibi aşağı akış fonksiyonel analizleri için avantajlıdır11,12. Ayrıca, EdU etiketleme son derece hassas ve hızlıdır; EdU etiketlerini Cu(I)-katalizli [3 + 2] sikloekleme reaksiyonu ("tıklama" kimyası)14 yoluyla tespit etmek için hızla emilen ve daha küçük boyutlu floresan azidlerin kullanılması nedeniyle numune penetrasyonu yüksektir.
Giderek daha fazla uygulanan bir diğer DNA etiketleme yöntemi, mühendislik ürünü transgenik farelerin kullanılmasıdır. Bu fareler, tetrasikline duyarlı bir düzenleyici element 5,14 tarafından kontrol edilen histon 2B yeşil floresan proteinini (H2B-GFP) eksprese eder. Fareleri 4 haftalık ila 4 aylık bir kovalama süresi boyunca tetrasiklin chow / su ile besledikten sonra, GFP floresansı döngü hücrelerinde azalacak ve sadece LRC'ler floresan6'yı koruyacaktır. Bu yöntemin avantajı, etiketli LRC'lerin izole edilebilmesi ve hücre kültürü veya aşağı akış fonksiyonel analizleri için uygun kalmasıdır 6,7. Bazı çalışmalar, uzun süreli kullanım için kovalandığında sessiz kök hücrelerin yanlış etiketlendiğini bildirmiştir. Bu sonuç, H2B-GFP suşundan sızan bir arka plan ifadesinden kaynaklanıyordu ve uygun tetrasiklin tarafından düzenlenmiş yanıttankaynaklanmıyordu15.
Dahası, geçmişte çoğu literatür LRC'lerin tespitini esas olarak iki boyutlu olan ve LRC'lerin doğru yerini ve sayısını göstermede genellikle hatalı bir şekilde önyargılı olan kesitli slaytlarda kullanmıştır. Yaklaşım, karmaşık doku yapılarının kesitleri için yanlış açılar gösterdi16. Diğer yöntem ise seri kesitlerden 3D görüntüler elde etmek ve görüntü sonrası rekonstrüksiyonlar yapmaktı. Bu adımlar, sıkıştırılmış veya gerilmiş bölümler nedeniyle her seri bölümdeki varyasyonlardan kaynaklanan görüntü bozulması nedeniyle yanlıştı ve eksik bilgilere neden oldu16,17,18. Yöntem aynı zamanda zahmetli ve zaman alıcıydı.
LRC'lerin tam montajlı görüntülemesini kolaylaştırmak için, floresan iyi korunurken numunelerin netleştirilmesi gerekir. Güncel doku temizleme teknikleri üç ana kategoriye ayrılabilir: organik solvent bazlı doku temizleme teknikleri, sulu reaktif bazlı doku temizleme teknikleri ve hidrojel bazlı doku temizleme teknikleri17,19. Polietilen glikol (PEG) ile ilişkili çözücü sistemi (PEGASOS) yakın zamanda geliştirilmiştir. Bu yaklaşım neredeyse tüm doku tiplerini şeffaf hale getirir ve kemik ve dişler gibi sert dokular da dahil olmak üzere endojen floresanı korur20. PEGASOS yönteminin özellikle diş ve kemik materyallerinin temizlenmesinde diğer doku temizleme yöntemlerine göre avantajları vardır. Diğer yöntemlerin çoğu sert dokuları yalnızca kısmen temizleyebilir, uzun işlem sürelerine sahip olabilir veya maliyetli reaktifler gerektirebilir21. Ayrıca, PEGASOS yöntemi endojen floresanı diğer yöntemlere göre etkili bir şekilde koruyabilir.
Bu literatür bizi hücre çalışması için yeni bir yöntem oluşturmaya yönlendirdi. EdU etiketlemenin LRC'lerin algılama avantajlarını, dokudan arındırılmış numunelerin en üstün 3D tam montajlı görüntülemesiyle birleştirdik; Numuneler gelişmiş polietilen glikol (PEG) ile ilişkili solvent sistemi (PEGASOS) doku temizleme tekniği15 ile işlenmiştir. Sert doku saydamlığı, LRC'lerin floresansının 3D sinyalini dişleri veya mandibulayı kırmadan in vivo olarak yeniden yapılandırmamızı sağladı ve LRC'leri görselleştirmek ve ölçmek için daha doğru bir yol yarattı.
Bu çalışmada, fare kesici dişindeki LRC'leri görselleştirmek için yenilikçi bir kılavuz sunuyoruz. LRC'lerin fare kesici kök hücre nişi içindeki yerini ve miktarını belirlemek için 3D görsel bir yaklaşım yaptık. Bu projede EdU etiketleme, PEGASOS doku temizleme teknikleri ve konfokal mikroskopi kullanılmıştır. LRC'leri tüm montajlı doku üzerinde etiketleme ve temizlenmiş ve şeffaf bir numunenin kullanılması yöntemimiz, hem geleneksel kesitli slaytların hem de diğer dezavantajlı DNA etiketleme yöntemlerinin sınırlamalarının üstesinden gelir. Bu nedenle tekniğimiz, özellikle sert dokularda LRC tespiti gerektiren kök hücre homeostazı çalışmaları için uygun olacaktır. Protokol, diğer doku ve organlardaki kök hücre homeostazına odaklananlar için eşit derecede avantajlı olabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#215; Objective/NA 0.9</td>
			<td>Leica</td>
			<td>507702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bezyl benzoate (BB)</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>409529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane 9.0.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND cavity slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>BR475505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation Pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>23609-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrcih</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Carboynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Miiilipore Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X Software</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehye</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGMMA500</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>447943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfa-Cyanine 3 Azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>D1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-10X</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-butanol (tB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>360538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantitation of label-retaining cells in mouse incisors using a 3d reconstruction approach after tissue clearing

Murin kesici, farenin ömrü boyunca sürekli büyüyen bir organdır. Kesici dişlerin proksimal dokularında bulunan epitel ve mezenkimal kök hücreler, ameloblastlara, odontoblastlara ve pulpa fibroblastlarına farklılaşacak döllere yol açar. Bu hücreler, kesici dokuların sürekli cirosunu desteklemede çok önemlidir, bu da murin kesicisini yetişkin kök hücrelerin homeostazını incelemek için mükemmel bir model haline getirir. Kök hücrelerin, 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) gibi nükleotid analogları ile etiketlenebilen uzun ömürlü sessiz hücreler içerdiğine inanılmaktadır. Hücreler zaman içinde bu etiketi korur ve buna göre etiket tutma hücreleri (LRC'ler) olarak adlandırılır. LRC'leri in vivo görselleştirmeye yönelik yaklaşımlar, kök hücre homeostazını izlemek için sağlam bir araç sağlar. Bu çalışmada, LRC'leri görselleştirmek ve analiz etmek için bir yöntem tanımladık. Yenilikçi yaklaşımımız, doku temizleme ve tam montajlı EdU boyama işleminden sonra fare kesici dişlerinde LRC'leri, ardından konfokal mikroskopiyi ve görüntüleme yazılımı ile 3 boyutlu (3D) bir rekonstrüksiyonu içerir. Bu yöntem, kesitli slaytlar üzerindeki geleneksel LRC analizine kıyasla 3D görüntüleme elde etmeyi ve önyargısız kantitasyonu mümkün kılar.

EdU etiketleme ve PEGASOS doku temizleme işleminden sonra (Şekil 2), görüntümüzde gösterildiği gibi şeffaf mandibula elde edildi (Şekil 3B). Modifiye edilmiş numuneyi, doku temizleme işlemi olmayan normal bir mandibula ile karşılaştırdık (Şekil 3A). EdU etiketli şeffaf mandibula (Şekil 3B) konfokal görüntülemeye tabi tutuldu. Kök hücre nişini gösteren kesici tepe noktasına od...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing at JoVE.com

Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing

Fare kesicisi, kök hücre nişinde değerli etiket tutucu hücreler içerir. Etiket tutucu hücreleri tarafsız bir şekilde tespit etmek ve ölçmek için yeni bir yolumuz var; Çalışmamızda EdU etiketleme ve PEGASOS dokusunun mandibuladan temizlenmesinden sonra 3D rekonstrüksiyon yaklaşımı kullanılmıştır.

Doku Temizliğinden Sonra 3D Rekonstrüksiyon Yaklaşımı Kullanılarak Fare Kesici Dişlerinde Etiket Tutan Hücrelerin Tespiti ve Kantitasyonu

The murine incisor is an organ that grows continuously throughout the lifespan of the mouse. The epithelial and mesenchymal stem cells residing in the ...

Bu protokol, fare kesici kök hücre nişinin etiket tutucu hücrelerinin in vivo ve üç boyutlu görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi için bir yöntem açıklamaktadır. Bu teknik, yeni öğrenenler için zaman kazandıran ve kullanıcı dostudur. 3D görüntüler dokuya zarar vermeden elde edilir.3B niceliklendirme, verileri daha güvenilir ve doğru hale getirir. Başlamak için, mandibulaları parçalara ayırın. Numuneleri% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin ve gece boyunca oda sıcaklığında tutun.Kuluçkadan sonra, kasları mandibulalardan çıkarın. 37 derecelik bir santigrat derece çalkalayıcıda günlük bir ortam değişimi ile dört gün boyunca kalsifiye etmek için onları 0.5-molar etilendiamintetraasetik asit çözeltisine batırın. Kalan kan hemesini çıkarmak için bir gün boyunca 37 derecelik bir Santigrat çalkalayıcı üzerinde 15 mililitre% 25 Quadrol çözeltisindeki mandibulaların rengini açın.Tüm montaj 5-etinil-2-asal-deoksiüridin boyama için, metinde belirtildiği gibi taze bir 5-etinil-2-asal-deoksiüridin etiketleme kokteyli hazırlayın. Mandibulaları fosfat tamponlu bir salin ile Tween 20 veya PBST ile 37 santigrat derecelik bir çalkalayıcıda 30 dakika boyunca durulayın. Mandibulaları fosfat tamponlu salin ile her biri üç dakika boyunca üç kez durulamayı tekrarlayın, ardından gece boyunca bir çalkalayıcıda taze hazırlanmış 5-etinil-2-prime-deoksiüridin etiketleme kokteylinde inkübasyona uğrayın.Fosfat tamponlu tuzlu su yıkamayı üç kez tekrarlayın ve mandibulaları metinde belirtilen çözeltilere her biri 37 santigrat derece çalkalayıcıda altı saat boyunca yerleştirerek seri de-lipidasyon gerçekleştirin. Mandibulaları tert-bütanol-polietilen glikol veya tB-PEG çözeltisinde, günlük ortam değişimi ile iki gün boyunca 37 santigrat derecede dehidrate edin. İki gün sonra, kırılma indisi eşleşmesi elde etmek için ve şeffaflık sağlanana kadar% 75 benzil benzoat,% 22 polietilen glikol-metil-eter metakrilat ortalama 500 veya PEG-MMA500 ve% 3 Quadrol içeren benzil benzoat-polietilen glikol temizleme ortamındaki mandibulayı temizleyin.Dokudan arındırılmış tüm mandibulayı benzil benzoat-polietilen glikol temizleme ortamındaki marka boşluk slaytlarına monte edin ve cam kapak kızaklarıyla örtün. Konfokal görüntüleme yazılımında, istenen görüntü alma parametrelerini ayarlayın. Floresan uyarma panelinde, floroforları en iyi şekilde uyarmak için gereken lazeri etkinleştirin.Floresan algılama panelinde, ölçülecek dalga boylarını seçmek için kaydırıcıyı hareket ettirin. Cam kapak kaymasının ve amacın kırılma indisine uyacak şekilde kapak kapağının üzerine kırılma indisi 1.52 olan bir damla daldırma yağı ekleyin ve monte edilmiş mandibulayı mikroskop aşamasına yerleştirin. Floresan lambaları açın ve ilgilendiğiniz bölgeleri görüntülemek için uygun bir büyütme hedefi seçin.Canlı tarama modunda, mandibulanın tüm bölgesini X ve Y boyutlarında görselleştirmek için görüş alanını tanımlayın. Fare kesici dişindeki kök hücre nişinin hacmini doğru bir şekilde kaplayan üst ve alt Z aşaması edinme parametrelerini ayarlayın. İki mikrometrelik bir Z adım boyutu kullanın veya ihtiyacınıza göre.Z-stack görüntü dosyalarını lif formatında edinin ve kaydedin. Z-stack görüntü dosyasını yerel biçim dosya türüne dönüştürmek için bir görüntüleme yazılımı dosya dönüştürücüsü kullanın. Görüntüleme yazılımında Arena düğmesini tıklayın, sonra Görüntü'yü seçin.Orijinal lif dosyasını seçin ve birleştirilmiş dosyayı seçin. Görüntüler görüntüleme yazılımına aktarılacaktır. Görüntü veri kümesini açmak için içe aktarılan dosyayı çift tıklatın.Görüntüleme yazılımında, Ekran Ayarı panelini ziyaret edin. Ekran Ayarı panelinde, kanalın adını tıklatın. Varsayılan modda genellikle kırmızı olarak etiketlenir.Image Properties (Görüntü Özellikleri) penceresinde, Mapped Color (Eşlenen Renk) sekmesine tıklayın. Renk Sekmesi Dosyası seçeneğinde, Yangın Akışı'nı seçin ve ardından Tamam'a tıklayın. Arka plan floresansını ve pozitif floresansı numuneden ayırt etmek için ekran rengini seçin. Ekranın sol üst tarafında, Sahne Özellikleri bölmesinde, Yeni Yüzey Ekle etiketli mavi simgeye tıklayın.Arka plan floresansının çoğunu kaldırmak için Ses Düzeyi simgesinin seçimini kaldırın, böylece pozitif floresan manuel segmentasyon sırasında belirgin bir şekilde görülebilir. Ardından, Oluştur sekmesine tıklayıp Otomatik oluşturmayı atla, manuel olarak düzenle sekmesini seçerek ilgili bölgenin veya YG'nin manuel olarak segmentasyonunu başlatın. Manuel yüzey oluşturma sihirbazında, YG'yi kolayca şekillendirmek için numunelere göre yönlendirmeyi seçmek üzere Kontur sekmesine tıklayın.Ardından, sağ köşedeki işaretçi menüsünün Seç modunda olduğundan emin olun. Dokudaki YG'yi bulmak için dilim konumunu ayarlayın. Daha önce de belirtildiği gibi, çoğu arka plan floresanı zaten kaldırılmıştır.Çiz düğmesine tıklayın ve geçici bir ilgi alanı çizin. YG dışındaki diğer alanlardan gelen etkileşimi önlemek için Görünürlük seçeneğini Yok olarak belirleyin ve ardından ilgilenilen bölgeyi dilim dilim bölümlere ayırın. ROI çizimi tamamlandıktan sonra, ROI'nin 3B geometrisini almak için Yüzey Oluştur'a tıklayın.Manuel yüzey oluşturma sihirbazındaki Düzenle düğmesine tıklayın ve Tümünü Maskele'yi seçin. Açılan Maske Kanalı penceresinde, Kanal Seçimi seçeneklerinde Kanal 1'i seçin. Daha sonra, maskeyi uygulamadan önce Kanalı çoğalt'ı seçin.Maske ayarlarında İç/dışta sabit'i seçin ve voksel dış yüzeyini sıfıra ayarlayın. Sahne Özellikleri bölmesinde, Yüzey nesnesinin seçimini kaldırın ve Birim nesnesini seçin. Görüntü Ayarı'nda, orijinal Kırmızı kanalın seçimini kaldırın ve Maskelenmiş Kırmızı kanalı seçin.İstenilen 3D işlenmiş ve pozitif etiketli floresan yatırım getirisini elde etmek için renk yoğunluklarını ayarlayın. 3B olarak oluşturulmuş etiket tutma hücreleriyle karşılaştırılabilir şekilde örtüşen 3B noktalar oluşturarak 3B olarak oluşturulmuş etiket tutma hücrelerini ölçmek için Noktalar simgesine tıklayarak yeni bir spot nesnesi oluşturun. Nokta oluşturma sihirbazındaki adımlar arasında geçiş yapmak için alt okları kullanın.Son düğmesine tıklayın ve İstatistik düğmesini seçin. Ardından, görüntüdeki toplam nokta sayısının değerini bulmak için Genel sekmesini seçin. 5-etinil-2-asal-deoksiüridin etiketleme ve polietilen glikol ile ilişkili çözücü sistemi doku temizleme işleminden sonra, şeffaf mandibula elde edildi.Modifiye edilmiş numune, doku temizleme işlemi olmayan normal bir mandibula ile karşılaştırıldı ve 5-etinil-2-prime-deoksiüridin etiketlemeli şeffaf bir mandibula konfokal görüntülemeye tabi tutuldu. Kesici dişin optik bölümü, XY düzlemindeki kesici tepenin kök hücre nişinde etiket tutucu hücreler gösterdi. Bir kesici tepenin 3D görüntü yapısı, hem epitel hem de mezenkimal kök hücre nişinde 5-etinil-2-prime-deoksiüridin pozitif etiket tutucu sessiz kök hücreleri gösterdi.5-etinil-2-asal-deoksiüridin pozitif hücreler, mezenkimal etiket tutucu hücrelerle karşılaştırılabilir şekilde örtüşen niceleme için noktalara aktarıldı. Sadece mezenkimal etiket tutucu hücreler ve sadece epitel etiket tutucu hücreler için oluşturulan lekeler görüntüde görülebilir. Epitel ve mezenkimal etiket tutucu hücrelerin nicelleştirilmesi de yapıldı.İşleme ve temizleme özellikleri en önemli adımlardır ve tatmin edici sonuçlar elde etmek için dokunun kullanımına göre optimize edilmelidir. Bu yöntem ayrıca S2VGFP seviyesindeki LRC'leri görselleştirmek ve hücre soy izlemede soy konumu ve bunların niceliği veya katkıları hakkında ayrıntılı bilgi edinmek için değiştirilebilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Preimplantasyon Fare Embriyolar Erken Hücre Kader Belirleyicileri Araştırma kaybı: ve Kazanç fonksiyon-Yaklaşımı

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Bir Transpozon Sistemi Kullanılarak Fare Amniyotik Sıvı Hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Memeli Erkek Germ Hücrelerinin Çok Denekli Saflaştırılmasında Standart Bir Yaklaşım, Mekanik Doku Ayrılma ve Akış Sitometrisi ile

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

IMMUNO florasan mikrotübüller ve Ex Vivo bağırsak dokusu ve 3D Vitro bağırsak Organoids Centrosomal proteinler etiketleme

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Endotel Kolonisi Oluşturan Hücreler ve Mezenkimal Kök Hücreler tarafından Oluşturulan Eş Kültür Sfaoidler Kullanılarak Üç Boyutlu Anjiyogenez Tsay Sistemi

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Tüm montaj immünohistokimya ve 3D Rekonstrüksiyon u kullanarak Faringeal Arch Arterlerin Görselleştirilmesi ve Analizi

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Erken Fare Embriyolarından Sıralama için Küçük RNA Kütüphanelerinin Hazırlanması

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...