Name: combining human organoids and organ-on-a-chip technology to model intestinal region-specific functionality
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality at JoVE.com

Vi takker professor Mark Donowitz for at levere de intestinale biopsiafledte organoider og Brett Clair for at designe de videnskabelige illustrationer af chip-, bærbar- og kulturmodulet. Alle de øvrige videnskabelige illustrationer blev genereret ved hjælp af BioRender.

BEMÆRK: Alle cellekulturer skal håndteres ved hjælp af en korrekt aseptisk teknik.
De humane tarmorganoider, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev opnået fra Johns Hopkins University, og alle metoder blev udført i overensstemmelse med godkendte retningslinjer og regler. Alle eksperimentelle protokoller blev godkendt af Johns Hopkins University Institutional Review Board (IRB #NA 00038329).
1. Fremstilling af cellekulturreagenserne
<ol>...

<ol>
	<li>Fritz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+clinically+relevant+drug-metabolizing+enzymes+along+the+human+intestine+and+their+correlation+to+drug+transporters+and+nuclear+receptors:+An+intra-subject+analysis.">Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).</li><li>Okumura, R., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+intestinal+homeostasis+by+mucosal+barriers.">Maintenance of intestinal homeostasis by mucosal barriers.</a> Inflammation and Regeneration. 38 (1), 1-8 (2018).</li><li>Delgado, M. E., Grabinger, T., Brunner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+at+the+intestinal+epithelial+front+line.">Cell death at the intestinal epithelial front line.</a> FEBS Journal. 283 (14), 2701-2719 (2016).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+Differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology.</a> The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caco-2+cell+monolayer:+Usefulness+and+limitations.">The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+human+mini-intestines+to+the+study+of+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">The contributions of human mini-intestines to the study of intestinal physiology and pathophysiology.</a> Annual Review of Physiology. 79, 291-312 (2017).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett&#8217;s+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett&#8217;s epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).</li><li>Durel, J. F., Nerurkar, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+vertebrate+gut+morphogenesis.">Mechanobiology of vertebrate gut morphogenesis.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 63, 45-52 (2020).</li><li>Gayer, C. P., Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+mechanical+forces+on+intestinal+physiology+and+pathology.">The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology.</a> Cellular Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+activates+Piezo1+to+promote+mucin2+expression+in+goblet+cells.">Mechanical stimulation activates Piezo1 to promote mucin2 expression in goblet cells.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology (Australia). 36 (11), 3127-3139 (2021).</li><li>Navabi, N., McGuckin, M. A., Lind&#233;n, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+cell+lines+form+polarized+epithelia+with+an+adherent+mucus+layer+when+cultured+in+semi-wet+interfaces+with+mechanical+stimulation.">Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation.</a> PLoS One. 8 (7), 68761 (2013).</li><li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+human+Small+Intestine-on-a-Chip+using+biopsy-derived+organoids.">Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duodenum+intestine-chip+for+preclinical+drug+assessment+in+a+human+relevant+model.">Duodenum intestine-chip for preclinical drug assessment in a human relevant model.</a> eLife. 9, 50135 (2020).</li><li>Apostolou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microphysiological+colon+platform+to+decipher+mechanisms+driving+human+intestinal+permeability.">A novel microphysiological colon platform to decipher mechanisms driving human intestinal permeability.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (5), 1719-1741 (2021).</li><li>Jalili-Firoozinezhad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Author+correction:+A+complex+human+gut+microbiome+cultured+in+an+anaerobic+intestine-on-a-chip.">Author correction: A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 583 (2019).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+enhances+differentiation+of+jejunal+human+enteroids+in+Intestine-Chip.">Fluid shear stress enhances differentiation of jejunal human enteroids in Intestine-Chip.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), 258-271 (2021).</li><li>Sontheimer-Phelps, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon-on-a-chip+enables+continuous+in+vitro+analysis+of+colon+mucus+layer+accumulation+and+physiology.">Human colon-on-a-chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).</li><li>Tovaglieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+enhancement+of+enterohemorrhagic+E.+coli+pathogenesis+mediated+by+microbiome+metabolites.">Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites.</a> Microbiome. 7 (1), 43 (2019).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+human+organs-on-chips.">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).</li><li>Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genetic+engineering+of+human+intestinal+organoids+using+electroporation.">Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).</li><li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow.">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).</li><li>Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+motility:+From+bench+side+to+bedside.">Colonic motility: From bench side to bedside.</a> Morgan &amp; Claypool Life Sciences. , (2010).</li><li>Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradigms+for+mechanical+signal+transduction+in+the+intestinal+epithelium+-+category:+Molecular,+cell,+and+developmental+biology.">Paradigms for mechanical signal transduction in the intestinal epithelium - category: Molecular, cell, and developmental biology.</a> Digestion. 68 (4), 217-225 (2003).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression.">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> The American Journal of Pathology. 166 (2), 409-419 (2005).</li><li>Nava, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-&#947;+regulates+intestinal+epithelial+homeostasis+through+converging+&#946;-Catenin+signaling+pathways.">Interferon-&#947; regulates intestinal epithelial homeostasis through converging &#946;-Catenin signaling pathways.</a> Immunity. 32 (3), 392-402 (2010).</li><li>Madara, J. L., Stafford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-&#947;+directly+affects+barrier+function+of+cultured+intestinal+epithelial+monolayers.">Interferon-&#947; directly affects barrier function of cultured intestinal epithelial monolayers.</a> Journal of Clinical Investigation. 83 (2), 724-727 (1989).</li><li>Bruewer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+cytokines+disrupt+epithelial+barrier+function+by+apoptosis-independent+mechanisms.">Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms.</a> The Journal of Immunology. 171 (11), 6164-6172 (2003).</li><li>Jones, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+in+inflammatory+bowel+disease.">Adhesion molecules in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 36 (5), 724-730 (1995).</li><li>Uhlar, C. M., Whitehead, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+amyloid+A,+the+major+vertebrate+acute-phase+reactant.">Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant.</a> European Journal of Biochemistry. 265 (2), 501-523 (1999).</li><li>P&#233;rez-Gonz&#225;lez, C., Ceada, G., Matej&#269;i&#263;, M., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digesting+the+mechanobiology+of+the+intestinal+epithelium.">Digesting the mechanobiology of the intestinal epithelium.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 72, 82-90 (2022).</li><li>In, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterohemorrhagic+escherichia+coli+reduces+mucus+and+intermicrovillar+bridges+in+human+stem+cell-derived+colonoids.">Enterohemorrhagic escherichia coli reduces mucus and intermicrovillar bridges in human stem cell-derived colonoids.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (1), 48-62 (2016).</li><li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+organ-on-chip+reveals+intestinal+microenvironment+and+mechanical+forces+impacting+shigella+infection.">Bioengineered human organ-on-chip reveals intestinal microenvironment and mechanical forces impacting shigella infection.</a> Cell Host and Microbe. 26 (3), 435-444 (2019).</li><li>Kerns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunocompetent+organ-on-chip+platforms+allow+safety+profiling+of+tumor-targeted+t-cell+bispecific+antibodies.">Human immunocompetent organ-on-chip platforms allow safety profiling of tumor-targeted t-cell bispecific antibodies.</a> eLife. 10, 67106 (2021).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+engineering+human+pathophysiology+with+organs-on-chips.">Reverse engineering human pathophysiology with organs-on-chips.</a> Cell. 164 (6), 1105-1109 (2016).</li></ol>

Kombinationen af organ-on-a-chip-teknologi og tarmorganoider giver løfte om nøjagtig modellering af human tarmfysiologi og patofysiologi. Her giver vi en enkel og robust trin-for-trin protokol (skitseret i figur 1) til etablering af tarmchippen indeholdende biopsiafledt tyndtarms- eller koloneepitelim og intestinale mikrovaskulære endotelceller, der er dyrket i en mikrofluidisk enhed. Denne chipbaserede simulering af den menneskelige tarm inkorporerer fysiologiske, luminale og vaskulære ...

Den menneskelige tarm er et komplekst og multitasking organ, der er i stand til selvregenerering. Det er opdelt i tyndtarmen og tyktarmen. Tyndtarmens primære funktion er at fordøje mad, der kommer fra maven, absorbere alle næringsstoffer og videregive resten til tyktarmen, som genvinder vandet og elektrolytterne. Tyndtarmen er yderligere opdelt i flere anatomisk forskellige regioner: tolvfingertarmen, jejunum og ileum, som hver især er tilpasset til at udføre specifikke funktioner. For eksempel hjælper tolvfingertarmen med at nedbryde chymen (maveindholdet) for at muliggøre korrekt absorption af næringsstoffer, der involverer proteiner, kulhydrater, vitaminer og mineraler i jejunum. Denne proksimale del af tyndtarmen er også det vigtigste sted for intestinal lægemiddelabsorption og metabolisme, og det er kendetegnet ved den højere ekspression af lægemiddelmetaboliserende enzymer (fx CYP3A4) sammenlignet med deres ekspression i ileum og kolon1. Ud over sin vigtigste rolle i fordøjelsen og absorptionen af næringsstoffer er tarmen også en effektiv barriere mod potentielt skadeligt luminalt indhold, såsom patogene mikroorganismer, mikrobielle metabolitter, diætantigener og toksiner 2,3. Det er bemærkelsesværdigt, at den menneskelige tyktarm er beboet af et stort antal mikroorganismer, der langt overstiger de samlede celler i menneskekroppen, hvilket giver mange fordele for ernæring, stofskifte og immunitet. Derfor er opretholdelsen af integriteten af slimhindebarrieren dannet af tarmepitelceller afgørende for at tillade det symbiotiske forhold mellem tarmmikrobiotaen og værtscellerne ved fysisk at adskille dem for at undgå unødvendig immuncelleaktivering2. Derudover spiller programmeret tarmcelledød en væsentlig rolle som en selvbeskyttende mekanisme, der forhindrer inficerede celler i at fortsætte eller formere sig - og derved sprede potentielle patogener3 - mens den kontinuerlige selvfornyelse af tarmepitelet hver fjerde til syv dage kompenserer for celletabet, hvilket sikrer barriereintegritet og vævshomeostase. Forringelser af beskrevne tarmfunktioner, herunder næringsstofabsorption, barriereintegritet eller ubalance i tarmcelledød og selvfornyelse, kan resultere i udvikling af en række gastrointestinale lidelser, herunder underernæring og inflammatorisk tarmsygdom (IBD)2,3.
Tidligere er dyremodeller og transformerede kræftafledte tarmcellelinjer blevet brugt til at studere de fysiologiske og patofysiologiske funktioner i humant tarmvæv. De stadig mere fremtrædende bekymringer om dyreforskningens omsættelighed til mennesker som følge af betydelige forskelle mellem de to arter understregede imidlertid et behov for humanrelevante alternative metoder4. De almindeligt anvendte in vitro tarmcellelinjer omfatter T84,Caco-2 og HT29 celler. Mens de efterligner visse aspekter af tarmbarrierefunktionen og membrantransporten, er de kendetegnet ved et ændret udtryk for lægemiddelmetaboliserende enzymer5, overfladereceptorer og transportører4. Derudover mangler de tarmsegmentspecificitet og undlader at rekapitulere kompleksiteten af tarmepitelet, hvor hver model kun indeholder en ud af de fem epitelcelletyper, der er til stede i tarmen6.
For nylig blev humane tarmorganoidkulturer etableret fra friske biopsier af tyndtarmen og tyktarmen 7,8 eller inducerede pluripotente stamceller (iPSC)9 introduceret som alternative eksperimentelle modeller med potentiale til at supplere, reducere og måske erstatte dyreforsøg i fremtiden. Mens iPSC'er kan opnås på en ikke-invasiv måde, kræver etablering af organoider fra iPSC'er brug af komplekse og lange protokoller (med flere eksperimentelle trin) og genererer kulturer, der ligner humant føtalvæv. I modsætning hertil er biopsiafledte organoider meget skalerbare, da de kan udnytte tarmvævets iboende fornyelseskapacitet og kan passeres og formeres in vitro på ubestemt tid. Det er vigtigt, at biopsiafledte organoider opretholder sygdommen og tarmregionsspecifikke egenskaber ved det primære væv, hvorfra de blev udviklet, og emulerer den cellulære mangfoldighed af tarmepitelet. Organoider kan bruges som patientspecifikke avatarer in vitro til at opklare biologi og patogenese af forskellige gastrointestinale lidelser og forbedre deres terapeutiske styring. Selvom tarmorganoider har opnået en imponerende grad af fysiologisk funktionalitet, undlader de stadig at reproducere kompleksiteten af de indfødte organer på grund af deres mangel på kritiske stromale komponenter - herunder blodkar, bindevæv, perifere nerver og immunceller - samt mekanisk stimulering. Mekaniske parametre, såsom flow, forskydningsspænding, strækning og tryk, er kendt for at påvirke vævsmorfogenese og homeostase in vivo og blev tidligere vist at forbedre modning af celler in vitro 10,11,12,13. En yderligere vigtig ulempe ved organoidsystemer er lumenets utilgængelighed og dermed til den apikale side af epitelet. Dette udgør en udfordring for at undersøge forskellige mekanismer forbundet med polariseret ekspression af ion- og lægemiddeltransportører, værtsmikrobiominteraktioner og farmaceutisk toksicitetstest. Endelig lider organoidkulturer af betydelig variation i størrelse, morfologi og funktion på grund af den stokastiske karakter af in vitro-selvorganiseringsprocessen og celleskæbnevalg. For at realisere det fulde potentiale af tarmorganoider i sygdomsmodellering, lægemiddelscreening og regenerativ medicin er det derfor nødvendigt at udforske nye strategier, der reducerer variationen i organoidudvikling, forbedrer adgangen til luminalrummet og inkorporerer manglende celle-celle-interaktioner.
Organ-on-a-Chip-teknologi har introduceret mange teknikker til inkorporering af mekaniske kræfter og væskestrøm til tarmcellekulturer in vitro. Men da de fleste af de indledende proof-of-concept-undersøgelser har brugt kræftafledte cellelinjer, der ikke udviste tilstrækkelig cellulær mangfoldighed, er relevansen af disse systemer blevet stillet spørgsmålstegn ved. For nylig har vi synergistisk kombineret tarmorganoider og organ-on-a-chip-teknologi for at inkorporere de bedste funktioner i hver tilgang i et in vitro-system 14,15,16. Den resulterende tarmchip rekapitulerer den multicellulære arkitektur af tarmepitelet, tilstedeværelsen af epitel-endotelvævsgrænseflade og de mekaniske kræfter i væskestrøm og strækning, hvilket muliggør emulering af funktioner på organniveau in vitro. Derudover øger brugen af primære vævsafledte organoider (som kan udtages fra forskellige regioner i den menneskelige tarm) som udgangsmateriale denne models alsidighed, da chips, der repræsenterer humant tolvfingertarm, jejunum, ileum og tyktarm, kan etableres efter lignende sånings- og dyrkningsprocedurer. Det er vigtigt, at tarmchips muliggør realtidsvurdering af: tarmbarrierens integritet; aktivitet af børstegrænsen og lægemiddelmetabolisme enzymer; produktion af muciner; sekretion af cytokiner; og interaktion mellem tarmceller og patogene og kommensale mikroorganismer, som det fremgår af de tidligere offentliggjorte rapporter. Især når tarmchips blev etableret ved hjælp af organoider genereret fra forskellige individers væv, fangede disse modeller den forventede interdonorvariation i de funktionelle reaktioner på forskellige lægemidler og behandlinger. Alt i alt åbner sammenlægning af organoider med Organ-on-a-Chip-teknologi døren til mere avancerede, personaliserede, in vivo-relevante modeller, der kan forbedre den fysiologiske relevans og nøjagtighed af in vitro-resultaterne samt deres ekstrapolering til mennesker. Her præsenteres en detaljeret protokol til etablering af tarmchippen og dens anvendelse i undersøgelserne af fysiologiske funktioner i de to tarmsegmenter: tolvfingertarmen og tyktarmen. For det første beskrives metoderne til vurdering af aktiviteten af det lægemiddelmetaboliserende enzym CYP3A4 i tolvfingertarmen, såvel som dets induktion af prototypiske forbindelser, såsom rifampicin og vitamin D3. For det andet er de trin, der kræves for at modellere "utæt tarm" i tyktarmschippen, beskrevet i protokollen, hvor forstyrrelsen af epitelbarrieren udføres ved hjælp af kendetegnende cytokiner, der er impliceret i patogenesen af IBD. Kort fortalt formeres organoider afledt af humane biopsier in vitro, udsættes for enzymatisk fordøjelse og introduceres i chippens øverste kanal. I nærvær af kontinuerlig perfusion med vækstfaktorberigede medier udvikler de sig til et sammenflydende epitelmonolag med 3D-arkitektur og en let tilgængelig apikal celleoverflade. Det nederste "vaskulære" chiprum er podet med mikrovaskulære endotelceller isoleret fra tyndtarmen eller tyktarmen. Epitelet og endotelet adskilles af en porøs strækbar membran, som letter de parakrine interaktioner mellem de to væv og, når de udsættes for cykliske deformationer, emulerer peristaltiklignende bevægelser af den menneskelige tarm. Samkulturen opretholdes under de dynamiske strømningsbetingelser, der genereres af luminal og vaskulær perfusion med passende cellekulturmedier. Endelig beskriver vi adskillige typer assays og endpointanalyser, der kan udføres direkte på chip eller fra samplede cellekulturudløb.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>AlphaBioRegen</td>
			<td>ALHE15</td>
			<td>0.5 cells M/ml ; cryopreserved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>AlphaBioRegen</td>
			<td>ALHE16</td>
			<td>0.5 cells M/ml ; cryopreserved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy-derived Human Duodenal Organoids</td>
			<td>John Hopkin&#39;s University</td>
			<td>-</td>
			<td>The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy-derived Human Colonic Organoids</td>
			<td>John Hopkin&#39;s University</td>
			<td>-</td>
			<td>The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zo&#235; CM-1&#8482;&#160;Culture Module</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Culture module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orb-HM1&#8482;&#160;Hub Module</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>5% CO2, vacuum stretch, and power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1&#8482; Stretchable Chip</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pod&#8482; Portable Modules</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Portable module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Light Box</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip Cradle</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>1 per square culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip&#174;-HV Filters</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SE1M003M00</td>
			<td>0.45&#160;&#956;m&#160;PVDF filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82051-068</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld&#160;vacuum&#160;aspirator</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4930</td>
			<td>&#160;-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating&#160;pipettes</td>
			<td>Corning / Falcon</td>
			<td>357558</td>
			<td>2 mL,&#160;polystyrene, individually&#160;wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating tips</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
			<td>Sterile (autoclaved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological&#160;pipettes</td>
			<td></td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>2 mL, 5 mL,&#160;10 mL,&#160;and&#160;25 mL&#160;low endotoxin, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>P20, P200,&#160;P1000&#160;and standard multichannel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette&#160;tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>P20, P200,&#160;and&#160;P1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes&#160;(Protein&#160;LoBind&#174; Tubes)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030122216;&#160;0030122240</td>
			<td>15 mL, 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Tubes&#174;&#160;lo-bind</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431081</td>
			<td>1.5 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells black walled plate</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for epithelial permeability analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (with camera)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For bright-field&#160;imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (or beads)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Set to 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum set-up</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>-</td>
			<td>Minimum&#160;pressure: -70 kPa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>220033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td>Cell culture flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent-1&#160;(ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Chip coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent-2&#160;(ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Chip coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS&#160;(DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25055CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93595</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TryplE&#160;Express</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Organoids&#160;dissociation&#160;and endothelium cells&#160;detachment&#160;solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult&#8482; Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>Organoid Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22121</td>
			<td>Endothelial medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin&#8482;&#160;</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ANT-PM-1</td>
			<td>antimicrobial agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment Factor&#8482;</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>4Z0-210</td>
			<td>coating solution for flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - Growth Factor Reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Solubilized basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>ECM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>ECM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td>organoid media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-10</td>
			<td>organoid media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>Basement mebrane matrix dissociationsolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9576</td>
			<td>30%, Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25055CV</td>
			<td>Sterile, Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3KDa Dextran Cascade Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D7132</td>
			<td>10 mg powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin (RIF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# R3501</td>
			<td>CYP inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testosterone hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1500</td>
			<td>CYP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# D1530</td>
			<td>CYP inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>159002</td>
			<td>LCMS stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>157-4</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>566460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Occludin</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Claudin 4</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>36-4800</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-E-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1416</td>
			<td>epithelial adherens junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VE-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33168</td>
			<td>endothelial adherent junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>339194</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12183020</td>
			<td>RNA lysis, isolation and purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript&#8482; IV VILO&#8482; Master Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11756050</td>
			<td>reverse transcriptase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan&#8482; Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444557</td>
			<td>qPCR reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio&#8482; 5 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A28573</td>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs99999901_s1</td>
			<td>Eukaryotic 18S rRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP3A4 primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs00604506_m1</td>
			<td>Cytochrome&#160; family 3 subfamily A member 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23236</td>
			<td>Protein quantification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Tris lysis buffer</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R60TX-3</td>
			<td>Protein lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved/Total Caspase-3 Whole Cell Lysate Kit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15140D</td>
			<td>Caspase 3 detection kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15198D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex)</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15053D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>20X long-distance objective lenses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AXIOvert.A1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Brightfield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>10X objective lenses</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining human organoids and organ-on-a-chip technology to model intestinal region-specific functionality

Tarmslimhinden er en kompleks fysisk og biokemisk barriere, der opfylder et utal af vigtige funktioner. Det muliggør transport, absorption og metabolisme af næringsstoffer og xenobiotika, samtidig med at det letter et symbiotisk forhold til mikrobiota og begrænser invasionen af mikroorganismer. Funktionel interaktion mellem forskellige celletyper og deres fysiske og biokemiske miljø er afgørende for at etablere og opretholde tarmvævshomeostase. Modellering af disse komplekse interaktioner og integreret tarmfysiologi in vitro er et formidabelt mål med potentiale til at transformere den måde, hvorpå nye terapeutiske mål og lægemiddelkandidater opdages og udvikles.
Organoider og Organ-on-a-Chip-teknologier er for nylig blevet kombineret for at generere humanrelevante tarmchips, der er egnede til at studere de funktionelle aspekter af tarmfysiologi og patofysiologi in vitro. Organoider afledt af biopsierne i den lille (tolvfingertarmen) og tyktarmen podes ind i det øverste rum i en organchip og udvides derefter med succes som monolag, samtidig med at de forskellige cellulære, molekylære og funktionelle træk ved hver tarmregion bevares. Humane tarmvævsspecifikke mikrovaskulære endotelceller er inkorporeret i det nederste rum af organchippen for at genskabe epitel-endotelgrænsefladen. Denne nye platform letter luminal eksponering for næringsstoffer, lægemidler og mikroorganismer, hvilket muliggør undersøgelser af tarmtransport, permeabilitet og værtsmikrobeinteraktioner.
Her gives en detaljeret protokol til etablering af tarmchips, der repræsenterer det menneskelige tolvfingertarm (tolvfingertarmschip) og tyktarmen (tyktarmschip) og deres efterfølgende kultur under kontinuerlig strømning og peristaltiklignende deformationer. Vi demonstrerer metoder til vurdering af lægemiddelmetabolisme og CYP3A4 induktion i tolvfingertarmschip ved hjælp af prototypiske induktorer og substrater. Endelig giver vi en trinvis procedure til in vitro-modellering af interferon gamma (IFNγ) -medieret barriereforstyrrelse (utæt tarmsyndrom) i en tyktarmschip, herunder metoder til evaluering af ændring af paracellulær permeabilitet, ændringer i cytokinsekretion og transkriptomisk profilering af cellerne i chippen.

Figur 1D opsummerer tidslinjen for tarmchipkulturen og illustrerer tarmendotelcellerne og organoiderne før og ved såning på chippen. Desuden demonstrerer det de forskellige morfologiske forskelle mellem tolvfingertarmen og tyktarmschips, fremhævet af tilstedeværelsen af de villi-lignende formationer i tolvfingertarmen og repræsentativ for tyndtarmsarkitekturen.
Figur 3A,B viser fold CYP3A4 induktionsresponser i ...

Watch this Scientific Journal Video about Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality at JoVE.com

Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

Biopsiafledte tarmorganoider og organ-on-a-chips-teknologier kombineres til en mikrofysiologisk platform for at rekapitulere regionsspecifik tarmfunktionalitet.

Kombination af humane organoider og organ-on-a-chip-teknologi til modellering af tarmregionsspecifik funktionalitet

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

Denne protokol viser, hvordan man bruger biopsi-afledte tarmorganoider og organ-on-a-chip-teknologi til at generere en fysiologisk relevant tarmchip, som derefter kan bruges til at forudsige farmakokinetik og lægemiddelinteraktion og til at studere intestinal epitelbarrieredysfunktion. At forene organoider i organ-on-a-chip-teknologi giver os mulighed for at reproducere kompleksiteten af tarmepitelet. Derudover muliggør det større eksperimentel kontrol af de mekaniske signaler, flowfordeling og biokemiske gradienter.Denne metode emulerer den komplekse fysiologi i den menneskelige tarm, hvilket giver en større forståelse af det cellulære og molekylære grundlag for normale og patologiske tarmfunktioner. Dette hjælper med bedre at forudsige farmakokinetik og farmakodynamik og potentielle lægemiddelkandidater for at forhindre inflammatorisk skade. Såning er et kritisk trin i protokollen.Overdreven fragmentering eller unøjagtig såtæthed af tarmorganoidfragmenterne kan kompromittere udviklingen og differentieringen af epitelbarrieren. Til at begynde med skal du aspirere mediet fra den statiske organoidkultur. Gendan medier fra nok brønde til at opnå en endelig såtæthed på otte millioner celler pr. Milliliter.Tilsæt 500 mikroliter iskold BMM-dissociationsopløsning til hver brønd, og fastgør den opløste BMM fra brøndoverfladen. Opsamling suspensionen i et 15 milliliter lavt proteinbindingsrør og læg det på is. Ryst forsigtigt røret hvert 15. minut i en time.Centrifuge ved 300 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius for at opnå en organoid pellet. Hvis der observeres et gennemsigtigt gellag over pelleten, aspireres opløsningen fra røret. Resuspender pelleten og tilsæt et lige stort volumen BMM-dissociationsopløsning.Inkuberes på is i 10 minutter og centrifugeres. Gentag, indtil der ikke er opløselige BMM-rester til stede. Kassér derefter supernatanten og suspender pelleten i to milliliter organoid fordøjelsesopløsning.Inkuber røret ved 37 grader Celsius i et til tre minutter og tilsæt otte milliliter avanceret DMEM F12 for at stoppe den enzymatiske reaktion. Centrifuge og resuspend pellet i komplet organoid vækstmedium for at opnå otte millioner celler pr. Milliliter. Aliquot 360 mikroliter i sterile 1,5 milliliter lavt proteinbindingsrør.Fjern derefter mediet fra den øverste kanal af de belagte chips og tilsæt 30 mikroliter cellesuspension. Inkuber chipsene ved 37 grader Celsius natten over for at klæbe organoidfragmenterne til membranen. Tilsæt tre milliliter præ-ligevægtet komplet organoidvækstmedium til det øverste indløbsreservoir og tre milliliter præ-ligevægtet endotelcellevækstmedium i det nederste indløbsreservoir.Tilsæt 300 mikroliter af det samme medie i de respektive øverste og nederste udløbsreservoirer. Overfør bakken med de bærbare moduler til kulturmodulet. På kulturmodulet skal du gentagne gange køre prime cycle, indtil der dannes tilstrækkelige dråber til vellykket tilslutning af chipsene.Skub derefter chipholderen ind i det bærbare modul. Start derefter den to timer lange reguleringscyklus for at sætte kulturmediet under tryk i det bærbare modul og chip, hvorefter de programmerede forhold genoptages. Skift derefter strækindstillingerne og start kulturmodulet.Efter 24 timer gentages cyklussen med 10% strækning og samme frekvens. For at forberede doseringsmedier eller køretøjskontrol fortyndes CYP-inducerstamopløsningerne eller DMSO i komplet organoidvækstmedium og endotelcellevækstmedium. Sæt kulturmodulet på pause, og bring bakkerne til biosikkerhedsskabet.Udskift mediet i alle indløbs- og udløbsbeholdere med to milliliter doseringsmedier med induktorer eller køretøjskontrol. Returner de bærbare moduler tilbage til kulturmodulet og genstart flowet med 30 mikroliter i timen. Udskift mediet med frisklavet inducerende opløsning hver 24. time, og fortsæt kulturen i 48 til 72 timer.Bring derefter bakkerne til biosikkerhedsskabet og opsug doseringsmediet fra alle reservoirerne. Vask og udskift det øverste indløbsreservoir med varmt avanceret DMEM F12-medium og bundreservoiret med endotelcellevækstmedium. Udskift vaskemediet med en milliliter sondesubstratopløsning.Perfuse chipsene med en høj strømningshastighed på 1.000 mikroliter i timen i fem minutter og opsug både top- og bundudløbsreservoirer. Returner chipsene til kulturmodulet og inkuberes i en time under en konstant strøm på 300 mikroliter i timen. Efter en times behandling skal du stoppe strømmen og bringe bakkerne til biosikkerhedsskabet.Saml 100 mikroliter spildevand fra det øverste udløbsreservoir og tilsæt det til et rør indeholdende 200 mikroliter stopopløsning. Læg straks rørene på tøris og opbevar prøverne ved minus 80 grader Celsius. Vask begge kanaler med 200 mikroliter steril DPBS.Bloker derefter bundkanaludgangen med en 200 mikroliter filterpipettespids. Perfuse 50 mikroliter af dissociationsopløsningen gennem bundkanalen og inkuberes i to minutter ved stuetemperatur. Sørg for fuldstændig løsrivelse af endotelcellerne, og fjern dissociationsopløsningen fra kanalen ved pipettering.Gentag vasken. Bloker derefter den øverste kanaludgang og perfuse 75 mikroliter proteinlysebuffer. Lad pipettespidsen sidde og inkuberes i fem minutter ved stuetemperatur.Saml cellelysaterne i et 1,5 milliliter rør ved at pipettere fem til 10 gange. Gentag perfusion og opsamling for at opnå fuldstændig løsrivelse af celler og opbevar lysaterne ved minus 80 grader Celsius indtil analyse. For RNA-lysis skal du følge den samme procedure, mens du bruger 150 mikroliter RNA-lysisbuffer.Først fremstilles en interferon gammadoseringsopløsning ved fortynding af stamopløsningerne i afgasset endotelcellevækstmedium. I biosikkerhedsskabet fjernes mediet fra bundkanalens indløbsreservoirer og udskiftes det med tre milliliter doseringsopløsning dagligt. Placer derefter bakkerne i kulturmodulet og perfuser chipsene med en høj strømningshastighed på 1.000 mikroliter i timen i fem minutter.Skift strømningshastigheden til 60 mikroliter i timen og fortsæt den flydende kultur. Tilsæt 100 mikroliter DPBS pr. Brønd i en 96-brønds sortvægget plade. Ved hjælp af en flerkanalspipette tilsættes 50 mikroliter af spildevandet fra alle reservoirerne til de respektive brønde.For at forberede en standardkurve udføres en tredobbelt fortynding af mediet indeholdende 100 mikrogram pr. milliliter tre kilodalton dextran kaskadeblå i DPBS. Udfør derefter serielle vrangforestillinger ved hjælp af en tredobbelt fortynding af endotelcellevækstmedium i DPBS. Forskellige morfologiske træk ved tolvfingertarmen og tyktarmschips blev fremhævet af tilstedeværelsen af de villi-lignende formationer i tolvfingertarmschippen, der repræsenterer tyndtarmens arkitektur.I tolvfingertarmschippen udsat for cytokrom P450-inducerer rifampicin og vitamin D3 var der et forhøjet mRNA-genekspression for det lægemiddelmetaboliserende enzym cytokrom P450 3A4 og forbedret katalytisk aktivitet af cytokrom P450-enzymet, hvilket indikerer passende induktionsresponser på tværs af alle tre organoiddonorer. Ved behandling af epitelmonolaget af tyktarmschippen med interferon gamma blev kompromitteret cellemorfologi og tab af det søjleformede epitel observeret. Behandling med interferon gamma førte også til øget cytoplasmatisk signal af tætte og klæbende junctionproteiner sammenlignet med køretøjskontrol, hvilket viste forskydning af tætte krydsmarkører ZO-1 og claudin 4 og internalisering af occludin og E-cadherin.En signifikant stigning i epitelens paracellulære permeabilitet blev observeret efter 48 timers interferon gammastimulering på tyktarmschips. Tilsvarende inducerer interferon gamma aktivering af apoptose indikeret ved stigning i det intracellulære indhold af den spaltede Caspase 3. Interferon gamma inducerede en polariseret sekretion af proinflammatoriske molekyler i tyktarmschippen som vist ved den basolaterale sekretion af VCAM-1 og interleukin-6 og den apikale sekretion af ICAM-1 og serumamyloidprotein A.For en vellykket tarmchipkultur bør man anvende udifferentierede organoider og følge instruktionerne for fragmentering og såningstæthed.Efter vellykket etablering af tarmchippen kan vi studere tarmabsorption, transport og metabolisme, næringsstofniveauer og tarmhormonsekretion, værtsmikrobepatogeninteraktioner, lægemiddelsikkerhed og effektivitet, patientspecifikke sygdomsmekanismer og reaktioner på terapier.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menneskelige bruskvæv Fabrication Brug Tre-dimensionel Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Real Time Overvågning af intracellulære Bile Acid Dynamics Ved hjælp af en genetisk indkodede FRET-baserede Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Udvikling af en flercellet Tre-dimensionel organotypisk Model af menneskelige tarmslimhinden Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

En protokol til multipel gen-knockout i mus-små tarmorganoider ved anvendelse af en CRISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

Anvende avancerede In Vitro dyrkning teknologi for at studere den menneskelige Gut mikrobiota

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases

Humane neurale Organoider til at studere hjernekræft og neurodegenerative sygdomme

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

En kvantitativ Fluorescens mikroskopi-baseret enkelt Liposome-analyse til påvisning af den kompositoriske Inhomogenitet mellem individuelle Liposomer

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

In Vitro Model af Human Kutan hypertrofisk ardannelse ved hjælp af makromolekylære fortrængning

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Skalerbar generation af modne cerebellar organoider fra humane pluripotente stamceller og karakterisering ved immunstaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...