Name: combining human organoids and organ-on-a-chip technology to model intestinal region-specific functionality
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality at JoVE.com

We bedanken professor Mark Donowitz voor het leveren van de van darmbiopsie afgeleide organoïden en Brett Clair voor het ontwerpen van de wetenschappelijke illustraties van de chip-, draagbare en kweekmodule. Alle andere wetenschappelijke illustraties zijn gegenereerd met behulp van de BioRender.

OPMERKING: Alle celculturen moeten worden behandeld met behulp van een juiste aseptische techniek.
De menselijke darmorganoïden die in deze studie werden gebruikt, werden verkregen van de Johns Hopkins University en alle methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met goedgekeurde richtlijnen en voorschriften. Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Johns Hopkins University Institutional Review Board (IRB #NA 00038329).
1. Bereiding van de...

<ol>
	<li>Fritz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+clinically+relevant+drug-metabolizing+enzymes+along+the+human+intestine+and+their+correlation+to+drug+transporters+and+nuclear+receptors:+An+intra-subject+analysis.">Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).</li><li>Okumura, R., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+intestinal+homeostasis+by+mucosal+barriers.">Maintenance of intestinal homeostasis by mucosal barriers.</a> Inflammation and Regeneration. 38 (1), 1-8 (2018).</li><li>Delgado, M. E., Grabinger, T., Brunner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+at+the+intestinal+epithelial+front+line.">Cell death at the intestinal epithelial front line.</a> FEBS Journal. 283 (14), 2701-2719 (2016).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+Differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology.</a> The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caco-2+cell+monolayer:+Usefulness+and+limitations.">The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+human+mini-intestines+to+the+study+of+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">The contributions of human mini-intestines to the study of intestinal physiology and pathophysiology.</a> Annual Review of Physiology. 79, 291-312 (2017).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett&#8217;s+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett&#8217;s epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).</li><li>Durel, J. F., Nerurkar, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+vertebrate+gut+morphogenesis.">Mechanobiology of vertebrate gut morphogenesis.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 63, 45-52 (2020).</li><li>Gayer, C. P., Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+mechanical+forces+on+intestinal+physiology+and+pathology.">The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology.</a> Cellular Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+activates+Piezo1+to+promote+mucin2+expression+in+goblet+cells.">Mechanical stimulation activates Piezo1 to promote mucin2 expression in goblet cells.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology (Australia). 36 (11), 3127-3139 (2021).</li><li>Navabi, N., McGuckin, M. A., Lind&#233;n, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+cell+lines+form+polarized+epithelia+with+an+adherent+mucus+layer+when+cultured+in+semi-wet+interfaces+with+mechanical+stimulation.">Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation.</a> PLoS One. 8 (7), 68761 (2013).</li><li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+human+Small+Intestine-on-a-Chip+using+biopsy-derived+organoids.">Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duodenum+intestine-chip+for+preclinical+drug+assessment+in+a+human+relevant+model.">Duodenum intestine-chip for preclinical drug assessment in a human relevant model.</a> eLife. 9, 50135 (2020).</li><li>Apostolou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microphysiological+colon+platform+to+decipher+mechanisms+driving+human+intestinal+permeability.">A novel microphysiological colon platform to decipher mechanisms driving human intestinal permeability.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (5), 1719-1741 (2021).</li><li>Jalili-Firoozinezhad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Author+correction:+A+complex+human+gut+microbiome+cultured+in+an+anaerobic+intestine-on-a-chip.">Author correction: A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 583 (2019).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+enhances+differentiation+of+jejunal+human+enteroids+in+Intestine-Chip.">Fluid shear stress enhances differentiation of jejunal human enteroids in Intestine-Chip.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), 258-271 (2021).</li><li>Sontheimer-Phelps, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon-on-a-chip+enables+continuous+in+vitro+analysis+of+colon+mucus+layer+accumulation+and+physiology.">Human colon-on-a-chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).</li><li>Tovaglieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+enhancement+of+enterohemorrhagic+E.+coli+pathogenesis+mediated+by+microbiome+metabolites.">Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites.</a> Microbiome. 7 (1), 43 (2019).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+human+organs-on-chips.">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).</li><li>Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genetic+engineering+of+human+intestinal+organoids+using+electroporation.">Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).</li><li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow.">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).</li><li>Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+motility:+From+bench+side+to+bedside.">Colonic motility: From bench side to bedside.</a> Morgan &amp; Claypool Life Sciences. , (2010).</li><li>Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradigms+for+mechanical+signal+transduction+in+the+intestinal+epithelium+-+category:+Molecular,+cell,+and+developmental+biology.">Paradigms for mechanical signal transduction in the intestinal epithelium - category: Molecular, cell, and developmental biology.</a> Digestion. 68 (4), 217-225 (2003).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression.">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> The American Journal of Pathology. 166 (2), 409-419 (2005).</li><li>Nava, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-&#947;+regulates+intestinal+epithelial+homeostasis+through+converging+&#946;-Catenin+signaling+pathways.">Interferon-&#947; regulates intestinal epithelial homeostasis through converging &#946;-Catenin signaling pathways.</a> Immunity. 32 (3), 392-402 (2010).</li><li>Madara, J. L., Stafford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-&#947;+directly+affects+barrier+function+of+cultured+intestinal+epithelial+monolayers.">Interferon-&#947; directly affects barrier function of cultured intestinal epithelial monolayers.</a> Journal of Clinical Investigation. 83 (2), 724-727 (1989).</li><li>Bruewer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+cytokines+disrupt+epithelial+barrier+function+by+apoptosis-independent+mechanisms.">Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms.</a> The Journal of Immunology. 171 (11), 6164-6172 (2003).</li><li>Jones, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+in+inflammatory+bowel+disease.">Adhesion molecules in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 36 (5), 724-730 (1995).</li><li>Uhlar, C. M., Whitehead, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+amyloid+A,+the+major+vertebrate+acute-phase+reactant.">Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant.</a> European Journal of Biochemistry. 265 (2), 501-523 (1999).</li><li>P&#233;rez-Gonz&#225;lez, C., Ceada, G., Matej&#269;i&#263;, M., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digesting+the+mechanobiology+of+the+intestinal+epithelium.">Digesting the mechanobiology of the intestinal epithelium.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 72, 82-90 (2022).</li><li>In, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterohemorrhagic+escherichia+coli+reduces+mucus+and+intermicrovillar+bridges+in+human+stem+cell-derived+colonoids.">Enterohemorrhagic escherichia coli reduces mucus and intermicrovillar bridges in human stem cell-derived colonoids.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (1), 48-62 (2016).</li><li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+organ-on-chip+reveals+intestinal+microenvironment+and+mechanical+forces+impacting+shigella+infection.">Bioengineered human organ-on-chip reveals intestinal microenvironment and mechanical forces impacting shigella infection.</a> Cell Host and Microbe. 26 (3), 435-444 (2019).</li><li>Kerns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunocompetent+organ-on-chip+platforms+allow+safety+profiling+of+tumor-targeted+t-cell+bispecific+antibodies.">Human immunocompetent organ-on-chip platforms allow safety profiling of tumor-targeted t-cell bispecific antibodies.</a> eLife. 10, 67106 (2021).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+engineering+human+pathophysiology+with+organs-on-chips.">Reverse engineering human pathophysiology with organs-on-chips.</a> Cell. 164 (6), 1105-1109 (2016).</li></ol>

De combinatie van organ-on-a-chip-technologie en intestinale organoïden is veelbelovend voor nauwkeurige modellering van menselijke darmfysiologie en pathofysiologie. Hier bieden we een eenvoudig en robuust stapsgewijs protocol (beschreven in figuur 1) voor het vaststellen van de darmchip met biopsie-afgeleid klein darm- of colonepitheel en intestinale microvasculaire endotheelcellen die samen worden gekweekt in een microfluïdisch apparaat. Deze chipgebaseerde simulatie van de menselijke d...

De menselijke darm is een complex en multitaskend orgaan dat in staat is tot zelfregeneratie. Het is verdeeld in de dunne en dikke darm. De primaire functie van de dunne darm is om voedsel uit de maag verder te verteren, alle voedingsstoffen te absorberen en het residu door te geven aan de dikke darm, die het water en de elektrolyten terugwint. De dunne darm is verder verdeeld in meerdere anatomisch verschillende regio's: de twaalfvingerige darm, jejunum en ileum, die elk zijn aangepast om specifieke functies uit te voeren. De twaalfvingerige darm helpt bijvoorbeeld bij het afbreken van de chyme (maaginhoud) om de juiste opname van voedingsstoffen met eiwitten, koolhydraten, vitamines en mineralen in het jejunum mogelijk te maken. Dit proximale deel van de dunne darm is ook de belangrijkste plaats van intestinale geneesmiddelabsorptie en -metabolisme, en het wordt gekenmerkt door de hogere expressie van geneesmiddel-metaboliserende enzymen (bijv. CYP3A4) in vergelijking met hun expressie in het ileum en colon1. Naast zijn belangrijkste rol bij het verteren en absorberen van voedingsstoffen, is de darm ook een effectieve barrière tegen potentieel schadelijke luminale inhoud, zoals pathogene micro-organismen, microbiële metabolieten, voedingsantigenen en toxines 2,3. Het is opmerkelijk dat de menselijke dikke darm wordt bewoond door een groot aantal micro-organismen, die veel groter zijn dan die van totale cellen in het menselijk lichaam, die veel voordelen bieden voor voeding, metabolisme en immuniteit. Daarom is het behoud van de integriteit van de mucosale barrière gevormd door intestinale epitheelcellen van cruciaal belang voor het mogelijk maken van de symbiotische relatie tussen de darmmicrobiota en de gastheercellen door ze fysiek te scheiden om onnodige activering van immuuncellen te voorkomen2. Bovendien speelt geprogrammeerde darmceldood een essentiële rol als een zelfbeschermend mechanisme dat voorkomt dat geïnfecteerde cellen blijven bestaan of zich vermenigvuldigen - waardoor potentiële pathogenen worden verspreid3 - terwijl de voortdurende zelfvernieuwing van het darmepitheel om de vier tot zeven dagen compenseert voor het celverlies dat de integriteit van de barrière en weefselhomeostase garandeert. Aantastingen van beschreven darmfuncties, waaronder opname van voedingsstoffen, barrière-integriteit of onbalans in darmceldood en zelfvernieuwing, kunnen leiden tot de ontwikkeling van een reeks gastro-intestinale stoornissen, waaronder ondervoeding en inflammatoire darmziekte (IBD)2,3.
Eerder werden diermodellen en getransformeerde van kanker afgeleide darmcellijnen gebruikt om de fysiologische en pathofysiologische functies van menselijk darmweefsel te bestuderen. Steeds prominentere zorgen over de vertaalbaarheid van dieronderzoek naar mensen, veroorzaakt door de aanwezigheid van aanzienlijke verschillen tussen de twee soorten, wezen echter op de behoefte aan voor de mens relevante alternatieve methoden4. De meest gebruikte in vitro darmcellijnen omvatten T84-, Caco-2- en HT29-cellen. Hoewel ze bepaalde aspecten van de darmbarrièrefunctie en het membraantransport nabootsen, worden ze gekenmerkt door een veranderde expressie van geneesmiddelmetaboliserende enzymen5, oppervlaktereceptoren en transporters4. Bovendien missen ze darmsegmentspecificiteit en slagen ze er niet in om de complexiteit van het darmepitheel te recapituleren, waarbij elk model slechts één van de vijf epitheelceltypen bevat die in de darm aanwezig zijn6.
Onlangs werden menselijke intestinale organoïde culturen die zijn vastgesteld uit verse biopsieën van de dunne darm en dikke darm 7,8 of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)9 geïntroduceerd als alternatieve experimentele modellen met potentieel om dierproeven in de toekomst aan te vullen, te verminderen en misschien te vervangen. Hoewel iPSC's op een niet-invasieve manier kunnen worden verkregen, vereist het vaststellen van organoïden uit iPSC's het gebruik van complexe en langdurige protocollen (met verschillende experimentele stappen) en genereert het culturen die lijken op menselijk foetaal weefsel. Biopsie-afgeleide organoïden zijn daarentegen zeer schaalbaar, omdat ze gebruik kunnen maken van de inherente vernieuwingscapaciteit van darmweefsel en voor onbepaalde tijd in vitro kunnen worden gepasseerd en vermeerderd. Belangrijk is dat van biopsie afgeleide organoïden de ziekte- en darmregiospecifieke kenmerken van het primaire weefsel waaruit ze zijn ontwikkeld, behouden en de cellulaire diversiteit van het darmepitheel nabootsen. Organoïden kunnen in vitro worden gebruikt als patiëntspecifieke avatars om de biologie en pathogenese van verschillende gastro-intestinale aandoeningen te ontrafelen en hun therapeutisch beheer te verbeteren. Hoewel intestinale organoïden een indrukwekkende mate van fysiologische functionaliteit hebben bereikt, slagen ze er nog steeds niet in om de complexiteit van de inheemse organen te reproduceren vanwege hun gebrek aan kritieke stromale componenten - waaronder bloedvaten, bindweefsel, perifere zenuwen en immuuncellen - evenals mechanische stimulatie. Van mechanische parameters, zoals stroming, schuifspanning, rek en druk, is bekend dat ze de morfogenese en homeostase van weefsel in vivo beïnvloeden en eerder werd aangetoond dat ze de rijping van cellen in vitro verbeteren 10,11,12,13. Een bijkomend belangrijk nadeel van organoïde systemen is de ontoegankelijkheid van het lumen en dus van de apicale kant van het epitheel. Dit vormt een uitdaging voor het onderzoeken van verschillende mechanismen die verband houden met de gepolariseerde expressie van ionen- en medicijntransporters, interacties tussen gastheer en microbioom en farmaceutische toxiciteitstests. Ten slotte lijden organoïde culturen aan aanzienlijke variabiliteit in grootte, morfologie en functie, als gevolg van de stochastische aard van het in vitro zelforganisatieproces en de keuzes voor het lot van cellen. Daarom, om het volledige potentieel van intestinale organoïden in ziektemodellering, medicijnscreening en regeneratieve geneeskunde te realiseren, is het noodzakelijk om nieuwe strategieën te verkennen die de variabiliteit in organoïde ontwikkeling verminderen, de toegang tot het luminale compartiment verbeteren en ontbrekende cel-celinteracties opnemen.
Organ-on-a-Chip-technologie heeft veel technieken geïntroduceerd voor de integratie van mechanische krachten en vloeistofstroom in darmcelculturen in vitro. Omdat de meeste van de eerste proof-of-concept studies echter van kanker afgeleide cellijnen hebben gebruikt die niet voldoende cellulaire diversiteit vertoonden, is de relevantie van deze systemen in twijfel getrokken. Onlangs hebben we synergetisch intestinale organoïden en organ-on-a-chip-technologie gecombineerd om de beste kenmerken van elke aanpak in één in vitro systeem op te nemen 14,15,16. De resulterende darm-chip recapituleert de meercellige architectuur van het darmepitheel, de aanwezigheid van de epitheliaal-endotheelweefselinterface en de mechanische krachten van vloeistofstroom en -stretch, waardoor emulatie van functies op orgaanniveau in vitro mogelijk wordt. Bovendien verhoogt het gebruik van van primair weefsel afgeleide organoïden (die kunnen worden bemonsterd uit verschillende regio's van de menselijke darm) als uitgangsmateriaal de veelzijdigheid van dit model, omdat chips die menselijke twaalfvingerige darm, jejunum, ileum en colon vertegenwoordigen, kunnen worden vastgesteld na vergelijkbare zaai- en kweekprocedures. Belangrijk is dat Intestine-Chips real-time beoordeling mogelijk maken van: de integriteit van de darmbarrière; activiteit van de borstelrand en enzymen voor het geneesmiddelmetabolisme; productie van mucines; secretie van cytokines; en interactie van darmcellen met pathogene en commensale micro-organismen, zoals aangetoond in de eerder gepubliceerde rapporten. Met name toen darmchips werden vastgesteld met behulp van organoïden gegenereerd uit het weefsel van verschillende individuen, legden deze modellen de verwachte interdonorvariabiliteit vast in de functionele reacties op verschillende geneesmiddelen en behandelingen. Al met al opent het samenvoegen van organoïden met Organ-on-a-Chip-technologie de deur naar meer geavanceerde, gepersonaliseerde, in vivo relevante modellen die de fysiologische relevantie en nauwkeurigheid van de in vitro bevindingen kunnen verbeteren, evenals hun extrapolatie naar mensen. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor het vaststellen van de darmchip en de toepassing ervan in de studies van fysiologische functies van de twee darmsegmenten: twaalfvingerige darm en dikke darm. Ten eerste worden de methoden beschreven voor het beoordelen van de activiteit van het geneesmiddel-metaboliserende enzym CYP3A4 in de twaalfvingerige darmchip, evenals de inductie ervan door prototypische verbindingen zoals rifampicine en vitamine D3. Ten tweede worden de stappen die nodig zijn om "lekkende darm" in de darmchip te modelleren beschreven in het protocol, waarbij de verstoring van de epitheliale barrière wordt uitgevoerd met behulp van kenmerkende cytokines die betrokken zijn bij de pathogenese van de IBD. Kortom, organoïden afgeleid van menselijke biopsieën worden in vitro vermeerderd, onderworpen aan enzymatische spijsvertering en geïntroduceerd in het bovenste kanaal van de chip. In aanwezigheid van continue perfusie met groeifactorverrijkte media ontwikkelen ze zich tot een confluente epitheliale monolaag met 3D-architectuur en een gemakkelijk toegankelijk apicale celoppervlak. Het onderste, "vasculaire" chipcompartiment is bezaaid met microvasculaire endotheelcellen geïsoleerd uit de dunne of dikke darm. Het epitheel en endotheel worden gescheiden door een poreus rekbaar membraan, dat de paracriene interacties tussen de twee weefsels vergemakkelijkt en, wanneer het wordt blootgesteld aan cyclische vervormingen, peristaltiekachtige bewegingen van de menselijke darm emuleert. De cocultuur wordt gehandhaafd onder de dynamische stroomomstandigheden die worden gegenereerd door luminale en vasculaire perfusie met geschikte celkweekmedia. Ten slotte beschrijven we tal van soorten assays en eindpuntanalyses die direct op de chip of uit bemonsterde celkweek effluenten kunnen worden uitgevoerd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>AlphaBioRegen</td>
			<td>ALHE15</td>
			<td>0.5 cells M/ml ; cryopreserved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>AlphaBioRegen</td>
			<td>ALHE16</td>
			<td>0.5 cells M/ml ; cryopreserved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy-derived Human Duodenal Organoids</td>
			<td>John Hopkin&#39;s University</td>
			<td>-</td>
			<td>The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy-derived Human Colonic Organoids</td>
			<td>John Hopkin&#39;s University</td>
			<td>-</td>
			<td>The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zo&#235; CM-1&#8482;&#160;Culture Module</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Culture module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orb-HM1&#8482;&#160;Hub Module</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>5% CO2, vacuum stretch, and power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1&#8482; Stretchable Chip</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pod&#8482; Portable Modules</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Portable module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Light Box</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip Cradle</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>1 per square culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip&#174;-HV Filters</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SE1M003M00</td>
			<td>0.45&#160;&#956;m&#160;PVDF filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82051-068</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld&#160;vacuum&#160;aspirator</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4930</td>
			<td>&#160;-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating&#160;pipettes</td>
			<td>Corning / Falcon</td>
			<td>357558</td>
			<td>2 mL,&#160;polystyrene, individually&#160;wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating tips</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
			<td>Sterile (autoclaved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological&#160;pipettes</td>
			<td></td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>2 mL, 5 mL,&#160;10 mL,&#160;and&#160;25 mL&#160;low endotoxin, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>P20, P200,&#160;P1000&#160;and standard multichannel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette&#160;tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>P20, P200,&#160;and&#160;P1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes&#160;(Protein&#160;LoBind&#174; Tubes)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030122216;&#160;0030122240</td>
			<td>15 mL, 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Tubes&#174;&#160;lo-bind</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431081</td>
			<td>1.5 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells black walled plate</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for epithelial permeability analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (with camera)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For bright-field&#160;imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (or beads)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Set to 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum set-up</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>-</td>
			<td>Minimum&#160;pressure: -70 kPa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>220033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td>Cell culture flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent-1&#160;(ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Chip coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent-2&#160;(ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Chip coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS&#160;(DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25055CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93595</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TryplE&#160;Express</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Organoids&#160;dissociation&#160;and endothelium cells&#160;detachment&#160;solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult&#8482; Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>Organoid Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22121</td>
			<td>Endothelial medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin&#8482;&#160;</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ANT-PM-1</td>
			<td>antimicrobial agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment Factor&#8482;</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>4Z0-210</td>
			<td>coating solution for flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - Growth Factor Reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Solubilized basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>ECM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>ECM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td>organoid media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-10</td>
			<td>organoid media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>Basement mebrane matrix dissociationsolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9576</td>
			<td>30%, Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25055CV</td>
			<td>Sterile, Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3KDa Dextran Cascade Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D7132</td>
			<td>10 mg powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin (RIF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# R3501</td>
			<td>CYP inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testosterone hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1500</td>
			<td>CYP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# D1530</td>
			<td>CYP inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>159002</td>
			<td>LCMS stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>157-4</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>566460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Occludin</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Claudin 4</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>36-4800</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-E-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1416</td>
			<td>epithelial adherens junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VE-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33168</td>
			<td>endothelial adherent junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>339194</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12183020</td>
			<td>RNA lysis, isolation and purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript&#8482; IV VILO&#8482; Master Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11756050</td>
			<td>reverse transcriptase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan&#8482; Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444557</td>
			<td>qPCR reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio&#8482; 5 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A28573</td>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs99999901_s1</td>
			<td>Eukaryotic 18S rRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP3A4 primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs00604506_m1</td>
			<td>Cytochrome&#160; family 3 subfamily A member 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23236</td>
			<td>Protein quantification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Tris lysis buffer</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R60TX-3</td>
			<td>Protein lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved/Total Caspase-3 Whole Cell Lysate Kit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15140D</td>
			<td>Caspase 3 detection kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15198D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex)</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15053D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>20X long-distance objective lenses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AXIOvert.A1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Brightfield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>10X objective lenses</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining human organoids and organ-on-a-chip technology to model intestinal region-specific functionality

Het darmslijmvlies is een complexe fysieke en biochemische barrière die een groot aantal belangrijke functies vervult. Het maakt het transport, de absorptie en het metabolisme van voedingsstoffen en xenobiotica mogelijk, terwijl het een symbiotische relatie met microbiota vergemakkelijkt en de invasie van micro-organismen beperkt. Functionele interactie tussen verschillende celtypen en hun fysieke en biochemische omgeving is van vitaal belang om de homeostase van darmweefsel tot stand te brengen en te behouden. Het modelleren van deze complexe interacties en geïntegreerde darmfysiologie in vitro is een formidabel doel met het potentieel om de manier waarop nieuwe therapeutische doelen en kandidaat-geneesmiddelen worden ontdekt en ontwikkeld te transformeren.
Organoïden en Organ-on-a-Chip-technologieën zijn onlangs gecombineerd om voor de mens relevante darmchips te genereren die geschikt zijn voor het bestuderen van de functionele aspecten van darmfysiologie en pathofysiologie in vitro. Organoïden afgeleid van de biopten van de kleine (twaalfvingerige darm) en dikke darm worden gezaaid in het bovenste compartiment van een orgaanchip en breiden vervolgens met succes uit als monolagen met behoud van de verschillende cellulaire, moleculaire en functionele kenmerken van elk darmgebied. Menselijke darmweefselspecifieke microvasculaire endotheelcellen worden opgenomen in het onderste compartiment van de orgaanchip om de epitheliaal-endotheelinterface te recreëren. Dit nieuwe platform vergemakkelijkt luminale blootstelling aan voedingsstoffen, geneesmiddelen en micro-organismen, waardoor studies van darmtransport, permeabiliteit en gastheer-microbe-interacties mogelijk worden.
Hier wordt een gedetailleerd protocol verstrekt voor de oprichting van darmchips die de menselijke twaalfvingerige darm (twaalfvingerige darmchip) en dikke darm (colonchip) vertegenwoordigen, en hun daaropvolgende cultuur onder continue stroom en peristaltiekachtige vervormingen. We demonstreren methoden voor het beoordelen van medicijnmetabolisme en CYP3A4-inductie in duodeenchip met behulp van prototypische inductoren en substraten. Ten slotte bieden we een stapsgewijze procedure voor de in vitro modellering van interferon gamma (IFNγ) -gemedieerde barrièreverstoring (leaky gut syndrome) in een darmchip, inclusief methoden voor het evalueren van de verandering van paracellulaire permeabiliteit, veranderingen in cytokinesecretie en transcriptomische profilering van de cellen in de chip.

Figuur 1D vat de tijdlijn van de darmchipcultuur samen en illustreert de intestinale endotheelcellen en organoïden voor en bij het zaaien op de chip. Bovendien toont het de duidelijke morfologische verschillen tussen de twaalfvingerige darm en de darmchips, benadrukt door de aanwezigheid van de villi-achtige formaties in de twaalfvingerige darmchip en representatief voor de dunne darmarchitectuur.
Figuur 3A,B toont d...

Watch this Scientific Journal Video about Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality at JoVE.com

Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

Biopsie-afgeleide intestinale organoïden en organ-on-a-chips technologieën worden gecombineerd in een microfysiologisch platform om regiospecifieke darmfunctionaliteit te recapituleren.

Het combineren van menselijke organoïden en organ-on-a-chip-technologie om intestinale regiospecifieke functionaliteit te modelleren

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

Dit protocol laat zien hoe biopsie-afgeleide intestinale organoïden en organ-on-a-chip-technologie kunnen worden gebruikt om een fysiologisch relevante darmchip te genereren die vervolgens kan worden gebruikt om farmacokinetiek en geneesmiddelinteractie te voorspellen en om intestinale epitheliale barrièredisfunctie te bestuderen. Door organoïden te verenigen in organ-on-a-chip-technologie kunnen we de complexiteit van het darmepitheel reproduceren. Bovendien maakt het een grotere experimentele controle van de mechanische signalen, stroomverdeling en biochemische gradiënten mogelijk.Deze methode emuleert de complexe fysiologie van de menselijke darm en geeft een beter begrip van de cellulaire en moleculaire basis van normale en pathologische darmfuncties. Dit helpt om farmacokinetiek en farmacodynamiek en potentiële kandidaat-geneesmiddelen beter te voorspellen om ontstekingsschade te voorkomen. Seeding is een cruciale stap in het protocol.Overmatige fragmentatie of onnauwkeurige zaaidichtheid van de intestinale organoïde fragmenten kan de ontwikkeling en differentiatie van de epitheliale barrière in gevaar brengen. Om te beginnen, aspirateer het medium uit de statische organoïde cultuur. Herstel media uit voldoende putten om een uiteindelijke zaaidichtheid van acht miljoen cellen per milliliter te bereiken.Voeg 500 microliter ijskoude BMM-dissociatieoplossing toe aan elke put en bevestig de opgeloste BMM van het putoppervlak. Verzamel de suspensie in een 15 milliliter eiwitarme bindingsbuis en plaats deze op ijs. Schud de tube voorzichtig om de 15 minuten gedurende een uur.Centrifugeer op 300 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius om een organoïde pellet te verkrijgen. Als een transparante gellaag boven de pellet wordt waargenomen, aspirateer oplossing uit de buis. Resuspendeer de pellet en voeg een gelijk volume BMM-dissociatieoplossing toe.Incubeer gedurende 10 minuten op ijs en centrifugeer. Herhaal dit totdat er geen opgeloste BMM-residuen aanwezig zijn. Gooi vervolgens het supernatant weg en resuspeneer de pellet in twee milliliter organoïde verteringsoplossing.Incubeer de buis bij 37 graden Celsius gedurende één tot drie minuten en voeg acht milliliter geavanceerde DMEM F12 toe om de enzymatische reactie te stoppen. Centrifugeer en resuspendeer de pellet in volledig organoïde groeimedium om acht miljoen cellen per milliliter te bereiken. Aliquot 360 microliter in steriele 1,5 milliliter eiwitarme bindingsbuizen.Verwijder vervolgens het medium uit het bovenste kanaal van de gecoate chips en voeg 30 microliter van de celsuspensie toe. Incubeer de chips 's nachts bij 37 graden Celsius om de organoïde fragmenten aan het membraan te hechten. Voeg drie milliliter vooraf gebalanceerd volledig organoïde groeimedium toe aan het bovenste inlaatreservoir en drie milliliter pre-equilibrated endotheelcelgroeimedium in het onderste inlaatreservoir.Voeg 300 microliter van hetzelfde medium toe in de respectievelijke bovenste en onderste uitlaatreservoirs. Breng de lade met de draagbare modules over in de kweekmodule. Voer op de kweekmodule herhaaldelijk de prime-cyclus uit totdat er voldoende druppels zijn gevormd om de chips met succes te verbinden.Schuif vervolgens de chipdrager in de draagbare module. Start vervolgens de twee uur durende regelcyclus om de kweekmedia in de draagbare module en chip onder druk te zetten, waarna de geprogrammeerde omstandigheden worden hervat. Wijzig vervolgens de stretchinstellingen en start de cultuurmodule.Herhaal na 24 uur de cyclus met 10% stretch en dezelfde frequentie. Om doseermedia of voertuigcontrole voor te bereiden, verdunt u de CYP-inductor stockoplossingen of DMSO in volledig organoïde groeimedium en endotheelcelgroeimedium. Pauzeer de kweekmodule en breng de trays naar de bioveiligheidskast.Vervang de media in alle inlaat- en uitlaatreservoirs door twee milliliter doseermedia door inductoren of voertuigbesturing. Breng de draagbare modules terug naar de kweekmodule en start de stroom opnieuw met 30 microliter per uur. Vervang de media elke 24 uur door een vers bereide inducerende oplossing en zet de cultuur 48 tot 72 uur voort.Breng vervolgens de trays naar de bioveiligheidskast en haal het doseermedium uit alle reservoirs. Was en vervang het bovenste inlaatreservoir door warm geavanceerd DMEM F12-medium en het onderste reservoir door endotheelcelgroeimedium. Vervang het wasmedium door één milliliter sondesubstraatoplossing.Perfuseer de chips met een hoog debiet van 1.000 microliter per uur gedurende vijf minuten en adem zowel de bovenste als de onderste uitlaatreservoirs aan. Breng de chips terug naar de kweekmodule en incubeer gedurende een uur onder een constante stroom van 300 microliter per uur. Stop na een uur behandeling de stroom en breng de trays naar de bioveiligheidskast.Verzamel 100 microliter effluent uit het bovenste uitlaatreservoir en voeg het toe aan een buis met 200 microliter stopoplossing. Plaats de buisjes direct op droogijs en bewaar de monsters bij min 80 graden Celsius. Was beide kanalen met 200 microliter steriele DPBS.Blokkeer vervolgens de onderste kanaaluitlaat met een filterpipetpunt van 200 microliter. Perfuseer 50 microliter van de dissociatieoplossing door het onderste kanaal en incubeer gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Zorg voor volledige loslating van de endotheelcellen en verwijder de dissociatieoplossing uit het kanaal door te pipetteren.Herhaal de wasbeurt. Blokkeer vervolgens de bovenste kanaaluitlaat en perfuseer 75 microliter eiwitlysisbuffer. Laat de pipetpunt inbrengen en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Verzamel de cellysaten in een buis van 1,5 milliliter door vijf tot 10 keer te pipetteren. Herhaal perfusie en verzameling om volledige loslating van cellen te verkrijgen en bewaar de lysaten bij min 80 graden Celsius tot analyse. Voor RNA-lysis volgt u dezelfde procedure terwijl u 150 microliter RNA-lysisbuffer gebruikt.Bereid eerst een interferon gammadoseringsoplossing door de stamoplossingen in ontgast endotheelcelgroeimedium te verdunnen. Verwijder in de bioveiligheidskast het medium uit de onderste kanaalinlaatreservoirs en vervang het dagelijks door drie milliliter van de doseeroplossing. Plaats vervolgens de trays in de kweekmodule en perfuseer de chips met een hoog debiet van 1.000 microliter per uur gedurende vijf minuten.Schakel het debiet naar 60 microliter per uur en zet de vloeistofcultuur voort. Voeg 100 microliter DPBS per put toe aan een 96-well zwartwandige plaat. Gebruik een meerkanaals pipet om 50 microliter effluent van alle reservoirs aan de respectieve putten toe te voegen.Om een standaardcurve voor te bereiden, voert u een drievoudige verdunning uit van het medium met 100 microgram per milliliter van drie kilodalton dextran cascade blauw in DPBS. Voer vervolgens seriële wanen uit met behulp van een drievoudige verdunning van endotheelcelgroeimedium in DPBS. Duidelijke morfologische kenmerken van de twaalfvingerige darm en darmchips werden benadrukt door de aanwezigheid van de villi-achtige formaties in de twaalfvingerige darmchip die de architectuur van de dunne darm vertegenwoordigen.In de twaalfvingerige darmchip blootgesteld aan de cytochroom P450-inductoren rifampicine en vitamine D3, was er een verhoogde mRNA-genexpressie voor het geneesmiddel metaboliserend enzym cytochroom P450 3A4 en verhoogde katalytische activiteit van het cytochroom P450-enzym, wat wijst op geschikte inductieresponsen bij alle drie de organoïde donoren. Bij de behandeling van de epitheliale monolaag van de darmchip met interferon gamma werden gecompromitteerde celmorfologie en verlies van het zuilvormige epitheel waargenomen. Ook leidde behandeling met interferon gamma tot een verhoogd cytoplasmatisch signaal van strakke en adherente junctie-eiwitten in vergelijking met voertuigcontrole, met de verplaatsing van tight junction markers ZO-1 en claudin 4 en internalisatie van occludin en E-cadherine.Een significante toename van de epitheliale paracellulaire permeabiliteit werd waargenomen na 48 uur interferon gammastimulatie op darmchips. Evenzo induceert interferon gamma activering van apoptose aangegeven door toename van het intracellulaire gehalte van het gesplitste Caspase 3. Interferon gamma geïnduceerde een gepolariseerde secretie van pro-inflammatoire moleculen in de darmchip zoals aangetoond door de basolaterale secretie van VCAM-1 en interleukine-6 en de apicale secretie van ICAM-1 en serum amyloïde eiwit A.Voor een succesvolle darmchipcultuur moet men ongedifferentieerde organoïden gebruiken en de instructies voor fragmentatie en zaaidichtheid volgen.Na de succesvolle oprichting van de darmchip kunnen we intestinale absorptie, transport en metabolisme, voedingsniveaus en intestinale hormoonsecretie, gastheer microbe pathogene interacties, veiligheid en werkzaamheid van geneesmiddelen, patiëntspecifieke ziektemechanismen en reacties op therapieën bestuderen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Human kraakbeenweefsel Fabrication behulp van drie-dimensionale Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Real-time monitoring van de intracellulaire Bile Acid Dynamics Met behulp van een genetisch gecodeerde FRET-gebaseerde Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Ontwikkeling van een Meercellige Driedimensionale Organotypische model van het menselijk darmslijmvlies geteeld onder Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

Toepassing van geavanceerde In Vitro kweken van technologie om te bestuderen van de menselijke darmflora

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases

Menselijke neurale Organoïden voor het bestuderen van hersenkanker en neurodegeneratieve ziekten

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Een kwantitatieve fluorescentiemicroscopie gebaseerde enkelvoudige liposoom test voor het opsporen van de compositorische Inhomogeniteit tussen individuele liposomen

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

In Vitro Model van de mens cutaneous hypertrofische littekens met behulp van macromoleculaire crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery

Toxiciteitsscreenings in humane retinale organoïden voor farmaceutische ontdekking

Organoids provide a promising platform to study disease mechanism and treatments, directly in the context of human tissue with the versatility and ...

Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall

Constructie van een humane Aorta gladde spiercel orgaan-op-A-chip model voor het recapuleren van biomechanische stam in de aortawand

Conventional two-dimensional cell culture techniques and animal models have been used in the study of human thoracic aortic aneurysm and dissection ...

Regionale gedecellulariseerde isolatie van longweefsel om cel-cel- en cel-ECM-interacties te bestuderen

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue

Auteur in de schijnwerpers: dissectie en isolatie van regiospecifiek gedecellulariseerd longweefsel  

Dissectie en isolatie van regiospecifiek gedecellulariseerd longweefsel

Lung transplantation is often the only option for patients in the later stages of severe lung disease, but this is limited both due to the supply of ...