Name: combining human organoids and organ-on-a-chip technology to model intestinal region-specific functionality
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality at JoVE.com

Nous remercions le professeur Mark Donowitz pour avoir fourni les organoïdes dérivés de la biopsie intestinale et Brett Clair pour la conception des illustrations scientifiques de la puce, du module portable et du module de culture. Toutes les autres illustrations scientifiques ont été générées à l’aide du BioRender.

REMARQUE: Toutes les cultures cellulaires doivent être manipulées à l’aide d’une technique aseptique appropriée.
Les organoïdes intestinaux humains utilisés dans cette étude ont été obtenus de l’Université Johns Hopkins et toutes les méthodes ont été effectuées conformément aux directives et réglementations approuvées. Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Conseil d’examen institutionnel de l’Université Johns Hopkins (IRB #NA 00038329).
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La combinaison de la technologie des organes sur puce et des organoïdes intestinaux est prometteuse pour une modélisation précise de la physiologie intestinale humaine et de la physiopathologie. Ici, nous fournissons un protocole étape par étape simple et robuste (décrit à la figure 1) pour l’établissement de la puce intestinale contenant l’épithélium de l’intestin grêle ou du côlon dérivé de la biopsie et des cellules endothéliales microvasculaires intestinales co-culti...

L’intestin humain est un organe complexe et multitâche capable de s’auto-régénérer. Il est divisé en petit et gros intestin. La fonction principale de l’intestin grêle est de digérer davantage les aliments provenant de l’estomac, d’absorber tous les nutriments et de transmettre les résidus au gros intestin, qui récupère l’eau et les électrolytes. L’intestin grêle est en outre divisé en plusieurs régions anatomiquement distinctes: le duodénum, le jéjunum et l’iléon, chacune étant adaptée pour remplir des fonctions spécifiques. Par exemple, le duodénum aide à décomposer le chyme (contenu de l’estomac) pour permettre la bonne absorption des nutriments impliquant des protéines, des glucides, des vitamines et des minéraux dans le jéjunum. Cette partie proximale de l’intestin grêle est également le principal site d’absorption et de métabolisme des médicaments intestinaux, et elle se caractérise par l’expression plus élevée des enzymes métabolisant les médicaments (par exemple, le CYP3A4) par rapport à leur expression dans l’iléon et le côlon1. En plus de son rôle principal dans la digestion et l’absorption des nutriments, l’intestin est également une barrière efficace contre les contenus luminaux potentiellement nocifs, tels que les micro-organismes pathogènes, les métabolites microbiens, les antigènes alimentaires et les toxines 2,3. Il est à noter que le côlon humain est habité par un grand nombre de micro-organismes, dépassant de loin celui des cellules totales du corps humain, qui offrent de nombreux avantages pour la nutrition, le métabolisme et l’immunité. Par conséquent, le maintien de l’intégrité de la barrière muqueuse formée par les cellules épithéliales intestinales est essentiel pour permettre la relation symbiotique entre le microbiote intestinal et les cellules hôtes en les séparant physiquement afin d’éviter une activation inutile des cellules immunitaires2. En outre, la mort cellulaire intestinale programmée joue un rôle essentiel en tant que mécanisme d’autoprotection empêchant les cellules infectées de persister ou de proliférer – disséminant ainsi des agents pathogènes potentiels3 – tandis que l’auto-renouvellement continu de l’épithélium intestinal tous les quatre à sept jours compense la perte cellulaire assurant l’intégrité de la barrière et l’homéostasie tissulaire. Les déficiences des fonctions intestinales décrites, y compris l’absorption des nutriments, l’intégrité de la barrière ou le déséquilibre dans la mort et l’auto-renouvellement des cellules intestinales, peuvent entraîner le développement d’une gamme de troubles gastro-intestinaux, y compris la malnutrition et les maladies inflammatoires de l’intestin (MII)2,3.
Auparavant, des modèles animaux et des lignées cellulaires intestinales transformées dérivées du cancer ont été utilisés pour étudier les fonctions physiologiques et physiopathologiques du tissu intestinal humain. Cependant, les préoccupations de plus en plus importantes concernant la transférabilité de la recherche animale à l’homme, causées par la présence de disparités importantes entre les deux espèces, ont mis en évidence la nécessité de méthodes alternatives pertinentes pour l’homme4. Les lignées cellulaires intestinales in vitro couramment utilisées comprennent les cellules T84, Caco-2 et HT29. Bien qu’ils imitent certains aspects de la fonction de barrière intestinale et du transport membranaire, ils se caractérisent par une expression altérée des enzymes métabolisant les médicaments5, des récepteurs de surface et des transporteurs4. De plus, ils manquent de spécificité du segment intestinal et ne parviennent pas à récapituler la complexité de l’épithélium intestinal, chaque modèle ne contenant qu’un seul des cinq types de cellules épithéliales présentes dans l’intestin6.
Récemment, des cultures organoïdes intestinales humaines établies à partir de biopsies fraîches de l’intestin grêle et du côlon 7,8 ou de cellules souches pluripotentes induites (CSPi)9 ont été introduites comme modèles expérimentaux alternatifs ayant le potentiel de compléter, de réduire et peut-être de remplacer l’expérimentation animale à l’avenir. Bien que les CSPi puissent être obtenues de manière non invasive, l’établissement d’organoïdes à partir de CSPi nécessite l’utilisation de protocoles complexes et longs (avec plusieurs étapes expérimentales) et génère des cultures ressemblant à du tissu fœtal humain. En revanche, les organoïdes dérivés de la biopsie sont hautement évolutifs, car ils peuvent tirer parti de la capacité de renouvellement inhérente du tissu intestinal et peuvent être indéfiniment passés et propagés in vitro. Il est important de noter que les organoïdes dérivés de la biopsie maintiennent les caractéristiques spécifiques de la maladie et de la région intestinale du tissu primaire à partir duquel ils ont été développés et émulent la diversité cellulaire de l’épithélium intestinal. Les organoïdes peuvent être utilisés comme avatars spécifiques au patient in vitro pour démêler la biologie et la pathogenèse de divers troubles gastro-intestinaux et améliorer leur gestion thérapeutique. Bien que les organoïdes intestinaux aient atteint un degré impressionnant de fonctionnalité physiologique, ils ne parviennent toujours pas à reproduire la complexité des organes natifs en raison de leur manque de composants stromaux critiques – y compris les vaisseaux sanguins, le tissu conjonctif, les nerfs périphériques et les cellules immunitaires – ainsi que de stimulation mécanique. Les paramètres mécaniques, tels que l’écoulement, la contrainte de cisaillement, l’étirement et la pression, sont connus pour influencer la morphogenèse tissulaire et l’homéostasie in vivo et il a déjà été démontré qu’ils amélioraient la maturation des cellules in vitro10,11,12,13. Un autre inconvénient important des systèmes organoïdes est l’inaccessibilité de la lumière et, par conséquent, du côté apical de l’épithélium. Cela représente un défi pour l’étude de divers mécanismes associés à l’expression polarisée des transporteurs d’ions et de médicaments, aux interactions hôte-microbiome et aux tests de toxicité pharmaceutique. Enfin, les cultures organoïdes souffrent d’une variabilité considérable de taille, de morphologie et de fonction, en raison de la nature stochastique du processus d’auto-organisation in vitro et des choix de destin cellulaire. Par conséquent, pour réaliser le plein potentiel des organoïdes intestinaux dans la modélisation des maladies, le dépistage des médicaments et la médecine régénérative, il est nécessaire d’explorer de nouvelles stratégies qui réduisent la variabilité du développement organoïde, améliorent l’accès au compartiment luminal et intègrent les interactions cellule-cellule manquantes.
La technologie Organ-on-a-Chip a introduit de nombreuses techniques pour l’incorporation de forces mécaniques et d’écoulement de fluide dans les cultures de cellules intestinales in vitro. Cependant, étant donné que la plupart des études initiales de preuve de concept ont utilisé des lignées cellulaires dérivées du cancer qui ne présentaient pas une diversité cellulaire suffisante, la pertinence de ces systèmes a été remise en question. Récemment, nous avons combiné de manière synergique des organoïdes intestinaux et la technologie organ-on-a-chip pour incorporer les meilleures caractéristiques de chaque approche dans un système in vitro 14,15,16. La puce intestinale résultante récapitule l’architecture multicellulaire de l’épithélium intestinal, la présence d’une interface tissulaire épithéliale-endothéliale et les forces mécaniques de l’écoulement et de l’étirement des fluides, permettant l’émulation des fonctions au niveau des organes in vitro. De plus, l’utilisation d’organoïdes dérivés de tissus primaires (qui peuvent être échantillonnés dans différentes régions de l’intestin humain) comme matériau de départ augmente la polyvalence de ce modèle, car des puces représentant le duodénum, le jéjunum, l’iléon et le côlon humains peuvent être établies à la suite de procédures d’ensemencement et de culture similaires. Il est important de noter que les puces intestinales permettent d’évaluer en temps réel: l’intégrité de la barrière intestinale; activité de la bordure de la brosse et des enzymes du métabolisme des médicaments; production de mucines; sécrétion de cytokines; et l’interaction des cellules intestinales avec des micro-organismes pathogènes et commensaux, comme le démontrent les rapports publiés précédemment. Notamment, lorsque les puces intestinales ont été établies à l’aide d’organoïdes générés à partir de tissus de différents individus, ces modèles ont capturé la variabilité attendue entre donneurs dans les réponses fonctionnelles à divers médicaments et traitements. Dans l’ensemble, la fusion des organoïdes avec la technologie Organ-on-a-Chip ouvre la porte à des modèles plus avancés, personnalisés et pertinents in vivo qui pourraient améliorer la pertinence physiologique et la précision des résultats in vitro ainsi que leur extrapolation aux humains. Ici, un protocole détaillé est présenté pour établir la puce intestinale et son application dans les études des fonctions physiologiques des deux segments intestinaux: duodénum et côlon. Tout d’abord, les méthodes d’évaluation de l’activité de l’enzyme métabolisant le médicament CYP3A4 dans la puce du duodénum, ainsi que son induction par des composés prototypiques tels que la rifampicine et la vitamine D3, sont décrites. Deuxièmement, les étapes nécessaires pour modéliser « l’intestin qui fuit » dans la puce du côlon sont décrites dans le protocole, la perturbation de la barrière épithéliale étant effectuée à l’aide de cytokines caractéristiques impliquées dans la pathogenèse de la MII. En bref, les organoïdes dérivés de biopsies humaines sont propagés in vitro, soumis à une digestion enzymatique et introduits dans le canal supérieur de la puce. En présence d’une perfusion continue avec des milieux enrichis en facteur de croissance, ils se développent en une monocouche épithéliale confluente avec une architecture 3D et une surface cellulaire apicale facilement accessible. Le compartiment inférieur de la puce « vasculaire » est ensemencé de cellules endothéliales microvasculaires isolées du petit ou du gros intestin. L’épithélium et l’endothélium sont séparés par une membrane extensible poreuse, qui facilite les interactions paracrines entre les deux tissus et, lorsqu’ils sont soumis à des déformations cycliques, émule les mouvements de l’intestin humain semblables à ceux du péristaltisme. La co-culture est maintenue dans les conditions d’écoulement dynamique générées par la perfusion luminale et vasculaire avec des milieux de culture cellulaire appropriés. Enfin, nous décrivons de nombreux types d’essais et d’analyses des paramètres qui peuvent être effectués directement sur puce ou à partir d’effluents de culture cellulaire échantillonnés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>AlphaBioRegen</td>
			<td>ALHE15</td>
			<td>0.5 cells M/ml ; cryopreserved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>AlphaBioRegen</td>
			<td>ALHE16</td>
			<td>0.5 cells M/ml ; cryopreserved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy-derived Human Duodenal Organoids</td>
			<td>John Hopkin&#39;s University</td>
			<td>-</td>
			<td>The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy-derived Human Colonic Organoids</td>
			<td>John Hopkin&#39;s University</td>
			<td>-</td>
			<td>The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zo&#235; CM-1&#8482;&#160;Culture Module</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Culture module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orb-HM1&#8482;&#160;Hub Module</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>5% CO2, vacuum stretch, and power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1&#8482; Stretchable Chip</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pod&#8482; Portable Modules</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Portable module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Light Box</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip Cradle</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>1 per square culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip&#174;-HV Filters</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SE1M003M00</td>
			<td>0.45&#160;&#956;m&#160;PVDF filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82051-068</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld&#160;vacuum&#160;aspirator</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4930</td>
			<td>&#160;-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating&#160;pipettes</td>
			<td>Corning / Falcon</td>
			<td>357558</td>
			<td>2 mL,&#160;polystyrene, individually&#160;wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating tips</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
			<td>Sterile (autoclaved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological&#160;pipettes</td>
			<td></td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>2 mL, 5 mL,&#160;10 mL,&#160;and&#160;25 mL&#160;low endotoxin, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>P20, P200,&#160;P1000&#160;and standard multichannel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette&#160;tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>P20, P200,&#160;and&#160;P1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes&#160;(Protein&#160;LoBind&#174; Tubes)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030122216;&#160;0030122240</td>
			<td>15 mL, 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Tubes&#174;&#160;lo-bind</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431081</td>
			<td>1.5 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells black walled plate</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for epithelial permeability analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (with camera)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For bright-field&#160;imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (or beads)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Set to 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum set-up</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>-</td>
			<td>Minimum&#160;pressure: -70 kPa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>220033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td>Cell culture flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent-1&#160;(ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Chip coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent-2&#160;(ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Chip coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS&#160;(DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25055CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93595</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TryplE&#160;Express</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Organoids&#160;dissociation&#160;and endothelium cells&#160;detachment&#160;solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult&#8482; Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>Organoid Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22121</td>
			<td>Endothelial medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin&#8482;&#160;</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ANT-PM-1</td>
			<td>antimicrobial agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment Factor&#8482;</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>4Z0-210</td>
			<td>coating solution for flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - Growth Factor Reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Solubilized basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>ECM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>ECM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td>organoid media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-10</td>
			<td>organoid media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>Basement mebrane matrix dissociationsolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9576</td>
			<td>30%, Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25055CV</td>
			<td>Sterile, Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3KDa Dextran Cascade Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D7132</td>
			<td>10 mg powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin (RIF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# R3501</td>
			<td>CYP inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testosterone hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1500</td>
			<td>CYP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# D1530</td>
			<td>CYP inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>159002</td>
			<td>LCMS stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>157-4</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>566460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Occludin</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Claudin 4</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>36-4800</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-E-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1416</td>
			<td>epithelial adherens junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VE-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33168</td>
			<td>endothelial adherent junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>339194</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12183020</td>
			<td>RNA lysis, isolation and purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript&#8482; IV VILO&#8482; Master Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11756050</td>
			<td>reverse transcriptase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan&#8482; Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444557</td>
			<td>qPCR reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio&#8482; 5 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A28573</td>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs99999901_s1</td>
			<td>Eukaryotic 18S rRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP3A4 primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs00604506_m1</td>
			<td>Cytochrome&#160; family 3 subfamily A member 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23236</td>
			<td>Protein quantification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Tris lysis buffer</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R60TX-3</td>
			<td>Protein lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved/Total Caspase-3 Whole Cell Lysate Kit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15140D</td>
			<td>Caspase 3 detection kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15198D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex)</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15053D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>20X long-distance objective lenses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AXIOvert.A1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Brightfield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>10X objective lenses</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining human organoids and organ-on-a-chip technology to model intestinal region-specific functionality

La muqueuse intestinale est une barrière physique et biochimique complexe qui remplit une myriade de fonctions importantes. Il permet le transport, l’absorption et le métabolisme des nutriments et des xénobiotiques tout en facilitant une relation symbiotique avec le microbiote et en limitant l’invasion des micro-organismes. L’interaction fonctionnelle entre les différents types de cellules et leur environnement physique et biochimique est vitale pour établir et maintenir l’homéostasie des tissus intestinaux. La modélisation de ces interactions complexes et de la physiologie intestinale intégrée in vitro est un objectif formidable avec le potentiel de transformer la façon dont de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouveaux candidats médicaments sont découverts et développés.
Les technologies Organoïdes et Organ-on-a-Chip ont récemment été combinées pour générer des puces intestinales pertinentes pour l’homme adaptées à l’étude des aspects fonctionnels de la physiologie intestinale et de la physiopathologie in vitro. Les organoïdes dérivés des biopsies du petit (duodénum) et du gros intestin sont ensemencés dans le compartiment supérieur d’une puce d’organe, puis se développent avec succès en monocouches tout en préservant les caractéristiques cellulaires, moléculaires et fonctionnelles distinctes de chaque région intestinale. Les cellules endothéliales microvasculaires spécifiques du tissu intestinal humain sont incorporées dans le compartiment inférieur de la puce de l’organe pour recréer l’interface épithéliale-endothéliale. Cette nouvelle plate-forme facilite l’exposition luminale aux nutriments, aux médicaments et aux micro-organismes, permettant des études sur le transport intestinal, la perméabilité et les interactions hôte-microbe.
Ici, un protocole détaillé est fourni pour l’établissement de puces intestinales représentant le duodénum humain (puce du duodénum) et le côlon (puce du côlon), et leur culture ultérieure sous des déformations continues et de type péristaltisme. Nous démontrons des méthodes d’évaluation du métabolisme des médicaments et de l’induction du CYP3A4 dans la puce du duodénum à l’aide d’inducteurs et de substrats prototypiques. Enfin, nous fournissons une procédure étape par étape pour la modélisation in vitro de la perturbation de la barrière médiée par l’interféron gamma (IFNγ) (syndrome de l’intestin perméable) dans une puce du côlon, y compris des méthodes d’évaluation de l’altération de la perméabilité paracellulaire, des changements dans la sécrétion de cytokines et du profilage transcriptomique des cellules de la puce.

La figure 1D résume la chronologie de la culture de la puce intestinale et illustre les cellules endothéliales intestinales et les organoïdes avant et après l’ensemencement sur la puce. De plus, il démontre les différences morphologiques distinctes entre le duodénum et les puces du côlon, mises en évidence par la présence de formations ressemblant à des villosités dans la puce du duodénum et représentatives de l’architecture de l’intestin grêle.
<p class="jove_conten...

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Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

Les organoïdes intestinaux dérivés de la biopsie et les technologies d’organes sur puce sont combinés dans une plate-forme microphysiologique pour récapituler la fonctionnalité intestinale spécifique à la région.

Combinaison d’organoïdes humains et de la technologie Organ-on-a-Chip pour modéliser des fonctionnalités spécifiques à la région intestinale

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

Ce protocole montre comment utiliser les organoïdes intestinaux dérivés de la biopsie et la technologie des organes sur puce pour générer une puce intestinale physiologiquement pertinente qui peut ensuite être utilisée pour prédire la pharmacocinétique et l’interaction médicamenteuse et pour étudier le dysfonctionnement de la barrière épithéliale intestinale. L’unification des organoïdes dans la technologie des organes sur puce nous permet de reproduire la complexité de l’épithélium intestinal. De plus, il permet un meilleur contrôle expérimental des signaux mécaniques, de la distribution des flux et des gradients biochimiques.Cette méthode émule la physiologie complexe de l’intestin humain, ce qui permet de mieux comprendre les bases cellulaires et moléculaires des fonctions intestinales normales et pathologiques. Cela permet de mieux prédire la pharmacocinétique et la pharmacodynamie et les candidats médicaments potentiels pour prévenir les dommages inflammatoires. L’ensemencement est une étape critique du protocole.Une fragmentation excessive ou une densité d’ensemencement inexacte des fragments organoïdes intestinaux peut compromettre le développement et la différenciation de la barrière épithéliale. Pour commencer, aspirez le milieu de la culture organoïde statique. Récupérer les milieux d’un nombre suffisant de puits pour atteindre une densité finale d’ensemencement de huit millions de cellules par millilitre.Ajouter 500 microlitres de solution de dissociation BMM glacée à chaque puits et fixer le BMM solubilisé hors de la surface du puits. Rassemblez la suspension dans un tube de liaison à faible teneur en protéines de 15 millilitres et placez-la sur de la glace. Secouez doucement le tube toutes les 15 minutes pendant une heure.Centrifuger à 300 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour obtenir une pastille organoïde. Si une couche de gel transparent est observée au-dessus de la pastille, aspirer la solution du tube. Remettez la pastille en suspension et ajoutez un volume égal de solution de dissociation BMM.Incuber sur glace pendant 10 minutes et centrifuger. Répéter jusqu’à ce qu’aucun résidu de BMM solubilisé ne soit présent. Ensuite, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille dans deux millilitres de solution de digestion organoïde.Incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant une à trois minutes et ajouter huit millilitres de DMEM F12 avancé pour arrêter la réaction enzymatique. Centrifuger et remettre en suspension la pastille dans un milieu de croissance organoïde complet pour atteindre huit millions de cellules par millilitre. Aliquote 360 microlitres dans des tubes de liaison stériles à faible teneur en protéines de 1,5 millilitre.Ensuite, retirez le milieu du canal supérieur des copeaux revêtus et ajoutez 30 microlitres de la suspension cellulaire. Incuber les copeaux à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour adhérer les fragments organoïdes à la membrane. Ajouter trois millilitres de milieu de croissance organoïde complet pré-équilibré au réservoir d’entrée supérieur et trois millilitres de milieu de croissance cellulaire endothéliale pré-équilibré dans le réservoir d’entrée inférieur.Ajoutez 300 microlitres du même média dans les réservoirs de sortie supérieurs et inférieurs respectifs. Transférez le plateau transportant les modules portables dans le module de culture. Sur le module de culture, exécutez à plusieurs reprises le cycle principal jusqu’à ce que suffisamment de gouttelettes se forment pour connecter avec succès les puces.Faites ensuite glisser le support de puce dans le module portable. Ensuite, démarrez le cycle de régulation de deux heures pour pressuriser le milieu de culture dans le module portable et la puce, après quoi les conditions programmées reprendront. Ensuite, modifiez les paramètres d’étirement et démarrez le module de culture.Après 24 heures, répétez le cycle avec 10% d’étirement et la même fréquence. Pour préparer le milieu de dosage ou le contrôle du véhicule, diluer les solutions mères inductrices du CYP ou le DMSO dans un milieu de croissance organoïde complet et un milieu de croissance des cellules endothéliales. Mettez le module de culture en pause et amenez les plateaux dans l’enceinte de biosécurité.Remplacez le média dans tous les réservoirs d’entrée et de sortie par deux millilitres de média de dosage avec inducteurs ou commande du véhicule. Remettez les modules portables dans le module de culture et redémarrez le flux à 30 microlitres par heure. Remplacer le média par une solution inductrice fraîchement préparée toutes les 24 heures et poursuivre la culture pendant 48 à 72 heures.Ensuite, amenez les plateaux à l’armoire de biosécurité et aspirez le milieu de dosage de tous les réservoirs. Lavez et remplacez le réservoir d’entrée supérieur par un milieu DMEM F12 avancé chaud et le réservoir inférieur par un milieu de croissance des cellules endothéliales. Remplacez le produit de lavage par un millilitre de solution de substrat de sonde.Perfusez les copeaux à un débit élevé de 1 000 microlitres par heure pendant cinq minutes et aspirez les réservoirs de sortie supérieurs et inférieurs. Remettez les copeaux dans le module de culture et incuber pendant une heure sous un débit constant de 300 microlitres par heure. Après une heure de traitement, arrêtez l’écoulement et apportez les plateaux à l’armoire de biosécurité.Recueillir 100 microlitres d’effluent du réservoir supérieur de sortie et l’ajouter à un tube contenant 200 microlitres de solution d’arrêt. Placez immédiatement les tubes sur de la glace sèche et conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius. Lavez les deux canaux avec 200 microlitres de DPBS stérile.Bloquez ensuite la sortie du canal inférieur avec une pointe de pipette filtrante de 200 microlitres. Perfuser 50 microlitres de la solution de dissociation à travers le canal inférieur et incuber pendant deux minutes à température ambiante. Assurer le détachement complet des cellules endothéliales et retirer la solution de dissociation du canal par pipetage.Répétez le lavage. Ensuite, bloquez la sortie du canal supérieur et perfusez 75 microlitres de tampon de lyse protéique. Laissez l’embout de la pipette inséré et incuber pendant cinq minutes à température ambiante.Recueillir les lysats cellulaires dans un tube de 1,5 millilitre en pipetant cinq à 10 fois. Répéter la perfusion et la collecte pour obtenir le détachement complet des cellules et stocker les lysats à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’analyse. Pour la lyse de l’ARN, suivez la même procédure tout en utilisant 150 microlitres de tampon de lyse de l’ARN.Tout d’abord, préparez une solution de dosage d’interféron gamma en diluant les solutions mères dans un milieu de croissance de cellules endothéliales dégazées. Dans l’enceinte de biosécurité, retirez le fluide des réservoirs d’entrée du canal inférieur et remplacez-le par trois millilitres de solution doseuse par jour. Placez ensuite les plateaux dans le module de culture et perfuser les copeaux à un débit élevé de 1 000 microlitres par heure pendant cinq minutes.Basculez le débit à 60 microlitres par heure et continuez la culture fluidique. Ajouter 100 microlitres de DPBS par puits dans une plaque à paroi noire de 96 puits. À l’aide d’une pipette multicanal, ajoutez 50 microlitres de l’effluent de tous les réservoirs aux puits respectifs.Pour préparer une courbe standard, effectuer une triple dilution du milieu contenant 100 microgrammes par millilitre de trois kilodaltons de bleu de cascade de dextrane dans DPBS. Ensuite, effectuez des délires en série en utilisant une dilution triple du milieu de croissance des cellules endothéliales dans DPBS. Les caractéristiques morphologiques distinctes du duodénum et des puces du côlon ont été mises en évidence par la présence de formations en forme de villosités dans la puce du duodénum représentant l’architecture de l’intestin grêle.Dans la puce du duodénum exposée aux inducteurs du cytochrome P450, la rifampicine et la vitamine D3, il y avait une expression élevée du gène de l’ARNm pour l’enzyme métabolisant le médicament cytochrome P450 3A4 et une activité catalytique accrue de l’enzyme cytochrome P450, indiquant des réponses d’induction appropriées chez les trois donneurs organoïdes. Lors du traitement de la monocouche épithéliale de la puce du côlon avec de l’interféron gamma, une morphologie cellulaire compromise et une perte de l’épithélium cylindrique ont été observées. En outre, le traitement par interféron gamma a entraîné une augmentation du signal cytoplasmique des protéines de jonction serrées et adhérentes par rapport au contrôle du véhicule, montrant le déplacement des marqueurs de jonction serrée ZO-1 et claudine 4 et l’internalisation de l’occludine et de la E-cadhérine.Une augmentation significative de la perméabilité paracellulaire épithéliale a été observée après 48 heures de stimulation par l’interféron gamma sur des puces du côlon. De même, l’interféron gamma induit l’activation de l’apoptose indiquée par une augmentation du contenu intracellulaire de la Caspase 3 clivée. L’interféron gamma a induit une sécrétion polarisée de molécules pro-inflammatoires dans la puce du côlon, comme le montre la sécrétion basolatérale de VCAM-1 et d’interleukine-6 et la sécrétion apicale d’ICAM-1 et de la protéine amyloïde sérique A.Pour une culture réussie de puces intestinales, il faut utiliser des organoïdes indifférenciés et suivre les instructions de fragmentation et de densité d’ensemencement.Après la mise en place réussie de la puce intestinale, nous pouvons étudier l’absorption, le transport et le métabolisme intestinaux, les niveaux de nutriments et la sécrétion d’hormones intestinales, les interactions entre les agents pathogènes du microbe hôte, l’innocuité et l’efficacité des médicaments, les mécanismes pathologiques spécifiques au patient et les réponses aux traitements.

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Fabrication de tissus de cartilage humain en utilisant trois dimensions jet d&#39;encre Technologie d&#39;impression

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

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Surveillance en temps réel des intracellulaire des acides biliaires Dynamics en utilisant un capteur acides biliaires base-FRET codées génétiquement

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