Name: combining human organoids and organ-on-a-chip technology to model intestinal region-specific functionality
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality at JoVE.com

Ringraziamo il professor Mark Donowitz per aver fornito gli organoidi derivati dalla biopsia intestinale e Brett Clair per aver progettato le illustrazioni scientifiche del chip, del portatile e del modulo di coltura. Tutte le altre illustrazioni scientifiche sono state generate utilizzando il BioRender.

NOTA: Tutte le colture cellulari devono essere gestite utilizzando una tecnica asettica adeguata.
Gli organoidi intestinali umani impiegati in questo studio sono stati ottenuti dalla Johns Hopkins University e tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti approvati. Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Johns Hopkins University Institutional Review Board (IRB #NA 00038329).
1. Preparazione dei reagenti ...

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La combinazione della tecnologia organ-on-a-chip e degli organoidi intestinali promette una modellazione accurata della fisiologia intestinale umana e della fisiopatologia. Qui, forniamo un protocollo passo-passo semplice e robusto (delineato nella Figura 1) per la creazione del chip intestinale contenente epitelio intestinale o del colon derivato dalla biopsia e cellule endoteliali microvascolari intestinali co-coltivate in un dispositivo microfluidico. Questa simulazione basata su chip del...

L'intestino umano è un organo complesso e multitasking capace di auto-rigenerazione. È diviso nell'intestino tenue e crasso. La funzione primaria dell'intestino tenue è quella di digerire ulteriormente il cibo proveniente dallo stomaco, assorbire tutti i nutrienti e trasmettere il residuo all'intestino crasso, che recupera l'acqua e gli elettroliti. L'intestino tenue è ulteriormente diviso in più regioni anatomicamente distinte: il duodeno, il digiuno e l'ileo, ognuno dei quali è adattato per svolgere funzioni specifiche. Ad esempio, il duodeno aiuta a scomporre il chimo (contenuto dello stomaco) per consentire il corretto assorbimento dei nutrienti che coinvolgono proteine, carboidrati, vitamine e minerali nel digiuno. Questa parte prossimale dell'intestino tenue è anche il principale sito di assorbimento e metabolismo intestinale dei farmaci ed è caratterizzata dalla maggiore espressione di enzimi che metabolizzano i farmaci (ad esempio, CYP3A4) rispetto alla loro espressione nell'ileo e nel colon1. Oltre al suo ruolo principale nella digestione e nell'assorbimento dei nutrienti, l'intestino è anche una barriera efficace contro i contenuti luminali potenzialmente dannosi, come microrganismi patogeni, metaboliti microbici, antigeni alimentari e tossine 2,3. È interessante notare che il colon umano è abitato da un gran numero di microrganismi, di gran lunga superiore a quello delle cellule totali nel corpo umano, che forniscono molti benefici alla nutrizione, al metabolismo e all'immunità. Pertanto, il mantenimento dell'integrità della barriera mucosale formata dalle cellule epiteliali intestinali è fondamentale per consentire la relazione simbiotica tra il microbiota intestinale e le cellule ospiti separandole fisicamente per evitare un'inutile attivazione delle cellule immunitarie2. Inoltre, la morte cellulare intestinale programmata svolge un ruolo essenziale come meccanismo di autoprotezione che impedisce alle cellule infette di persistere o proliferare, diffondendo così potenziali agenti patogeni3, mentre il continuo auto-rinnovamento dell'epitelio intestinale ogni quattro-sette giorni compensa la perdita cellulare garantendo l'integrità della barriera e l'omeostasi dei tessuti. La compromissione delle funzioni intestinali descritte, tra cui l'assorbimento dei nutrienti, l'integrità della barriera o lo squilibrio nella morte delle cellule intestinali e nell'auto-rinnovamento, può provocare lo sviluppo di una serie di disturbi gastrointestinali, tra cui la malnutrizione e la malattia infiammatoria intestinale (IBD)2,3.
In precedenza, modelli animali e linee cellulari intestinali derivate dal cancro trasformate sono state utilizzate per studiare le funzioni fisiologiche e fisiopatologiche del tessuto intestinale umano. Tuttavia, le preoccupazioni sempre più importanti sulla traducibilità della ricerca sugli animali per l'uomo, causate dalla presenza di disparità significative tra le due specie, hanno evidenziato la necessità di metodi alternativi rilevanti per l'uomo4. Le linee cellulari intestinali comunemente usate in vitro includono cellule T84, Caco-2 e HT29. Mentre imitano alcuni aspetti della funzione di barriera intestinale e del trasporto di membrana, sono caratterizzati da un'espressione alterata degli enzimi che metabolizzano i farmaci5, i recettori di superficie e i trasportatori4. Inoltre, mancano di specificità del segmento intestinale e non riescono a ricapitolare la complessità dell'epitelio intestinale, con ogni modello contenente solo uno dei cinque tipi di cellule epiteliali presenti nell'intestino6.
Recentemente, colture organoidi intestinali umane stabilite da biopsie fresche dell'intestino tenue e del colon 7,8 o cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC)9 sono state introdotte come modelli sperimentali alternativi con potenziale per integrare, ridurre e forse sostituire la sperimentazione animale in futuro. Mentre le iPSC possono essere ottenute in modo non invasivo, la creazione di organoidi da iPSC richiede l'uso di protocolli complessi e lunghi (con diverse fasi sperimentali) e genera colture simili al tessuto fetale umano. Al contrario, gli organoidi derivati dalla biopsia sono altamente scalabili, in quanto possono sfruttare la capacità di rinnovamento intrinseca del tessuto intestinale e possono essere trasmessi e propagati in vitro a tempo indeterminato. È importante sottolineare che gli organoidi derivati dalla biopsia mantengono le caratteristiche specifiche della malattia e della regione intestinale del tessuto primario da cui sono stati sviluppati ed emulano la diversità cellulare dell'epitelio intestinale. Gli organoidi possono essere utilizzati come avatar specifici del paziente in vitro per svelare la biologia e la patogenesi di vari disturbi gastrointestinali e migliorare la loro gestione terapeutica. Sebbene gli organoidi intestinali abbiano raggiunto un impressionante grado di funzionalità fisiologica, non riescono ancora a riprodurre la complessità degli organi nativi a causa della loro mancanza di componenti stromali critici, tra cui vasi sanguigni, tessuto connettivo, nervi periferici e cellule immunitarie, nonché stimolazione meccanica. I parametri meccanici, come il flusso, lo stress da taglio, l'allungamento e la pressione, sono noti per influenzare la morfogenesi tissutale e l'omeostasi in vivo e in precedenza hanno dimostrato di migliorare la maturazione delle cellule in vitro 10,11,12,13. Un ulteriore importante inconveniente dei sistemi organoidi è l'inaccessibilità del lume e, quindi, al lato apicale dell'epitelio. Ciò rappresenta una sfida per lo studio di vari meccanismi associati all'espressione polarizzata di trasportatori di ioni e farmaci, interazioni ospite-microbioma e test di tossicità farmaceutica. Infine, le colture organoidi soffrono di una notevole variabilità in termini di dimensioni, morfologia e funzione, a causa della natura stocastica del processo di auto-organizzazione in vitro e delle scelte del destino cellulare. Pertanto, per realizzare il pieno potenziale degli organoidi intestinali nella modellazione delle malattie, nello screening farmacologico e nella medicina rigenerativa, è necessario esplorare nuove strategie che riducano la variabilità nello sviluppo degli organoidi, migliorino l'accesso al compartimento luminale e incorporino le interazioni cellula-cellula mancanti.
La tecnologia Organ-on-a-Chip ha introdotto molte tecniche per l'incorporazione di forze meccaniche e flusso di fluidi in colture cellulari intestinali in vitro. Tuttavia, poiché la maggior parte degli studi proof-of-concept iniziali hanno utilizzato linee cellulari derivate dal cancro che non mostravano sufficiente diversità cellulare, la rilevanza di questi sistemi è stata messa in discussione. Recentemente, abbiamo combinato sinergicamente organoidi intestinali e tecnologia organ-on-a-chip per incorporare le migliori caratteristiche di ciascun approccio in un unico sistema in vitro 14,15,16. Il chip intestinale risultante ricapitola l'architettura multicellulare dell'epitelio intestinale, la presenza dell'interfaccia del tessuto epiteliale-endoteliale e le forze meccaniche del flusso e dell'allungamento del fluido, consentendo l'emulazione delle funzioni a livello di organo in vitro. Inoltre, l'uso di organoidi derivati da tessuti primari (che possono essere campionati da diverse regioni dell'intestino umano) come materiale di partenza aumenta la versatilità di questo modello, poiché i chip che rappresentano duodeno umano, digiuno, ileo e colon possono essere stabiliti seguendo procedure di semina e coltura simili. È importante sottolineare che Intestine-Chips consente la valutazione in tempo reale di: l'integrità della barriera intestinale; attività del bordo del pennello e degli enzimi del metabolismo dei farmaci; produzione di mucine; secrezione di citochine; e l'interazione delle cellule intestinali con microrganismi patogeni e commensali, come dimostrato nei rapporti precedentemente pubblicati. In particolare, quando i chip intestinali sono stati stabiliti utilizzando organoidi generati dal tessuto di individui diversi, questi modelli hanno catturato la variabilità inter-donatore attesa nelle risposte funzionali a vari farmaci e trattamenti. Complessivamente, la fusione di organoidi con la tecnologia Organ-on-a-Chip apre la porta a modelli più avanzati, personalizzati e rilevanti in vivo che potrebbero migliorare la rilevanza fisiologica e l'accuratezza dei risultati in vitro, nonché la loro estrapolazione per gli esseri umani. Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per stabilire il chip intestinale e la sua applicazione negli studi delle funzioni fisiologiche dei due segmenti intestinali: duodeno e colon. In primo luogo, vengono descritti i metodi per valutare l'attività dell'enzima CYP3A4 che metabolizza i farmaci nel chip del duodeno, nonché la sua induzione da parte di composti prototipici come la rifampicina e la vitamina D3. In secondo luogo, i passaggi necessari per modellare "intestino permeabile" nel chip del colon sono delineati nel protocollo, con l'interruzione della barriera epiteliale eseguita utilizzando citochine caratteristiche implicate nella patogenesi dell'IBD. In breve, gli organoidi derivati da biopsie umane vengono propagati in vitro, sottoposti a digestione enzimatica e introdotti nel canale superiore del chip. In presenza di perfusione continua con mezzi arricchiti da fattori di crescita, si sviluppano in un monostrato epiteliale confluente con architettura 3D e una superficie cellulare apicale facilmente accessibile. Il compartimento inferiore del chip "vascolare" è seminato con cellule endoteliali microvascolari isolate dall'intestino tenue o crasso. L'epitelio e l'endotelio sono separati da una membrana porosa estensibile, che facilita le interazioni paracrine tra i due tessuti e, se sottoposti a deformazioni cicliche, emula i movimenti simili alla peristalsi dell'intestino umano. La co-coltura viene mantenuta nelle condizioni di flusso dinamico generate dalla perfusione luminale e vascolare con mezzi di coltura cellulare appropriati. Infine, descriviamo numerosi tipi di saggi e analisi degli endpoint che possono essere eseguiti direttamente su chip o da effluenti di colture cellulari campionati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>AlphaBioRegen</td>
			<td>ALHE15</td>
			<td>0.5 cells M/ml ; cryopreserved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>AlphaBioRegen</td>
			<td>ALHE16</td>
			<td>0.5 cells M/ml ; cryopreserved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy-derived Human Duodenal Organoids</td>
			<td>John Hopkin&#39;s University</td>
			<td>-</td>
			<td>The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy-derived Human Colonic Organoids</td>
			<td>John Hopkin&#39;s University</td>
			<td>-</td>
			<td>The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zo&#235; CM-1&#8482;&#160;Culture Module</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Culture module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orb-HM1&#8482;&#160;Hub Module</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>5% CO2, vacuum stretch, and power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1&#8482; Stretchable Chip</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pod&#8482; Portable Modules</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Portable module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Light Box</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip Cradle</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>1 per square culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip&#174;-HV Filters</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SE1M003M00</td>
			<td>0.45&#160;&#956;m&#160;PVDF filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82051-068</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld&#160;vacuum&#160;aspirator</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4930</td>
			<td>&#160;-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating&#160;pipettes</td>
			<td>Corning / Falcon</td>
			<td>357558</td>
			<td>2 mL,&#160;polystyrene, individually&#160;wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating tips</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
			<td>Sterile (autoclaved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological&#160;pipettes</td>
			<td></td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>2 mL, 5 mL,&#160;10 mL,&#160;and&#160;25 mL&#160;low endotoxin, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>P20, P200,&#160;P1000&#160;and standard multichannel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette&#160;tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>P20, P200,&#160;and&#160;P1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes&#160;(Protein&#160;LoBind&#174; Tubes)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030122216;&#160;0030122240</td>
			<td>15 mL, 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Tubes&#174;&#160;lo-bind</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431081</td>
			<td>1.5 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells black walled plate</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for epithelial permeability analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (with camera)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For bright-field&#160;imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (or beads)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Set to 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum set-up</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>-</td>
			<td>Minimum&#160;pressure: -70 kPa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>220033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td>Cell culture flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent-1&#160;(ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Chip coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent-2&#160;(ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Chip coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS&#160;(DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25055CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93595</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TryplE&#160;Express</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Organoids&#160;dissociation&#160;and endothelium cells&#160;detachment&#160;solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult&#8482; Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>Organoid Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22121</td>
			<td>Endothelial medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin&#8482;&#160;</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ANT-PM-1</td>
			<td>antimicrobial agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment Factor&#8482;</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>4Z0-210</td>
			<td>coating solution for flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - Growth Factor Reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Solubilized basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>ECM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>ECM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td>organoid media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-10</td>
			<td>organoid media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>Basement mebrane matrix dissociationsolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9576</td>
			<td>30%, Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25055CV</td>
			<td>Sterile, Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3KDa Dextran Cascade Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D7132</td>
			<td>10 mg powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin (RIF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# R3501</td>
			<td>CYP inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testosterone hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1500</td>
			<td>CYP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# D1530</td>
			<td>CYP inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>159002</td>
			<td>LCMS stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>157-4</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>566460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Occludin</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Claudin 4</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>36-4800</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-E-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1416</td>
			<td>epithelial adherens junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VE-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33168</td>
			<td>endothelial adherent junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>339194</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12183020</td>
			<td>RNA lysis, isolation and purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript&#8482; IV VILO&#8482; Master Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11756050</td>
			<td>reverse transcriptase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan&#8482; Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444557</td>
			<td>qPCR reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio&#8482; 5 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A28573</td>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs99999901_s1</td>
			<td>Eukaryotic 18S rRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP3A4 primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs00604506_m1</td>
			<td>Cytochrome&#160; family 3 subfamily A member 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23236</td>
			<td>Protein quantification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Tris lysis buffer</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R60TX-3</td>
			<td>Protein lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved/Total Caspase-3 Whole Cell Lysate Kit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15140D</td>
			<td>Caspase 3 detection kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15198D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex)</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15053D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>20X long-distance objective lenses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AXIOvert.A1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Brightfield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>10X objective lenses</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining human organoids and organ-on-a-chip technology to model intestinal region-specific functionality

La mucosa intestinale è una complessa barriera fisica e biochimica che svolge una miriade di funzioni importanti. Consente il trasporto, l'assorbimento e il metabolismo di nutrienti e xenobiotici, facilitando al contempo una relazione simbiotica con il microbiota e limitando l'invasione di microrganismi. L'interazione funzionale tra vari tipi di cellule e il loro ambiente fisico e biochimico è vitale per stabilire e mantenere l'omeostasi del tessuto intestinale. Modellare queste complesse interazioni e la fisiologia intestinale integrata in vitro è un obiettivo formidabile con il potenziale per trasformare il modo in cui nuovi bersagli terapeutici e farmaci candidati vengono scoperti e sviluppati.
Organoidi e tecnologie Organ-on-a-Chip sono stati recentemente combinati per generare chip intestinali rilevanti per l'uomo adatti allo studio degli aspetti funzionali della fisiologia intestinale e della fisiopatologia in vitro. Gli organoidi derivati dalle biopsie dell'intestino tenue (duodeno) e crasso vengono seminati nel compartimento superiore di un chip d'organo e quindi si espandono con successo come monostrati preservando le distinte caratteristiche cellulari, molecolari e funzionali di ciascuna regione intestinale. Le cellule endoteliali microvascolari specifiche del tessuto dell'intestino umano sono incorporate nel compartimento inferiore del chip dell'organo per ricreare l'interfaccia epitelio-endoteliale. Questa nuova piattaforma facilita l'esposizione luminale a sostanze nutritive, farmaci e microrganismi, consentendo studi sul trasporto intestinale, la permeabilità e le interazioni ospite-microbo.
Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per la creazione di chip intestinali che rappresentano il duodeno umano (chip di duodeno) e il colon (chip del colon) e la loro successiva coltura sotto flusso continuo e deformazioni simili alla peristalsi. Dimostriamo metodi per valutare il metabolismo dei farmaci e l'induzione del CYP3A4 nel chip di duodeno utilizzando induttori e substrati prototipici. Infine, forniamo una procedura passo-passo per la modellazione in vitro dell'interruzione della barriera mediata dall'interferone gamma (IFNγ) (sindrome dell'intestino permeabile) in un chip del colon, compresi i metodi per valutare l'alterazione della permeabilità paracellulare, i cambiamenti nella secrezione di citochine e la profilazione trascrittomica delle cellule all'interno del chip.

La Figura 1D riassume la cronologia della coltura del chip intestinale e illustra le cellule endoteliali intestinali e gli organoidi prima e dopo la semina sul chip. Inoltre, dimostra le distinte differenze morfologiche tra il duodeno e i chip del colon, evidenziate dalla presenza delle formazioni villi-like nel chip del duodeno e rappresentative dell'architettura del piccolo intestino.
La Figura 3A,B mostra le rispos...

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Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

Gli organoidi intestinali derivati dalla biopsia e le tecnologie organ-on-a-chips sono combinati in una piattaforma microfisiologica per ricapitolare la funzionalità intestinale specifica della regione.

Combinazione di organoidi umani e tecnologia Organ-on-a-Chip per modellare la funzionalità specifica della regione intestinale

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

Questo protocollo mostra come utilizzare organoidi intestinali derivati dalla biopsia e la tecnologia organ-on-a-chip per generare un chip intestinale fisiologicamente rilevante che può quindi essere utilizzato per prevedere la farmacocinetica e l'interazione farmaco-farmaco e per studiare la disfunzione della barriera epiteliale intestinale. L'unione degli organoidi nella tecnologia organ-on-a-chip ci consente di riprodurre la complessità dell'epitelio intestinale. Inoltre, consente un maggiore controllo sperimentale dei segnali meccanici, della distribuzione del flusso e dei gradienti biochimici.Questo metodo emula la complessa fisiologia dell'intestino umano, dando una maggiore comprensione delle basi cellulari e molecolari delle funzioni intestinali normali e patologiche. Questo aiuta a prevedere meglio la farmacocinetica e la farmacodinamica e i potenziali farmaci candidati per prevenire il danno infiammatorio. La semina è un passaggio fondamentale nel protocollo.Un'eccessiva frammentazione o un'imprecisa densità di semina dei frammenti organoidi intestinali possono compromettere lo sviluppo e la differenziazione della barriera epiteliale. Per iniziare, aspirare il mezzo dalla coltura organoide statica. Recuperare i media da un numero sufficiente di pozzi per raggiungere una densità di semina finale di otto milioni di cellule per millilitro.Aggiungere 500 microlitri di soluzione di dissociazione BMM ghiacciata a ciascun pozzetto e attaccare il BMM solubilizzato dalla superficie del pozzo. Raccogliere la sospensione in un tubo legante a basso contenuto proteico da 15 millilitri e posizionarlo sul ghiaccio. Agitare delicatamente il tubo ogni 15 minuti per un'ora.Centrifugare a 300 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius per ottenere un pellet organoide. Se si osserva uno strato di gel trasparente sopra il pellet, aspirare la soluzione dal tubo. Risospendere il pellet e aggiungere un volume uguale di soluzione di dissociazione BMM.Incubare su ghiaccio per 10 minuti e centrifugare. Ripetere fino a quando non sono presenti residui di BMM solubilizzati. Quindi scartare il surnatante e risospendere il pellet in due millilitri di soluzione di digestione organoide.Incubare il tubo a 37 gradi Celsius per uno o tre minuti e aggiungere otto millilitri di DMEM F12 avanzato per fermare la reazione enzimatica. Centrifugare e risospendere il pellet in mezzo di crescita organoide completo per ottenere otto milioni di cellule per millilitro. Aliquote 360 microlitri in provette sterili da 1,5 millilitri a basso legame proteico.Quindi, rimuovere il mezzo dal canale superiore dei trucioli rivestiti e aggiungere 30 microlitri della sospensione cellulare. Incubare i trucioli a 37 gradi Celsius durante la notte per far aderire i frammenti organoidi alla membrana. Aggiungere tre millilitri di mezzo di crescita organoide completo pre-equilibrato al serbatoio di ingresso superiore e tre millilitri di mezzo di crescita delle cellule endoteliali pre-equilibrato nel serbatoio di ingresso inferiore.Aggiungere 300 microlitri dello stesso fluido nei rispettivi serbatoi di uscita superiore e inferiore. Trasferire il vassoio che trasporta i moduli portatili nel modulo coltura. Sul modulo coltura, eseguire ripetutamente il ciclo primo fino a quando non si formano goccioline sufficienti per collegare correttamente i chip.Quindi far scorrere il portachip nel modulo portatile. Quindi avviare il ciclo di regolazione di due ore per pressurizzare i terreni di coltura nel modulo portatile e nel chip, dopodiché riprenderanno le condizioni programmate. Quindi, modifica le impostazioni di allungamento e avvia il modulo cultura.Dopo 24 ore, ripetere il ciclo con 10% di allungamento e la stessa frequenza. Per preparare il mezzo di dosaggio o il controllo del veicolo, diluire le soluzioni stock di induttori CYP o DMSO in un mezzo di crescita organoide completo e in un terreno di crescita delle cellule endoteliali. Mettere in pausa il modulo di coltura e portare i vassoi nell'armadio di biosicurezza.Sostituire il fluido in tutti i serbatoi di ingresso e uscita con due millilitri di fluido dosatore con induttori o controllo del veicolo. Riportare i moduli portatili al modulo di coltura e riavviare il flusso a 30 microlitri all'ora. Sostituire il terreno con una soluzione inducente appena preparata ogni 24 ore e continuare la coltura per 48-72 ore.Quindi portare i vassoi nell'armadio di biosicurezza e aspirare il mezzo di dosaggio da tutti i serbatoi. Lavare e sostituire il serbatoio di ingresso superiore con mezzo DMEM F12 avanzato caldo e il serbatoio inferiore con mezzo di crescita delle cellule endoteliali. Sostituire il mezzo di lavaggio con un millilitro di soluzione di substrato della sonda.Perfondere i trucioli ad una portata elevata di 1.000 microlitri all'ora per cinque minuti e aspirare i serbatoi di uscita superiore e inferiore. Riportare i chip nel modulo di coltura e incubare per un'ora sotto un flusso costante di 300 microlitri all'ora. Dopo un'ora di trattamento, interrompere il flusso e portare i vassoi nell'armadio di biosicurezza.Raccogliere 100 microlitri di effluente dal serbatoio di uscita superiore e aggiungerlo a un tubo contenente 200 microlitri di soluzione di arresto. Posizionare immediatamente le provette su ghiaccio secco e conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius. Lavare entrambi i canali con 200 microlitri di DPBS sterile.Quindi bloccare l'uscita del canale inferiore con una punta della pipetta filtrante da 200 microlitri. Perfondere 50 microlitri della soluzione di dissociazione attraverso il canale inferiore e incubare per due minuti a temperatura ambiente. Assicurare il completo distacco delle cellule endoteliali e rimuovere la soluzione di dissociazione dal canale mediante pipettaggio.Ripetere il lavaggio. Quindi, bloccare l'uscita del canale superiore e perfondere 75 microlitri di tampone di lisi proteica. Lasciare inserire la punta della pipetta e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.Raccogliere i lisati cellulari in un tubo da 1,5 millilitri pipettando da cinque a 10 volte. Ripetere la perfusione e la raccolta per ottenere il completo distacco delle cellule e conservare i lisati a meno 80 gradi Celsius fino all'analisi. Per la lisi dell'RNA, seguire la stessa procedura utilizzando 150 microlitri di tampone di lisi dell'RNA.In primo luogo, preparare una soluzione di dosaggio gamma di interferone diluendo le soluzioni madre nel mezzo di crescita delle cellule endoteliali degassate. Nell'armadio di biosicurezza, rimuovere il mezzo dai serbatoi di ingresso del canale inferiore e sostituirlo con tre millilitri di soluzione di dosaggio al giorno. Quindi posizionare i vassoi nel modulo di coltura e perfondere i chip ad una portata elevata di 1.000 microlitri all'ora per cinque minuti.Passare la portata a 60 microlitri all'ora e continuare la coltura fluidica. Aggiungere 100 microlitri di DPBS per pozzetto in una piastra a parete nera a 96 pozzetti. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 50 microlitri dell'effluente da tutti i serbatoi ai rispettivi pozzi.Per preparare una curva standard, eseguire una diluizione tripla del mezzo contenente 100 microgrammi per millilitro di tre kilodalton dextran cascade blue in DPBS. Quindi eseguire deliri seriali utilizzando una diluizione triplice del mezzo di crescita delle cellule endoteliali in DPBS. Caratteristiche morfologiche distinte dei frammenti del duodeno e del colon sono state evidenziate dalla presenza delle formazioni simili a villi nel chip di duodeno che rappresentano l'architettura dell'intestino tenue.Nel chip di duodeno esposto agli induttori del citocromo P450 rifampicina e vitamina D3, c'era un'elevata espressione genica di mRNA per l'enzima metabolizzante del farmaco citocromo P450 3A4 e una maggiore attività catalitica dell'enzima citocromo P450, indicando risposte di induzione appropriate in tutti e tre i donatori di organoidi. Dopo aver trattato il monostrato epiteliale del chip del colon con interferone gamma, sono stati osservati una compromissione della morfologia cellulare e la perdita dell'epitelio colonnare. Inoltre, il trattamento con interferone gamma ha portato ad un aumento del segnale citoplasmatico delle proteine di giunzione strette e aderenti rispetto al controllo del veicolo, mostrando lo spostamento dei marcatori di giunzione stretti ZO-1 e claudina 4 e l'internalizzazione dell'occludina e della E-caderina.Un aumento significativo della permeabilità paracellulare epiteliale è stato osservato dopo 48 ore di stimolazione dell'interferone gamma sui chip del colon. Allo stesso modo, l'interferone gamma induce l'attivazione dell'apoptosi indicata dall'aumento del contenuto intracellulare della caspasi 3 scissa. L'interferone gamma ha indotto una secrezione polarizzata di molecole pro-infiammatorie nel chip del colon, come dimostrato dalla secrezione basolaterale di VCAM-1 e interleuchina-6 e dalla secrezione apicale di ICAM-1 e proteina amiloide sierica A. Per una coltura di chip intestinali di successo, si dovrebbero utilizzare organoidi indifferenziati e seguire le istruzioni di frammentazione e densità di semina.Dopo aver stabilito con successo il chip intestinale, possiamo studiare l'assorbimento, il trasporto e il metabolismo intestinale, i livelli di nutrienti e la secrezione ormonale intestinale, le interazioni dei patogeni del microbico ospite, la sicurezza e l'efficacia dei farmaci, i meccanismi della malattia specifici del paziente e le risposte alle terapie.

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