Name: combining human organoids and organ-on-a-chip technology to model intestinal region-specific functionality
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality at JoVE.com

우리는 장 생검 유래 오가노이드를 제공 한 Mark Donowitz 교수와 칩, 휴대용 및 문화 모듈의 과학적 삽화를 설계 한 Brett Clair에게 감사드립니다. 나머지 모든 과학적 삽화는 BioRender를 사용하여 생성되었습니다.

참고: 모든 세포 배양은 적절한 무균 기술을 사용하여 처리되어야 합니다.
이 연구에 사용 된 인간 장 오가노이드는 존스 홉킨스 대학에서 얻었으며 모든 방법은 승인 된 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. 모든 실험 프로토콜은 존스 홉킨스 대학 기관 검토위원회 (IRB #NA 00038329)의 승인을 받았다.
1. 세포배양시약의 제조
<ol><li>제조업체의...

<ol>
	<li>Fritz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+clinically+relevant+drug-metabolizing+enzymes+along+the+human+intestine+and+their+correlation+to+drug+transporters+and+nuclear+receptors:+An+intra-subject+analysis.">Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).</li><li>Okumura, R., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+intestinal+homeostasis+by+mucosal+barriers.">Maintenance of intestinal homeostasis by mucosal barriers.</a> Inflammation and Regeneration. 38 (1), 1-8 (2018).</li><li>Delgado, M. 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J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow.">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).</li><li>Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+motility:+From+bench+side+to+bedside.">Colonic motility: From bench side to bedside.</a> Morgan &amp; Claypool Life Sciences. , (2010).</li><li>Basson, M. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+in+inflammatory+bowel+disease.">Adhesion molecules in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 36 (5), 724-730 (1995).</li><li>Uhlar, C. M., Whitehead, A. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunocompetent+organ-on-chip+platforms+allow+safety+profiling+of+tumor-targeted+t-cell+bispecific+antibodies.">Human immunocompetent organ-on-chip platforms allow safety profiling of tumor-targeted t-cell bispecific antibodies.</a> eLife. 10, 67106 (2021).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+engineering+human+pathophysiology+with+organs-on-chips.">Reverse engineering human pathophysiology with organs-on-chips.</a> Cell. 164 (6), 1105-1109 (2016).</li></ol>

장기 온 칩 기술과 장내 오가노이드의 결합은 인간의 장 생리학 및 병리 생리학의 정확한 모델링을 약속합니다. 여기서, 우리는 미세유체 장치에서 공동 배양된 생검 유래 소장 또는 결장 상피 및 장 미세혈관 내피 세포를 함유하는 장 칩의 확립을 위한 간단하고 강력한 단계별 프로토콜( 도 1에 요약됨)을 제공한다. 인간 창자에 대한 이 칩 기반 시뮬레이션은 생리적, 발광적...

인간의 창자는 자기 재생이 가능한 복잡하고 멀티 태스킹 기관입니다. 그것은 소장과 대장으로 나뉩니다. 소장의 주요 기능은 위장에서 나오는 음식을 더 소화하고 모든 영양소를 흡수하며 잔류 물을 대장으로 전달하여 물과 전해질을 회수하는 것입니다. 소장은 해부학적으로 구별되는 여러 영역으로 더 나뉘어집니다 : 십이지장, 제주눔 및 장폐색은 각각 특정 기능을 수행하도록 조정됩니다. 예를 들어, 십이지장은 제주눔에서 단백질, 탄수화물, 비타민 및 미네랄을 포함하는 영양소의 적절한 흡수를 가능하게하기 위해 chyme (위 내용물)을 분해하는 데 도움이됩니다. 소장의 이러한 근위 부분은 또한 장내 약물 흡수 및 대사의 주요 부위이며, 장폐색 및 결장1에서의 발현에 비해 약물 대사 효소 (예를 들어, CYP3A4)의 발현이 더 높은 것을 특징으로합니다. 영양소의 소화 및 흡수에 대한 주요 역할 외에도 창자는 병원성 미생물, 미생물 대사 산물,식이 항원 및 독소 2,3과 같은 잠재적으로 유해한 발광 내용물에 대한 효과적인 장벽이기도합니다. 인간의 결장에는 많은 수의 미생물이 서식하고 있으며, 인체의 총 세포보다 훨씬 많으며 영양, 신진 대사 및 면역에 많은 이점을 제공한다는 점은 주목할 만합니다. 따라서, 장 상피 세포에 의해 형성된 점막 장벽의 완전성의 유지는 불필요한 면역 세포 활성화를 피하기 위해 이들을 물리적으로 분리함으로써 장내 미생물과 숙주 세포 사이의 공생 관계를 허용하는 데 매우 중요하다2. 또한, 프로그램된 장 세포 사멸은 감염된 세포가 지속되거나 증식하는 것을 방지하여 잠재적 병원체3를 전파하는 것을 방지하는 자기 보호 메커니즘으로서 필수적인 역할을 하며, 사흘에서 칠일마다 장 상피의 지속적인 자기 재생은 장벽 완전성과 조직 항상성을 보장하는 세포 손실을 보상합니다. 영양 흡수, 장벽 완전성 또는 장 세포 사멸 및 자기 재생의 불균형을 포함하여 설명 된 장 기능의 손상은 영양 실조 및 염증성 장 질환 (IBD)2,3을 포함한 다양한 위장 장애의 발달을 초래할 수 있습니다.
이전에, 동물 모델 및 형질전환된 암 유래 장 세포주는 인간 장 조직의 생리학적 및 병리생리학적 기능을 연구하는데 사용되어 왔다. 그러나, 두 종 사이에 상당한 불균형의 존재로 인한 인간에 대한 동물 연구의 번역성에 대한 점점 더 두드러진 우려는 인간 관련 대안 방법4에 대한 필요성을 강조했다. 일반적으로 사용되는 시험관내 장 세포주는 T84, Caco-2 및 HT29 세포를 포함한다. 그들은 장 장벽 기능과 막 수송의 특정 측면을 모방하지만, 약물 대사 효소5, 표면 수용체 및 수송체4의 변경된 발현을 특징으로합니다. 또한, 그들은 장 세그먼트 특이성이 부족하고 장 상피의 복잡성을 회복하지 못하며, 각 모델은 장내에 존재하는 다섯 가지 상피 세포 유형 중 하나만 포함합니다6.
최근에, 소장 및 결장7,8 또는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)9의 신선한 생검으로부터 확립된 인간 장 오가노이드 배양물이 미래에 동물 실험을 보완, 감소 및 대체할 수 있는 잠재력을 갖는 대안적인 실험 모델로서 도입되었다. iPSC는 비침습적 방식으로 얻을 수 있지만, iPSC로부터 오가노이드를 확립하려면 복잡하고 긴 프로토콜(몇 가지 실험 단계 포함)을 사용해야 하며 인간 태아 조직과 유사한 배양물을 생성합니다. 대조적으로, 생검 유래 오가노이드는 장 조직의 고유 한 재생 능력을 활용할 수 있고 시험관 내에서 무기한 계대 및 전파 될 수 있기 때문에 확장성이 뛰어납니다. 중요하게도, 생검 유래 오가노이드는 이들이 개발된 일차 조직의 질환 및 장 부위 특이적 특성을 유지하고 장 상피의 세포 다양성을 에뮬레이트한다. 오가노이드는 다양한 위장 장애의 생물학 및 병인을 풀고 치료 관리를 개선하기 위해 시험관 내에서 환자 특이적 아바타로 사용할 수 있습니다. 장내 오가노이드는 인상적인 수준의 생리적 기능을 달성했지만, 혈관, 결합 조직, 말초 신경 및 면역 세포를 포함한 중요한 기질 구성 요소와 기계적 자극이 없기 때문에 네이티브 기관의 복잡성을 재현하지 못합니다. 유동, 전단 응력, 스트레치 및 압력과 같은 기계적 파라미터 는 생체내에서 조직 형태형성 및 항상성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 이전에 시험관내10,11,12,13에서 세포의 성숙을 향상시키는 것으로 나타났다. 오가노이드 시스템의 또 다른 중요한 단점은 내강이 접근 할 수 없기 때문에 상피의 정점 측에 접근 할 수 없다는 것입니다. 이는 이온 및 약물 수송체의 편광된 발현, 숙주-마이크로바이옴 상호작용, 및 제약 독성 시험과 관련된 다양한 메카니즘을 조사하기 위한 도전을 제시한다. 마지막으로, 오가노이드 배양물은 시험관내 자기 조직 과정 및 세포 운명 선택의 확률적 특성으로 인해 크기, 형태학 및 기능면에서 상당한 변동성을 겪습니다. 따라서 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 재생 의학에서 장 오가노이드의 잠재력을 최대한 실현하려면 오가노이드 개발의 변동성을 줄이고 발광 구획에 대한 접근성을 향상 시키며 누락 된 세포 - 세포 상호 작용을 통합하는 새로운 전략을 모색 할 필요가 있습니다.
Organ-on-a-Chip 기술은 시험관 내에서 장내 세포 배양물에 기계적 힘과 유체 흐름을 통합하기위한 많은 기술을 도입했습니다. 그러나, 초기 개념 증명 연구의 대부분은 충분한 세포 다양성을 나타내지 않은 암 유래 세포주를 사용했기 때문에, 이들 시스템의 관련성에 의문이 제기되어 왔다. 최근에, 우리는 장내 오가노이드와 장기 온 칩 기술을 시너지 효과로 결합하여 각 접근법의 최상의 특징을 하나의 시험관 내 시스템14,15,16에 통합했습니다. 그 결과 장-칩은 장 상피의 다세포 구조, 상피-내피 조직 계면의 존재, 유체 흐름과 스트레칭의 기계적 힘을 되새겨 시험관 내에서 장기 수준 기능의 에뮬레이션을 가능하게 합니다. 추가적으로, 출발 물질로서 원발-조직 유래 오가노이드(인간 장의 상이한 영역으로부터 샘플링될 수 있음)의 사용은 인간 십이지장, 제주눔, 장폐색 및 결장을 나타내는 칩이 유사한 시딩 및 배양 절차에 따라 확립될 수 있기 때문에, 이 모델의 다재다능성을 증가시킨다. 중요하게도, 장-칩은 다음과 같은 실시간 평가를 가능하게 한다: 장 장벽 완전성; 브러쉬 경계 및 약물-대사 효소의 활성; 뮤신의 생산; 사이토카인의 분비; 이전에 발표 된 보고서에서 입증 된 바와 같이 장내 세포와 병원성 및 공생 미생물의 상호 작용. 특히, 다른 개인의 조직에서 생성 된 오가노이드를 사용하여 장 칩을 확립했을 때,이 모델은 다양한 약물 및 치료에 대한 기능적 반응에서 예상되는 기증자 간 변동성을 포착했습니다. 전체적으로 오가노이드를 Organ-on-a-Chip 기술과 병합하면 시험관 내 발견의 생리적 관련성과 정확성뿐만 아니라 인간에 대한 외삽을 향상시킬 수있는보다 진보되고 개인화 된 생체 관련 모델의 문이 열립니다. 여기에서, 장 칩을 확립하고 두 장의 세그먼트의 생리 기능 연구에 적용하기위한 상세한 프로토콜이 제시됩니다 : 십이지장과 결장. 먼저, 십이지장 칩에서 약물 대사 효소 CYP3A4의 활성을 평가하는 방법뿐만 아니라 리팜피신 및 비타민 D3와 같은 원형 화합물에 의한 그의 유도가 기재되어 있다. 둘째, 결장 칩에서 "새는 장"을 모델링하는 데 필요한 단계는 프로토콜에 요약되어 있으며, 상피 장벽의 붕괴는 IBD의 발병기전에 연루된 특징적인 사이토카인을 사용하여 수행됩니다. 간략하게, 인간 생검으로부터 유래된 오가노이드는 시험관내에서 전파되고, 효소적 소화를 겪고, 칩의 상부 채널에 도입된다. 성장 인자가 풍부한 배지와의 지속적인 관류가 존재할 때 그들은 3D 아키텍처와 쉽게 접근 할 수있는 정점 세포 표면을 갖춘 합류 상피 단층으로 발전합니다. 바닥, "혈관" 칩 구획은 소장 또는 대장으로부터 분리된 미세혈관 내피 세포로 시딩된다. 상피와 내피는 다공성 연신 가능한 막으로 분리되어 두 조직 간의 파라크린 상호 작용을 용이하게하고 순환 변형을 겪을 때 인간의 내장의 연동 운동과 같은 움직임을 모방합니다. 공동-배양은 적절한 세포 배양 배지를 사용한 발광 및 혈관 관류에 의해 생성된 동적 유동 조건 하에서 유지된다. 마지막으로, 우리는 온칩 또는 샘플링 된 세포 배양 유출물에서 직접 수행 할 수있는 수많은 유형의 분석 및 종점 분석을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>AlphaBioRegen</td>
			<td>ALHE15</td>
			<td>0.5 cells M/ml ; cryopreserved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>AlphaBioRegen</td>
			<td>ALHE16</td>
			<td>0.5 cells M/ml ; cryopreserved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy-derived Human Duodenal Organoids</td>
			<td>John Hopkin&#39;s University</td>
			<td>-</td>
			<td>The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy-derived Human Colonic Organoids</td>
			<td>John Hopkin&#39;s University</td>
			<td>-</td>
			<td>The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zo&#235; CM-1&#8482;&#160;Culture Module</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Culture module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orb-HM1&#8482;&#160;Hub Module</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>5% CO2, vacuum stretch, and power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1&#8482; Stretchable Chip</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pod&#8482; Portable Modules</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Portable module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Light Box</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip Cradle</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>1 per square culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip&#174;-HV Filters</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SE1M003M00</td>
			<td>0.45&#160;&#956;m&#160;PVDF filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82051-068</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld&#160;vacuum&#160;aspirator</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4930</td>
			<td>&#160;-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating&#160;pipettes</td>
			<td>Corning / Falcon</td>
			<td>357558</td>
			<td>2 mL,&#160;polystyrene, individually&#160;wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating tips</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
			<td>Sterile (autoclaved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological&#160;pipettes</td>
			<td></td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>2 mL, 5 mL,&#160;10 mL,&#160;and&#160;25 mL&#160;low endotoxin, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>P20, P200,&#160;P1000&#160;and standard multichannel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette&#160;tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>P20, P200,&#160;and&#160;P1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes&#160;(Protein&#160;LoBind&#174; Tubes)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030122216;&#160;0030122240</td>
			<td>15 mL, 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Tubes&#174;&#160;lo-bind</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431081</td>
			<td>1.5 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells black walled plate</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for epithelial permeability analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (with camera)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For bright-field&#160;imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (or beads)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Set to 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum set-up</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>-</td>
			<td>Minimum&#160;pressure: -70 kPa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>220033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td>Cell culture flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent-1&#160;(ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Chip coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent-2&#160;(ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Chip coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS&#160;(DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25055CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93595</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TryplE&#160;Express</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Organoids&#160;dissociation&#160;and endothelium cells&#160;detachment&#160;solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult&#8482; Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>Organoid Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22121</td>
			<td>Endothelial medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin&#8482;&#160;</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ANT-PM-1</td>
			<td>antimicrobial agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment Factor&#8482;</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>4Z0-210</td>
			<td>coating solution for flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - Growth Factor Reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Solubilized basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>ECM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>ECM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td>organoid media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-10</td>
			<td>organoid media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>Basement mebrane matrix dissociationsolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9576</td>
			<td>30%, Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25055CV</td>
			<td>Sterile, Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3KDa Dextran Cascade Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D7132</td>
			<td>10 mg powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin (RIF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# R3501</td>
			<td>CYP inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testosterone hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1500</td>
			<td>CYP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# D1530</td>
			<td>CYP inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>159002</td>
			<td>LCMS stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>157-4</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>566460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Occludin</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Claudin 4</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>36-4800</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-E-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1416</td>
			<td>epithelial adherens junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VE-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33168</td>
			<td>endothelial adherent junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>339194</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12183020</td>
			<td>RNA lysis, isolation and purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript&#8482; IV VILO&#8482; Master Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11756050</td>
			<td>reverse transcriptase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan&#8482; Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444557</td>
			<td>qPCR reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio&#8482; 5 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A28573</td>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs99999901_s1</td>
			<td>Eukaryotic 18S rRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP3A4 primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs00604506_m1</td>
			<td>Cytochrome&#160; family 3 subfamily A member 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23236</td>
			<td>Protein quantification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Tris lysis buffer</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R60TX-3</td>
			<td>Protein lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved/Total Caspase-3 Whole Cell Lysate Kit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15140D</td>
			<td>Caspase 3 detection kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15198D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex)</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15053D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>20X long-distance objective lenses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AXIOvert.A1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Brightfield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>10X objective lenses</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining human organoids and organ-on-a-chip technology to model intestinal region-specific functionality

장 점막은 무수한 중요한 기능을 수행하는 복잡한 물리적, 생화학적 장벽입니다. 그것은 영양소와 이종 바이오틱스의 운반, 흡수 및 신진 대사를 가능하게하면서 미생물과의 공생 관계를 촉진하고 미생물의 침입을 제한합니다. 다양한 세포 유형과 물리적 및 생화학적 환경 간의 기능적 상호 작용은 장 조직 항상성을 확립하고 유지하는 데 필수적입니다. 이러한 복잡한 상호 작용과 통합 된 장 생리학을 시험관 내에서 모델링하는 것은 새로운 치료 표적 및 약물 후보가 발견되고 개발되는 방식을 변화시킬 수있는 잠재력을 가진 강력한 목표입니다.
Organoids 및 Organ-on-a-Chip 기술은 최근 시험 관 내에서 장 생리학 및 병리 생리학의 기능적 측면을 연구하는 데 적합한 인간 관련 장 칩을 생성하기 위해 결합되었습니다. 소장 (십이지장) 및 대장의 생검에서 유래 된 오가노이드는 장기 칩의 상부 구획에 시딩 된 다음 각 장 영역의 뚜렷한 세포, 분자 및 기능적 특징을 보존하면서 단층으로 성공적으로 확장됩니다. 인간 장 조직-특이적 미세혈관 내피 세포는 상피-내피 계면을 재생성하기 위해 기관 칩의 하부 구획에 혼입된다. 이 새로운 플랫폼은 영양소, 약물 및 미생물에 대한 발광 노출을 용이하게하여 장 수송, 투과성 및 숙주 - 미생물 상호 작용에 대한 연구를 가능하게합니다.
여기서, 인간 십이지장 (십이지장 칩) 및 결장 (결장 칩)을 나타내는 장 칩의 확립을 위한 상세한 프로토콜이 제공되고, 이들의 후속 배양은 연속 유동 및 연동 유사 변형 하에서 제공된다. 우리는 원형 유도제 및 기질을 사용하여 십이지장 칩에서 약물 대사 및 CYP3A4 유도를 평가하는 방법을 시연합니다. 마지막으로, 우리는 결장 칩에서 인터페론 감마(IFNγ) 매개 장벽 파괴(leaky gut syndrome)의 시험관 내 모델링을 위한 단계별 절차를 제공하며, 칩 내 세포의 부세포 투과성의 변화, 사이토카인 분비의 변화, 및 전사체 프로파일링을 평가하는 방법을 포함한다.

도 1D 는 장 칩 배양의 타임라인을 요약하고, 칩 상에 시딩하기 전과 시의 장 내피 세포 및 오가노이드를 예시한다. 또한, 십이지장과 결장 칩 사이의 뚜렷한 형태 학적 차이를 보여 주며, 십이지장 칩에 융모와 같은 형성의 존재와 작은 장 구조의 대표에 의해 강조됩니다.
도 3A,B는 3개의 상이한 오가노이드 공여체로부?...

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Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

생검 유래 장 오가노이드 및 장기 온 칩 기술은 미세 생리학 플랫폼으로 결합되어 영역 별 장 기능을 재구성합니다.

인간 오가노이드와 장기 온 칩 기술을 결합하여 장 영역별 기능 모델링

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

이 프로토콜은 생검 유래 장 오가노이드 및 장기 온 칩 기술을 사용하여 생리학적으로 관련된 장 칩을 생성한 다음 약동학 및 약물-약물 상호 작용을 예측하고 장 상피 장벽 기능 장애를 연구하는 데 사용할 수 있는 방법을 보여줍니다. organ-on-a-chip 기술에 유기체를 결합하면 장 상피의 복잡성을 재현 할 수 있습니다. 또한 기계적 단서, 유동 분포 및 생화학적 구배에 대한 더 큰 실험적 제어를 가능하게 합니다.이 방법은 인간 장의 복잡한 생리학을 모방하여 정상 및 병리학 적 장 기능의 세포 및 분자 적 기초에 대한 더 큰 이해를 제공합니다. 이는 약동학 및 약력학을 더 잘 예측하고 염증 손상을 예방할 수 있는 잠재적 약물 후보를 예측하는 데 도움이 됩니다. 시드는 프로토콜에서 중요한 단계입니다.장 오가노이드 단편의 과도한 단편화 또는 부정확한 파종 밀도는 상피 장벽의 발달 및 분화를 손상시킬 수 있습니다. 시작하려면 정적 오가노이드 배양에서 배지를 흡입합니다. 밀리리터당 800만 세포의 최종 파종 밀도를 달성하기 위해 충분한 웰에서 배지를 회수합니다.500 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 BMM 해리 용액을 각 웰에 첨가하고 가용화된 BMM을 웰 표면으로부터 부착한다. 현탁액을 15 밀리리터의 저 단백질 결합 튜브에 모아서 얼음 위에 놓습니다. 1 시간 동안 15 분마다 튜브를 부드럽게 흔 듭니다.섭씨 4도에서 5분 동안 G를 300배로 원심분리하여 오가노이드 펠렛을 얻었다. 펠릿 위에 투명한 겔 층이 관찰되면 튜브에서 용액을 흡입하십시오. 펠릿을 다시 현탁시키고 동일한 부피의 BMM 해리 용액을 추가합니다.얼음 위에서 10 분 동안 배양하고 원심 분리합니다. 가용화된 BMM 잔류물이 없을 때까지 반복합니다. 그런 다음 상청액을 버리고 2 밀리리터의 오가노이드 소화 용액에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.튜브를 섭씨 37도에서 1-3 분 동안 배양하고 8 밀리리터의 고급 DMEM F12를 추가하여 효소 반응을 중지시킵니다. 펠릿을 원심분리하고 완전한 오가노이드 성장 배지에 재현탁하여 밀리리터당 800만 개의 세포를 달성합니다. 분취량 360 마이크로리터를 멸균 1.5 밀리리터 저단백질 결합 튜브에 담았습니다.다음으로, 코팅된 칩의 상단 채널로부터 배지를 제거하고 30 마이크로리터의 세포 현탁액을 첨가한다. 칩을 섭씨 37도에서 밤새 배양하여 오가노이드 조각을 막에 부착시킵니다. 3 밀리리터의 사전 평형 된 완전한 유기체 성장 배지를 상단 입구 저장소에 추가하고 3 밀리리터의 사전 평형 된 내피 세포 성장 배지를 하단 입구 저장소에 추가합니다.각각의 상단 및 하단 배출구 저장소에 동일한 매체 300 마이크로 리터를 추가하십시오. 휴대용 모듈을 운반하는 트레이를 배양 모듈로 옮깁니다. 배양 모듈에서 칩을 성공적으로 연결하기에 충분한 액적이 형성될 때까지 프라임 사이클을 반복적으로 실행합니다.그런 다음 칩 캐리어를 휴대용 모듈에 밀어 넣습니다. 그런 다음 2시간의 긴 조절 주기를 시작하여 휴대용 모듈과 칩의 배양 배지에 압력을 가한 후 프로그래밍된 조건이 다시 시작됩니다. 다음으로, 스트레치 설정을 변경하고 문화권 모듈을 시작합니다.24 시간 후, 10 % 스트레칭과 동일한 빈도로주기를 반복하십시오. 투여 배지 또는 비히클 대조군을 준비하기 위해, CYP 유도제 스톡 용액 또는 DMSO를 완전한 오가노이드 성장 배지 및 내피 세포 성장 배지로 희석한다. 배양 모듈을 일시 중지하고 트레이를 생물안전 캐비닛으로 가져옵니다.모든 입구 및 출구 저장소의 매체를 인덕터 또는 차량 제어 장치가 있는 2밀리리터의 투여 매체로 교체하십시오. 휴대용 모듈을 배양 모듈로 다시 돌려보내고 시간당 30마이크로리터로 흐름을 다시 시작합니다. 배지를 24시간마다 새로 준비된 유도 용액으로 교체하고 48 내지 72시간 동안 배양을 계속한다.그런 다음 트레이를 생물 안전 캐비닛으로 가져 와서 모든 저장소에서 투여 매체를 흡입하십시오. 세척하고 상단 입구 저장소를 따뜻한 고급 DMEM F12 배지로 교체하고 하단 저장소를 내피 세포 성장 배지로 교체합니다. 세척 매체를 1 밀리리터의 프로브 기판 용액으로 교체하십시오.칩을 시간당 1, 000 마이크로 리터의 높은 유속으로 5 분 동안 관류하고 상단 및 하단 출구 저장소를 모두 흡입하십시오. 칩을 배양 모듈로 되돌리고 시간당 300 마이크로 리터의 일정한 흐름 하에서 1 시간 동안 배양한다. 1 시간의 치료 후, 흐름을 멈추고 트레이를 생물 안전 캐비닛으로 가져옵니다.상단 출구 저장소에서 100 마이크로 리터의 유출 물을 수집하고 200 마이크로 리터의 정지 용액이 들어있는 튜브에 첨가하십시오. 튜브를 즉시 드라이 아이스에 놓고 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 200 마이크로 리터의 멸균 DPBS로 두 채널을 모두 세척하십시오.그런 다음 200 마이크로 리터 필터 피펫 팁으로 하단 채널 배출구를 막습니다. 50 마이크로리터의 해리 용액을 바닥 채널을 통해 관류시키고 실온에서 2분 동안 배양한다. 내피 세포의 완전한 분리를 보장하고 피펫팅으로 채널에서 해리 용액을 제거합니다.세척을 반복하십시오. 다음으로, 상단 채널 배출구를 차단하고 75 마이크로 리터의 단백질 용해 완충액을 관류하십시오. 피펫 팁을 삽입한 상태로 두고 실온에서 5분 동안 배양합니다.세포 용해물을 1.5 밀리리터 튜브에 5 내지 10회 피펫팅하여 수집한다. 관류 및 수집을 반복하여 세포의 완전한 분리를 얻고 분석될 때까지 용해물을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. RNA 용해의 경우 150마이크로리터의 RNA 용해 완충액을 사용하면서 동일한 절차를 따르십시오.먼저, 원액을 탈기된 내피세포 성장 배지에 희석하여 인터페론 감마 투여 용액을 제조한다. 생물안전 캐비닛에서 하단 채널 입구 저장소에서 배지를 제거하고 매일 3밀리리터의 투여 용액으로 교체합니다. 그런 다음 트레이를 배양 모듈에 넣고 칩을 시간당 1, 000 마이크로 리터의 높은 유속으로 5 분 동안 관류하십시오.유속을 시간당 60 마이크로 리터로 전환하고 유체 배양을 계속하십시오. 웰당 100마이크로리터의 DPBS를 96웰 검은색 벽 플레이트에 추가합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 모든 저장소에서 각 웰에 50 마이크로 리터의 유출 물을 추가합니다.표준 곡선을 제조하기 위해, DPBS 중 밀리리터당 100 마이크로그램의 3킬로달톤 덱스트란 캐스케이드 블루를 함유하는 배지의 3배 희석을 수행한다. 그런 다음 DPBS에서 내피 세포 성장 배지의 3 배 희석을 사용하여 연속 망상을 수행하십시오. 십이지장 및 결장 칩의 뚜렷한 형태 학적 특징은 소장의 구조를 나타내는 십이지장 칩에 융모와 같은 형성의 존재에 의해 강조되었습니다.시토크롬 P450 유도제 리팜피신 및 비타민 D3에 노출된 십이지장 칩에서 약물 대사 효소 시토크롬 P450 3A4에 대한 mRNA 유전자 발현이 상승하고 시토크롬 P450 효소의 촉매 활성이 향상되어 3가지 오가노이드 공여체 모두에 걸쳐 적절한 유도 반응을 나타냅니다. 결장 칩의 상피 단층을 인터페론 감마로 처리했을 때, 손상된 세포 형태 및 원주 상피의 손실이 관찰되었다. 또한, 인터페론 감마로 처리하면 비히클 대조군에 비해 단단하고 부착 접합 단백질의 세포질 신호가 증가하여 단단한 접합 마커 ZO-1 및 클라우딘 4의 변위와 폐색 및 E-카드헤린의 내재화를 보여줍니다.상피 세포 투과성의 현저한 증가는 결장 칩에 대한 인터페론 감마 자극 48 시간 후에 관찰되었다. 유사하게, 인터페론 감마는 절단된 Caspase 3의 세포내 함량의 증가에 의해 지시되는 세포자멸사의 활성화를 유도한다. 인터페론 감마는 VCAM-1 및 인터루킨-6의 기저측 분비와 ICAM-1 및 혈청 아밀로이드 단백질의 정점 분비에서 볼 수 있듯이 결장 칩에서 전염증성 분자의 분극 분비를 유도했습니다.장 칩의 성공적인 확립에 따라 장 흡수, 수송 및 대사, 영양소 수준 및 장 호르몬 분비, 숙주 미생물 병원체 상호 작용, 약물 안전성 및 효능, 환자 별 질병 메커니즘 및 치료법에 대한 반응을 연구 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

입체 잉크젯 인쇄 기술을 사용하여 인간의 연골 조직 제작

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

연구

생체공학

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

유전자 인코딩 FRET 기반 담즙 산성 센서를 사용하여 세포 내 담즙 산성 역학의 실시간 모니터링

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발은 미세 중력 하에서 성장

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

CRISPR-concatemer를 이용한 마우스 작은 창자 organoids에서 다중 유전자 녹아웃을위한 프로토콜

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

인간의 본질적인 Microbiota 공부 기술을 경작 하는 체 외에서 고급 적용

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases

뇌암과 신경 퇴행성 질환을 연구하기위한 인간의 신경 오르가노이드

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

개별 리포좀 간의 조성 불균질성을 검출하기 위한 정량적 형광 현미경 검사법 기반 단일 리포좀 분석

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

거대 분자 군중을 사용하여 인간의 절단 비대 흉터의 시험관 내 모델

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

인간 다능성 줄기 세포에서 성숙한 소뇌 오르가노이드의 확장 가능한 생성 및 면역 염색에 의한 특성화

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...