Name: combining human organoids and organ-on-a-chip technology to model intestinal region-specific functionality
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality at JoVE.com

Vi takker professor Donowitz for å gi tarmbiopsi-avledede organoider og Brett Clair for å designe de vitenskapelige illustrasjonene av chip-, bærbar- og kulturmodulen. Resten av de vitenskapelige illustrasjonene ble generert ved hjelp av BioRender.

MERK: Alle cellekulturer skal håndteres med riktig aseptisk teknikk.
De humane tarmorganoidene som ble brukt i denne studien ble hentet fra Johns Hopkins University, og alle metoder ble utført i samsvar med godkjente retningslinjer og forskrifter. Alle eksperimentelle protokoller ble godkjent av Johns Hopkins University Institutional Review Board (IRB #NA 00038329).
1. Fremstilling av cellekulturreagensene
<ol><li>Forbered det humane organoid ve...

<ol>
	<li>Fritz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+clinically+relevant+drug-metabolizing+enzymes+along+the+human+intestine+and+their+correlation+to+drug+transporters+and+nuclear+receptors:+An+intra-subject+analysis.">Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).</li><li>Okumura, R., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+intestinal+homeostasis+by+mucosal+barriers.">Maintenance of intestinal homeostasis by mucosal barriers.</a> Inflammation and Regeneration. 38 (1), 1-8 (2018).</li><li>Delgado, M. E., Grabinger, T., Brunner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+at+the+intestinal+epithelial+front+line.">Cell death at the intestinal epithelial front line.</a> FEBS Journal. 283 (14), 2701-2719 (2016).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+Differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology.</a> The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caco-2+cell+monolayer:+Usefulness+and+limitations.">The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+human+mini-intestines+to+the+study+of+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">The contributions of human mini-intestines to the study of intestinal physiology and pathophysiology.</a> Annual Review of Physiology. 79, 291-312 (2017).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett&#8217;s+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett&#8217;s epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).</li><li>Durel, J. F., Nerurkar, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+vertebrate+gut+morphogenesis.">Mechanobiology of vertebrate gut morphogenesis.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 63, 45-52 (2020).</li><li>Gayer, C. P., Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+mechanical+forces+on+intestinal+physiology+and+pathology.">The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology.</a> Cellular Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+activates+Piezo1+to+promote+mucin2+expression+in+goblet+cells.">Mechanical stimulation activates Piezo1 to promote mucin2 expression in goblet cells.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology (Australia). 36 (11), 3127-3139 (2021).</li><li>Navabi, N., McGuckin, M. A., Lind&#233;n, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+cell+lines+form+polarized+epithelia+with+an+adherent+mucus+layer+when+cultured+in+semi-wet+interfaces+with+mechanical+stimulation.">Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation.</a> PLoS One. 8 (7), 68761 (2013).</li><li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+human+Small+Intestine-on-a-Chip+using+biopsy-derived+organoids.">Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duodenum+intestine-chip+for+preclinical+drug+assessment+in+a+human+relevant+model.">Duodenum intestine-chip for preclinical drug assessment in a human relevant model.</a> eLife. 9, 50135 (2020).</li><li>Apostolou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microphysiological+colon+platform+to+decipher+mechanisms+driving+human+intestinal+permeability.">A novel microphysiological colon platform to decipher mechanisms driving human intestinal permeability.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (5), 1719-1741 (2021).</li><li>Jalili-Firoozinezhad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Author+correction:+A+complex+human+gut+microbiome+cultured+in+an+anaerobic+intestine-on-a-chip.">Author correction: A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 583 (2019).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+enhances+differentiation+of+jejunal+human+enteroids+in+Intestine-Chip.">Fluid shear stress enhances differentiation of jejunal human enteroids in Intestine-Chip.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), 258-271 (2021).</li><li>Sontheimer-Phelps, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon-on-a-chip+enables+continuous+in+vitro+analysis+of+colon+mucus+layer+accumulation+and+physiology.">Human colon-on-a-chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).</li><li>Tovaglieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+enhancement+of+enterohemorrhagic+E.+coli+pathogenesis+mediated+by+microbiome+metabolites.">Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites.</a> Microbiome. 7 (1), 43 (2019).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+human+organs-on-chips.">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).</li><li>Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genetic+engineering+of+human+intestinal+organoids+using+electroporation.">Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).</li><li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow.">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).</li><li>Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+motility:+From+bench+side+to+bedside.">Colonic motility: From bench side to bedside.</a> Morgan &amp; Claypool Life Sciences. , (2010).</li><li>Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradigms+for+mechanical+signal+transduction+in+the+intestinal+epithelium+-+category:+Molecular,+cell,+and+developmental+biology.">Paradigms for mechanical signal transduction in the intestinal epithelium - category: Molecular, cell, and developmental biology.</a> Digestion. 68 (4), 217-225 (2003).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression.">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> The American Journal of Pathology. 166 (2), 409-419 (2005).</li><li>Nava, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-&#947;+regulates+intestinal+epithelial+homeostasis+through+converging+&#946;-Catenin+signaling+pathways.">Interferon-&#947; regulates intestinal epithelial homeostasis through converging &#946;-Catenin signaling pathways.</a> Immunity. 32 (3), 392-402 (2010).</li><li>Madara, J. L., Stafford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-&#947;+directly+affects+barrier+function+of+cultured+intestinal+epithelial+monolayers.">Interferon-&#947; directly affects barrier function of cultured intestinal epithelial monolayers.</a> Journal of Clinical Investigation. 83 (2), 724-727 (1989).</li><li>Bruewer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+cytokines+disrupt+epithelial+barrier+function+by+apoptosis-independent+mechanisms.">Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms.</a> The Journal of Immunology. 171 (11), 6164-6172 (2003).</li><li>Jones, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+in+inflammatory+bowel+disease.">Adhesion molecules in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 36 (5), 724-730 (1995).</li><li>Uhlar, C. M., Whitehead, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+amyloid+A,+the+major+vertebrate+acute-phase+reactant.">Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant.</a> European Journal of Biochemistry. 265 (2), 501-523 (1999).</li><li>P&#233;rez-Gonz&#225;lez, C., Ceada, G., Matej&#269;i&#263;, M., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digesting+the+mechanobiology+of+the+intestinal+epithelium.">Digesting the mechanobiology of the intestinal epithelium.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 72, 82-90 (2022).</li><li>In, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterohemorrhagic+escherichia+coli+reduces+mucus+and+intermicrovillar+bridges+in+human+stem+cell-derived+colonoids.">Enterohemorrhagic escherichia coli reduces mucus and intermicrovillar bridges in human stem cell-derived colonoids.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (1), 48-62 (2016).</li><li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+organ-on-chip+reveals+intestinal+microenvironment+and+mechanical+forces+impacting+shigella+infection.">Bioengineered human organ-on-chip reveals intestinal microenvironment and mechanical forces impacting shigella infection.</a> Cell Host and Microbe. 26 (3), 435-444 (2019).</li><li>Kerns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunocompetent+organ-on-chip+platforms+allow+safety+profiling+of+tumor-targeted+t-cell+bispecific+antibodies.">Human immunocompetent organ-on-chip platforms allow safety profiling of tumor-targeted t-cell bispecific antibodies.</a> eLife. 10, 67106 (2021).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+engineering+human+pathophysiology+with+organs-on-chips.">Reverse engineering human pathophysiology with organs-on-chips.</a> Cell. 164 (6), 1105-1109 (2016).</li></ol>

Kombinasjonen av organ-on-a-chip-teknologi og tarmorganoider holder løftet for nøyaktig modellering av menneskelig tarmfysiologi og patofysiologi. Her gir vi en enkel og robust trinnvis protokoll (skissert i figur 1) for etablering av tarmbrikken som inneholder biopsi-avledet tynntarms- eller kolonepitel og tarmmikrovaskulære endotelceller dyrket i en mikrofluidisk enhet. Denne chipbaserte simuleringen av menneskets tarm inkorporerer fysiologisk, luminal og vaskulær strømning og perista...

Tykktarmen er et komplekst og multitasking organ som er i stand til selvregenerering. Det er delt inn i tynn- og tyktarmen. Tynntarmens primære funksjon er å fordøye maten som kommer fra magen, absorbere alle næringsstoffene og sende resten videre til tyktarmen, som gjenoppretter vannet og elektrolyttene. Tynntarmen er videre delt inn i flere anatomisk distinkte regioner: tolvfingertarmen, jejunum og ileum, som hver er tilpasset for å utføre spesifikke funksjoner. For eksempel bidrar tolvfingertarmen til å bryte ned chymen (mageinnholdet) for å muliggjøre riktig absorpsjon av næringsstoffer som involverer proteiner, karbohydrater, vitaminer og mineraler i jejunum. Denne proksimale delen av tynntarmen er også hovedstedet for intestinal legemiddelabsorpsjon og metabolisme, og den er preget av det høyere uttrykket av legemiddelmetaboliserende enzymer (f.eks. CYP3A4) sammenlignet med deres uttrykk i ileum og kolon1. I tillegg til hovedrollen i å fordøye og absorbere næringsstoffer, er tarmen også en effektiv barriere mot potensielt skadelig luminalt innhold, som patogene mikroorganismer, mikrobielle metabolitter, diettantigener og toksiner 2,3. Det er bemerkelsesverdig at den menneskelige tykktarmen er bebodd av et stort antall mikroorganismer, som langt overstiger det totale celler i menneskekroppen, noe som gir mange fordeler for ernæring, metabolisme og immunitet. Derfor er vedlikehold av integriteten til slimhinnebarrieren dannet av tarmepitelceller avgjørende for å tillate det symbiotiske forholdet mellom tarmmikrobiotaen og vertscellene ved fysisk å skille dem for å unngå unødvendig immuncelleaktivering2. I tillegg spiller programmert tarmcelledød en viktig rolle som en selvbeskyttende mekanisme som hindrer infiserte celler i å vedvare eller proliferere - og dermed spre potensielle patogener3 - mens kontinuerlig selvfornyelse av tarmepitel hver fjerde til syv dager kompenserer for celletapet som sikrer barriereintegritet og vevshomeostase. Svekkelser av beskrevne tarmfunksjoner, inkludert næringsopptak, barriereintegritet eller ubalanse i tarmcelledød og selvfornyelse, kan føre til utvikling av en rekke gastrointestinale sykdommer, inkludert underernæring og inflammatorisk tarmsykdom (IBD)2,3.
Tidligere har dyremodeller og transformerte kreftavledede tarmcellelinjer blitt brukt til å studere de fysiologiske og patofysiologiske funksjonene til humant tarmvev. Imidlertid fremhevet stadig mer fremtredende bekymringer om oversettbarheten av dyreforsøk til mennesker, forårsaket av tilstedeværelsen av betydelige forskjeller mellom de to artene, et behov for menneskerelevante alternative metoder4. De mest brukte in vitro tarmcellelinjene inkluderer T84, Caco-2 og HT29 celler. Mens de etterligner visse aspekter av tarmbarrierefunksjonen og membrantransporten, er de preget av et endret uttrykk for legemiddelmetaboliserende enzymer5, overflatereseptorer og transportører4. I tillegg mangler de tarmsegmentspesifisitet og klarer ikke å rekapitulere kompleksiteten til tarmepitelet, med hver modell som bare inneholder en av de fem epitelcelletypene som er tilstede i tarmen6.
Nylig ble humane intestinale organoidkulturer etablert fra ferske biopsier i tynntarmen og kolon 7,8 eller induserte pluripotente stamceller (iPSC)9 introdusert som alternative eksperimentelle modeller med potensial til å utfylle, redusere og kanskje erstatte dyreforsøk i fremtiden. Mens iPSCs kan oppnås på en ikke-invasiv måte, krever etablering av organoider fra iPSCs bruk av komplekse og lange protokoller (med flere eksperimentelle trinn) og genererer kulturer som ligner menneskelig fostervev. I motsetning til dette er biopsi-avledede organoider svært skalerbare, da de kan utnytte den iboende fornyelseskapasiteten til tarmvev og kan passeres på ubestemt tid og forplantes in vitro. Det er viktig at biopsi-avledede organoider opprettholder sykdommen og tarmregionspesifikke egenskaper av det primære vevet som de ble utviklet fra og etterligner det cellulære mangfoldet i tarmepitelet. Organoider kan brukes som pasientspesifikke avatarer in vitro for å avdekke biologien og patogenesen til ulike gastrointestinale sykdommer og forbedre deres terapeutiske behandling. Selv om tarmorganoider har oppnådd en imponerende grad av fysiologisk funksjonalitet, klarer de fortsatt ikke å reprodusere kompleksiteten til de innfødte organene på grunn av deres mangel på kritiske stromale komponenter - inkludert blodkar, bindevev, perifere nerver og immunceller - samt mekanisk stimulering. Mekaniske parametere, som strømning, skjærspenning, strekk og trykk, er kjent for å påvirke vevsmorfogenese og homeostase in vivo og ble tidligere vist å forbedre modning av celler in vitro 10,11,12,13. En ekstra viktig ulempe ved organoidsystemer er utilgjengeligheten av lumen og dermed til den apikale siden av epitelet. Dette gir en utfordring for å undersøke ulike mekanismer knyttet til det polariserte uttrykket av ion- og legemiddeltransportører, vertsmikrobiom-interaksjoner og farmasøytisk toksisitetstesting. Til slutt lider organoidkulturer av betydelig variasjon i størrelse, morfologi og funksjon, på grunn av den stokastiske naturen til in vitro selvorganiseringsprosessen og celleskjebnevalgene. Derfor, for å realisere det fulle potensialet til tarmorganoider i sykdomsmodellering, narkotikascreening og regenerativ medisin, er det nødvendig å utforske nye strategier som reduserer variasjonen i organoidutvikling, forbedrer tilgangen til luminalrommet og innlemmer manglende celle-celle-interaksjoner.
Organ-on-a-Chip-teknologi har introdusert mange teknikker for inkorporering av mekaniske krefter og væskestrøm til tarmcellekulturer in vitro. Men siden de fleste av de første proof-of-concept-studiene har brukt kreftavledede cellelinjer som ikke viste tilstrekkelig cellulært mangfold, har relevansen av disse systemene blitt stilt spørsmålstegn ved. Nylig har vi synergistisk kombinerte tarmorganoider og organ-on-a-chip-teknologi for å innlemme de beste funksjonene i hver tilnærming i ett in vitro-system 14,15,16. Den resulterende tarmbrikken rekapitulerer den multicellulære arkitekturen til tarmepitel, tilstedeværelsen av epitel-endotelvevsgrensesnitt og de mekaniske kreftene til væskestrøm og strekk, noe som muliggjør emulering av organnivåfunksjoner in vitro. I tillegg øker bruken av primære vevsavledede organoider (som kan samples fra forskjellige regioner i menneskets tarm) som utgangsmateriale denne modellens allsidighet, da sjetonger som representerer human tolvfingertarm, jejunum, ileum og kolon kan etableres etter lignende såings- og kulturprosedyrer. Det er viktig at Intestine-Chips muliggjør sanntidsvurdering av: tarmbarriereintegriteten; aktivitet av børstegrensen og stoffskifteenzymer; produksjon av muciner; sekresjon av cytokiner; og interaksjon av tarmceller med patogene og kommensale mikroorganismer, som vist i de tidligere publiserte rapportene. Spesielt når tarmflis ble etablert ved hjelp av organoider generert fra forskjellige individers vev, fanget disse modellene den forventede interdonorvariabiliteten i funksjonelle responser på ulike legemidler og behandlinger. Til sammen åpner sammenslåing av organoider med Organ-on-a-Chip-teknologi døren for mer avanserte, personlige, in vivo-relevante modeller som kan forbedre den fysiologiske relevansen og nøyaktigheten av in vitro-funnene, samt deres ekstrapolering til mennesker. Her presenteres en detaljert protokoll for å etablere tarmbrikken og dens anvendelse i studiene av fysiologiske funksjoner i de to tarmsegmentene: tolvfingertarm og kolon. For det første beskrives metodene for å vurdere aktiviteten til det legemiddelmetaboliserende enzymet CYP3A4 i tolvfingertarmbrikken, samt dets induksjon av prototypiske forbindelser som rifampicin og vitamin D3. For det andre er trinnene som kreves for å modellere "lekk tarm" i kolonbrikken skissert i protokollen, med forstyrrelsen av epitelbarrieren som utføres ved bruk av kjennetegncytokiner som er involvert i patogenesen til IBD. Kort fortalt blir organoider avledet fra humane biopsier forplantet in vitro, utsatt for enzymatisk fordøyelse og introdusert i den øverste kanalen av brikken. I nærvær av kontinuerlig perfusjon med vekstfaktorberikede medier utvikler de seg til et sammenflytende epitelmonolag med 3D-arkitektur og en lett tilgjengelig apikal celleoverflate. Det nederste,"vaskulære" chiprommet er sådd med mikrovaskulære endotelceller isolert fra tynn- eller tyktarmen. Epitelet og endotelet separeres av en porøs strekkbar membran, som letter de parakrine interaksjonene mellom de to vevene, og når de blir utsatt for sykliske deformasjoner, emulerer peristaltikklignende bevegelser av menneskets tarm. Samkulturen opprettholdes under de dynamiske strømningsforholdene som genereres av luminal og vaskulær perfusjon med passende cellekulturmedier. Til slutt beskriver vi mange typer analyser og endepunktanalyser som kan utføres direkte på chip eller fra samplede cellekulturavløp.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>AlphaBioRegen</td>
			<td>ALHE15</td>
			<td>0.5 cells M/ml ; cryopreserved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>AlphaBioRegen</td>
			<td>ALHE16</td>
			<td>0.5 cells M/ml ; cryopreserved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy-derived Human Duodenal Organoids</td>
			<td>John Hopkin&#39;s University</td>
			<td>-</td>
			<td>The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy-derived Human Colonic Organoids</td>
			<td>John Hopkin&#39;s University</td>
			<td>-</td>
			<td>The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zo&#235; CM-1&#8482;&#160;Culture Module</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Culture module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orb-HM1&#8482;&#160;Hub Module</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>5% CO2, vacuum stretch, and power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1&#8482; Stretchable Chip</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pod&#8482; Portable Modules</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Portable module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Light Box</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip Cradle</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>1 per square culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip&#174;-HV Filters</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SE1M003M00</td>
			<td>0.45&#160;&#956;m&#160;PVDF filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82051-068</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld&#160;vacuum&#160;aspirator</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4930</td>
			<td>&#160;-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating&#160;pipettes</td>
			<td>Corning / Falcon</td>
			<td>357558</td>
			<td>2 mL,&#160;polystyrene, individually&#160;wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating tips</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
			<td>Sterile (autoclaved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological&#160;pipettes</td>
			<td></td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>2 mL, 5 mL,&#160;10 mL,&#160;and&#160;25 mL&#160;low endotoxin, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>P20, P200,&#160;P1000&#160;and standard multichannel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette&#160;tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>P20, P200,&#160;and&#160;P1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes&#160;(Protein&#160;LoBind&#174; Tubes)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030122216;&#160;0030122240</td>
			<td>15 mL, 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Tubes&#174;&#160;lo-bind</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431081</td>
			<td>1.5 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells black walled plate</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for epithelial permeability analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (with camera)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For bright-field&#160;imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (or beads)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Set to 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum set-up</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>-</td>
			<td>Minimum&#160;pressure: -70 kPa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>220033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td>Cell culture flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent-1&#160;(ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Chip coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent-2&#160;(ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Chip coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS&#160;(DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25055CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93595</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TryplE&#160;Express</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Organoids&#160;dissociation&#160;and endothelium cells&#160;detachment&#160;solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult&#8482; Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>Organoid Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22121</td>
			<td>Endothelial medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin&#8482;&#160;</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ANT-PM-1</td>
			<td>antimicrobial agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment Factor&#8482;</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>4Z0-210</td>
			<td>coating solution for flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - Growth Factor Reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Solubilized basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>ECM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>ECM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td>organoid media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-10</td>
			<td>organoid media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>Basement mebrane matrix dissociationsolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9576</td>
			<td>30%, Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25055CV</td>
			<td>Sterile, Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3KDa Dextran Cascade Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D7132</td>
			<td>10 mg powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin (RIF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# R3501</td>
			<td>CYP inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testosterone hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1500</td>
			<td>CYP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# D1530</td>
			<td>CYP inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>159002</td>
			<td>LCMS stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>157-4</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>566460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Occludin</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Claudin 4</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>36-4800</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-E-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1416</td>
			<td>epithelial adherens junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VE-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33168</td>
			<td>endothelial adherent junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>339194</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12183020</td>
			<td>RNA lysis, isolation and purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript&#8482; IV VILO&#8482; Master Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11756050</td>
			<td>reverse transcriptase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan&#8482; Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444557</td>
			<td>qPCR reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio&#8482; 5 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A28573</td>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs99999901_s1</td>
			<td>Eukaryotic 18S rRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP3A4 primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs00604506_m1</td>
			<td>Cytochrome&#160; family 3 subfamily A member 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23236</td>
			<td>Protein quantification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Tris lysis buffer</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R60TX-3</td>
			<td>Protein lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved/Total Caspase-3 Whole Cell Lysate Kit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15140D</td>
			<td>Caspase 3 detection kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15198D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex)</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15053D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>20X long-distance objective lenses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AXIOvert.A1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Brightfield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>10X objective lenses</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining human organoids and organ-on-a-chip technology to model intestinal region-specific functionality

Tarmslimhinnen er en kompleks fysisk og biokjemisk barriere som oppfyller et mylder av viktige funksjoner. Det muliggjør transport, absorpsjon og metabolisme av næringsstoffer og xenobiotika samtidig som det letter et symbiotisk forhold til mikrobiota og begrenser invasjonen av mikroorganismer. Funksjonell interaksjon mellom ulike celletyper og deres fysiske og biokjemiske miljø er avgjørende for å etablere og opprettholde intestinal vevshomeostase. Modellering av disse komplekse interaksjonene og integrert tarmfysiologi in vitro er et formidabelt mål med potensial til å forandre måten nye terapeutiske mål og legemiddelkandidater oppdages og utvikles på.
Organoider og Organ-on-a-Chip-teknologier har nylig blitt kombinert for å generere human-relevante tarmbrikker som er egnet for å studere de funksjonelle aspektene ved tarmfysiologi og patofysiologi in vitro. Organoider avledet fra biopsiene i den lille (tolvfingertarmen) og tykktarmen blir sådd inn i det øverste rommet av en organbrikke og deretter vellykket utvidet som monolag samtidig som de opprettholder de distinkte cellulære, molekylære og funksjonelle egenskapene til hver tarmregion. Humane tarmvevsspesifikke mikrovaskulære endotelceller inkorporeres i bunnrommet av organbrikken for å gjenskape epitel-endotelgrensesnittet. Denne nye plattformen letter luminal eksponering for næringsstoffer, stoffer og mikroorganismer, noe som muliggjør studier av tarmtransport, permeabilitet og vert-mikrobe-interaksjoner.
Her er det gitt en detaljert protokoll for etablering av tarmflis som representerer det humane tolvfingertarmen (tolvfingertarmbrikke) og kolon (kolonbrikke), og deres påfølgende kultur under kontinuerlig strømning og peristaltikklignende deformasjoner. Vi demonstrerer metoder for å vurdere legemiddelmetabolisme og CYP3A4-induksjon i tolvfingertarmbrikke ved bruk av prototypiske induktorer og substrater. Til slutt gir vi en trinnvis prosedyre for in vitro-modellering av interferon gamma (IFNγ)-mediert barriereforstyrrelse (lekk tarm syndrom) i en tykktarmsbrikke, inkludert metoder for å evaluere endring av paracellulær permeabilitet, endringer i cytokinsekresjon og transkriptomisk profilering av cellene i brikken.

Figur 1D oppsummerer tidslinjen for tarmbrikkekulturen og illustrerer tarmens endotelceller og organoider før og ved såing på brikken. Videre demonstrerer den de distinkte morfologiske forskjellene mellom tolvfingertarmen og kolonflisene, fremhevet av tilstedeværelsen av de villi-lignende formasjonene i tolvfingertarmbrikken og representativ for tynntarmsarkitekturen.
Figur 3A,B viser fold CYP3A4-induksjonsrespons...

Watch this Scientific Journal Video about Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality at JoVE.com

Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

Biopsi-avledede tarmorganoider og organ-on-a-chips-teknologier kombineres til en mikrofysiologisk plattform for å rekapitulere regionspesifikk tarmfunksjonalitet.

Kombinere humane organoider og organ-on-a-chip-teknologi for å modellere tarmregionspesifikk funksjonalitet

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

Denne protokollen viser hvordan man bruker biopsi-avledede tarmorganoider og organ-on-a-chip-teknologi for å generere en fysiologisk relevant tarmbrikke som deretter kan brukes til å forutsi farmakokinetikk og legemiddelinteraksjon og for å studere tarmepitelbarrieredysfunksjon. Å forene organoider i organ-on-a-chip-teknologi tillater oss å reprodusere kompleksiteten i tarmepitelet. I tillegg muliggjør det større eksperimentell kontroll over mekaniske signaler, strømningsfordeling og biokjemiske gradienter.Denne metoden emulerer den komplekse fysiologien til tykktarmen, noe som gir en større forståelse av det cellulære og molekylære grunnlaget for normale og patologiske tarmfunksjoner. Dette bidrar til å bedre forutsi farmakokinetikk og farmakodynamikk og potensielle legemiddelkandidater for å forhindre inflammatorisk skade. Såing er et kritisk trinn i protokollen.Overdreven fragmentering eller unøyaktig såtetthet av tarmorganoidfragmentene kan kompromittere utviklingen og differensieringen av epitelbarrieren. For å begynne, aspirer mediet fra den statiske organoidkulturen. Gjenopprette medier fra nok brønner til å oppnå en endelig såtetthet på åtte millioner celler per milliliter.Tilsett 500 mikroliter iskald BMM-dissosiasjonsløsning til hver brønn og fest den oppløselige BMM av brønnoverflaten. Samle suspensjonen i et 15 milliliter lavproteinbindende rør og legg det på is. Rist slangen forsiktig hvert 15. minutt i en time.Sentrifuge ved 300 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius for å oppnå en organoid pellet. Hvis et gjennomsiktig gellag observeres over pelleten, aspirerer løsningen fra røret. Resuspend pelleten og legg til et likt volum BMM dissosiasjonsløsning.Inkuber på is i 10 minutter og sentrifuge. Gjenta til ingen oppløselige BMM-rester er tilstede. Kast deretter supernatanten og resuspender pelleten i to ml organoid fordøyelsesløsning.Inkuber røret ved 37 grader Celsius i ett til tre minutter og tilsett åtte milliliter avansert DMEM F12 for å stoppe den enzymatiske reaksjonen. Sentrifuge og resuspendere pelleten i komplett organoid vekstmedium for å oppnå åtte millioner celler per milliliter. Aliquot 360 mikroliter i sterile 1,5 milliliter lavproteinbindende rør.Fjern deretter mediet fra den øverste kanalen til de belagte sjetongene og tilsett 30 mikroliter av cellesuspensjonen. Inkuber sjetongene ved 37 grader Celsius over natten for å feste organoidfragmentene til membranen. Legg til tre milliliter pre-likevektet komplett organoid vekstmedium til toppinnløpsreservoaret og tre milliliter pre-likevektet endotelcellevekstmedium i det nederste innløpsreservoaret.Tilsett 300 mikroliter av samme medium i de respektive topp- og bunnutløpsreservoarene. Overfør skuffen som bærer de bærbare modulene til kulturmodulen. På kulturmodulen, kjør prime syklusen gjentatte ganger til tilstrekkelige dråper dannes for vellykket tilkobling av sjetongene.Skyv deretter sponbæreren inn i den bærbare modulen. Start deretter den to timer lange reguleringssyklusen for å presse kulturmediet i den bærbare modulen og brikken, hvoretter de programmerte forholdene vil fortsette. Deretter endrer du strekkinnstillingene og starter kulturmodulen.Etter 24 timer, gjenta syklusen med 10% strekk og samme frekvens. For å klargjøre doseringsmedier eller kjøretøykontroll, fortynn CYP-induktorlagerløsninger eller DMSO i komplett organoid vekstmedium og endotelcellevekstmedium. Sett kulturmodulen på pause og ta med brettene til biosikkerhetsskapet.Bytt ut mediet i alle innløps- og utløpsbeholderne med to milliliter doseringsmedier med induktorer eller kjøretøykontroll. Returner de bærbare modulene tilbake til kulturmodulen og start strømmen på nytt med 30 mikroliter per time. Bytt ut mediet med nylaget induserende løsning hver 24. time og fortsett kulturen i 48 til 72 timer.Ta deretter brettene til biosikkerhetsskapet og aspirer doseringsmediet fra alle reservoarene. Vask og erstatt toppinnløpsreservoaret med varmt, avansert DMEM F12 medium og bunnreservoaret med vekstmedium for endotelceller. Bytt ut vaskemediet med en milliliter sondesubstratløsning.Perfuse sjetongene med en høy strømningshastighet på 1.000 mikroliter per time i fem minutter og aspirer både topp- og bunnutløpsreservoarer. Returner sjetongene til kulturmodulen og inkuber i en time under en konstant strøm på 300 mikroliter per time. Etter en times behandling, stopp strømmen og ta skuffene til biosikkerhetsskapet.Samle 100 mikroliter avløpsvann fra det øverste utløpsreservoaret og legg det til et rør som inneholder 200 mikroliter stoppløsning. Plasser rørene umiddelbart på tørris og oppbevar prøvene ved minus 80 grader Celsius. Vask begge kanalene med 200 mikroliter steril DPBS.Blokker deretter bunnkanaluttaket med en pipettespiss på 200 mikroliter filter. Perfuse 50 mikroliter av dissosiasjonsløsningen gjennom bunnkanalen og inkuber i to minutter ved romtemperatur. Sørg for fullstendig løsrivelse av endotelcellene og fjern dissosiasjonsløsningen fra kanalen ved pipettering.Gjenta vasken. Deretter blokkerer du toppkanaluttaket og perfuserer 75 mikroliter proteinlysebuffer. La pipettespissen være satt inn og rug i fem minutter ved romtemperatur.Samle cellelysatene i et 1,5 milliliter rør ved pipettering fem til 10 ganger. Gjenta perfusjon og samling for å oppnå fullstendig løsrivelse av celler og lagre lysatene ved minus 80 grader Celsius til analyse. For RNA-lyse, følg samme prosedyre mens du bruker 150 mikroliter RNA-lysebuffer.Lag først en interferon gamma doseringsløsning ved å fortynne stamløsningene i avgasset endotelcellevekstmedium. I biosikkerhetsskapet, fjern mediet fra bunnkanalens innløpsreservoarer og erstatt det med tre milliliter doseringsløsning daglig. Legg deretter skuffene i kulturmodulen og perfuse sjetongene med en høy strømningshastighet på 1.000 mikroliter per time i fem minutter.Bytt strømningshastigheten til 60 mikroliter per time og fortsett fluidisk kultur. Tilsett 100 mikroliter DPBS per brønn i en 96-brønns svart veggplate. Ved hjelp av en flerkanalpipette tilsettes 50 mikroliter av avløpet fra alle reservoarene til de respektive brønnene.For å forberede en standardkurve, utfør en tre ganger fortynning av mediet som inneholder 100 mikrogram per milliliter tre kilodalton dextran kaskadeblå i DPBS. Utfør deretter serielle vrangforestillinger ved hjelp av en tre ganger fortynning av endotelcellevekstmedium i DPBS. Distinkte morfologiske trekk ved tolvfingertarmen og kolonflisene ble fremhevet av tilstedeværelsen av de villi-lignende formasjonene i tolvfingertarmen som representerer tynntarmens arkitektur.I duodenumbrikken eksponert for cytokrom P450-induktorene rifampicin og vitamin D3 var det et forhøyet mRNA-genuttrykk for legemiddelmetaboliserende enzym cytokrom P450 3A4 og økt katalytisk aktivitet av cytokrom P450-enzymet, noe som indikerer passende induksjonsrespons på tvers av alle tre organoiddonorene. Ved behandling av epitelmonolaget av kolonbrikken med interferon gamma ble kompromittert cellemorfologi og tap av søyleepitelet observert. Behandling med interferon gamma førte også til økt cytoplasmatisk signal av tette og adherente kryssproteiner sammenlignet med kjøretøykontroll, som viste forskyvning av tette kryssmarkører ZO-1 og claudin 4 og internalisering av okkludin og E-cadherin.En signifikant økning i epitelial paracellulær permeabilitet ble observert etter 48 timer med interferon gammastimulering på kolonflis. På samme måte induserer interferon gamma aktivering av apoptose indikert ved økning i det intracellulære innholdet i den spaltede Caspase 3. Interferon gamma induserte en polarisert sekresjon av proinflammatoriske molekyler i kolonbrikken som vist ved basolateral sekresjon av VCAM-1 og interleukin-6 og apikal sekresjon av ICAM-1 og serumamyloidprotein A.For en vellykket tarmbrikkekultur bør man bruke udifferensierte organoider og følge instruksjonene for fragmentering og såtetthet.Etter vellykket etablering av tarmbrikken kan vi studere intestinal absorpsjon, transport og metabolisme, næringsnivåer og tarmhormonsekresjon, vertsmikrobepatogeninteraksjoner, legemiddelsikkerhet og effekt, pasientspesifikke sykdomsmekanismer og respons på terapier.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menneskelig bruskvev Fabrication Bruke Tredimensjonal Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Sanntidsovervåking av Intracellulær gallesyre Dynamics Ved hjelp av en genetisk kodet FRET baserte gallesyre Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Utvikling av en Flercellede Tredimensjonal organotypiske Model of Human tarmslimhinnen Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

En protokoll for flere geneutslag i musen Små intestinale organoider ved hjelp av en CRISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

Bruke avansert In Vitro dyrking teknologi for å studere menneskelige tarmen bakterieflora

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases

Human neural Organoids for å studere Brain Cancer og nevrodegenerative sykdommer

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

En kvantitativ fluorescens mikroskopi-basert enkelt liposome-analyse for registrering av Inhomogeneity mellom individuelle liposomer

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

I Vitro Modell av Human Kutan Hypertrofisk Arrdannelse ved hjelp av makromolekylær trengsel

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Skalerbar generasjon av modne cerebellar organoider fra humane pluripotente stamceller og karakterisering ved immunstaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...