Name: combining human organoids and organ-on-a-chip technology to model intestinal region-specific functionality
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality at JoVE.com

Agradecemos ao Professor Mark Donowitz por fornecer os organoides derivados da biópsia intestinal e Brett Clair por projetar as ilustrações científicas do chip, módulo portátil e cultural. Todas as outras ilustrações científicas foram geradas usando o BioRender.

NOTA: Todas as culturas celulares devem ser manuseadas usando uma técnica asséptica adequada.
Os organoides intestinais humanos empregados neste estudo foram obtidos pela Universidade Johns Hopkins e todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos aprovados. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Johns Hopkins University Institutional Review Board (IRB #NA 00038329).
1. Preparação dos reagentes da cultura celul...

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	<li>Fritz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+clinically+relevant+drug-metabolizing+enzymes+along+the+human+intestine+and+their+correlation+to+drug+transporters+and+nuclear+receptors:+An+intra-subject+analysis.">Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).</li><li>Okumura, R., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+intestinal+homeostasis+by+mucosal+barriers.">Maintenance of intestinal homeostasis by mucosal barriers.</a> Inflammation and Regeneration. 38 (1), 1-8 (2018).</li><li>Delgado, M. 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A combinação de tecnologia organ-on-a-chip e organoides intestinais promete modelagem precisa da fisiologia intestinal humana e da fisiopatologia. Aqui, fornecemos um protocolo passo a passo simples e robusto (delineado na Figura 1) para o estabelecimento do chip intestinal contendo epitélio intestinal pequeno ou colonico derivado da biópsia e células endoteliais microvasculares intestinais co-cultivadas em um dispositivo microfluido. Esta simulação baseada em chip do intestino humano...

O intestino humano é um órgão complexo e multitarefa capaz de auto-regeneração. É dividido em intestino delgado e grande. A função primária do intestino delgado é digerir ainda mais os alimentos provenientes do estômago, absorver todos os nutrientes e passar o resíduo para o intestino grosso, que recupera a água e os eletrólitos. O intestino delgado é ainda dividido em múltiplas regiões anatomicamente distintas: o duodeno, jejunum e íleo, cada um dos quais é adaptado para executar funções específicas. Por exemplo, o duodeno ajuda a quebrar o chyme (conteúdo estomacal) para permitir a absorção adequada de nutrientes envolvendo proteínas, carboidratos, vitaminas e minerais no jejunum. Esta parte proximal do intestino delgado também é o principal local de absorção e metabolismo de drogas intestinais, e é caracterizada pela maior expressão de enzimas metabolizadoras de drogas (por exemplo, CYP3A4) em comparação com sua expressão no íleo e cólon1. Além de seu papel principal na digestão e absorção de nutrientes, o intestino também é uma barreira eficaz contra conteúdos luminosos potencialmente prejudiciais, como microrganismos patogênicos, metabólitos microbianos, antígenos dietéticos e toxinas 2,3. Vale ressaltar que o cólon humano é habitado por um grande número de microrganismos, muito superior ao total de células do corpo humano, que proporcionam muitos benefícios à nutrição, metabolismo e imunidade. Portanto, a manutenção da integridade da barreira mucosa formada pelas células epiteliais intestinais é fundamental para permitir a relação simbiótica entre a microbiota intestinal e as células hospedeiras, separando-as fisicamente para evitar a ativação desnecessária das células imunes2. Além disso, a morte celular intestinal programada desempenha um papel essencial como um mecanismo de autoproteção que impede que as células infectadas persistam ou se proliferem — assim, disseminando potenciais patógenos3 — enquanto a auto-renovação contínua do epitélio intestinal a cada quatro ou sete dias compensa a perda celular que garante a integridade da barreira e a homeostase tecidual. Os prejuízos das funções intestinais descritas, incluindo absorção de nutrientes, integridade da barreira ou desequilíbrio na morte celular intestinal e autocon renovação, podem resultar no desenvolvimento de uma série de distúrbios gastrointestinais, incluindo desnutrição e doença inflamatória intestinal (DII)2,3.
Anteriormente, modelos animais e linhas de células intestinais derivadas do câncer foram utilizadas para estudar as funções fisiológicas e fisiodicosiológicas do tecido intestinal humano. No entanto, preocupações cada vez mais proeminentes sobre a tradução da pesquisa animal para os seres humanos, causada pela presença de disparidades significativas entre as duas espécies, destacaram a necessidade de métodos alternativos relevantes para o serhumano 4. As linhas de células intestinais in vitro comumente usadas incluem células T84, Caco-2 e HT29. Enquanto imitam certos aspectos da função da barreira intestinal e do transporte de membranas, eles são caracterizados por uma expressão alterada de enzimas metabolizantes de drogas5, receptores superficiais e transportadores4. Além disso, não possuem especificidade do segmento intestinal e não conseguem recapitular a complexidade do epitélio intestinal, com cada modelo contendo apenas um dos cinco tipos de células epiteliais presentes no intestino6.
Recentemente, culturas organoides intestinais humanas estabelecidas a partir de biópsias frescas do intestino delgado e do cólon 7,8 ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC)9 foram introduzidas como modelos experimentais alternativos com potencial para complementar, reduzir e talvez substituir a experimentação animal no futuro. Embora os iPSCs possam ser obtidos de forma não invasiva, estabelecer organoides a partir de iPSCs requer o uso de protocolos complexos e demorados (com várias etapas experimentais) e gera culturas semelhantes ao tecido fetal humano. Em contraste, organoides derivados da biópsia são altamente escaláveis, pois podem aproveitar a capacidade de renovação inerente do tecido intestinal e podem ser indefinidamente passagemdos e propagados in vitro. É importante ressaltar que os organoides derivados da biópsia mantêm a doença e as características específicas da região intestinal do tecido primário do qual foram desenvolvidos e emulam a diversidade celular do epitélio intestinal. Organoides podem ser usados como avatares específicos do paciente in vitro para desvendar a biologia e a patogênese de vários distúrbios gastrointestinais e melhorar seu manejo terapêutico. Embora os organoides intestinais tenham alcançado um grau impressionante de funcionalidade fisiológica, eles ainda não conseguem reproduzir a complexidade dos órgãos nativos devido à falta de componentes estrômicos críticos — incluindo vasos sanguíneos, tecido conjuntivo, nervos periféricos e células imunes — bem como estimulação mecânica. Parâmetros mecânicos, como fluxo, estresse de cisalhamento, estiramento e pressão, são conhecidos por influenciar morfênese tecidual e homeostase in vivo e foram previamente mostrados para melhorar a maturação de células in vitro 10,11,12,13. Uma desvantagem importante adicional dos sistemas organoides é a inacessibilidade do lúmen e, portanto, para o lado apical do epitélio. Isso representa um desafio para investigar vários mecanismos associados à expressão polarizada de transportadores de íons e medicamentos, interações hospedeiro-microbioma e testes de toxicidade farmacêutica. Por fim, as culturas organoides sofrem de considerável variabilidade no tamanho, morfologia e função, devido à natureza estocástica do processo de auto-organização in vitro e escolhas de destino celular. Portanto, para perceber todo o potencial dos organoides intestinais na modelagem da doença, rastreamento de medicamentos e medicina regenerativa, é necessário explorar novas estratégias que reduzam a variabilidade no desenvolvimento organoide, melhorem o acesso ao compartimento luminal e incorporem interações células-células ausentes.
A tecnologia Organ-on-a-Chip introduziu muitas técnicas para a incorporação de forças mecânicas e fluxo de fluidos para culturas de células intestinais in vitro. No entanto, como a maioria dos estudos iniciais de prova de conceito tem usado linhas celulares derivadas do câncer que não apresentaram diversidade celular suficiente, a relevância desses sistemas tem sido questionada. Recentemente, combinamos sinergicamente organoides intestinais e tecnologia organ-on-a-chip para incorporar as melhores características de cada abordagem em um sistema in vitro 14,15,16. O intestino-chip resultante recapitula a arquitetura multicelular do epitélio intestinal, a presença da interface do tecido epitelial-endotelial, e as forças mecânicas de fluxo e estiramento de fluidos, permitindo a emulação das funções de nível de órgão in vitro. Além disso, o uso de organoides derivados do tecido primário (que podem ser amostrados de diferentes regiões do intestino humano) como material inicial aumenta a versatilidade deste modelo, pois chips representando duodeno humano, jejunum, ileum e cólon podem ser estabelecidos após procedimentos semelhantes de semeadura e cultura. É importante ressaltar que os intestino-chips permitem a avaliação em tempo real da integridade da barreira intestinal; atividade da borda da escova e enzimas de metabolismo de drogas; produção de mucinas; secreção de citocinas; e interação de células intestinais com microrganismos patogênicos e commensais, como demonstrado nos relatórios publicados anteriormente. Notavelmente, quando os chips do intestino foram estabelecidos utilizando organoides gerados a partir do tecido de diferentes indivíduos, esses modelos capturaram a variabilidade inter-doadora esperada nas respostas funcionais a vários medicamentos e tratamentos. Ao todo, a fusão de organoides com a tecnologia Organ-on-a-Chip abre as portas para modelos mais avançados, personalizados e relevantes que possam melhorar a relevância fisiológica e a precisão dos achados in vitro, bem como sua extrapolação para os seres humanos. Aqui, é apresentado um protocolo detalhado para o estabelecimento do chip intestinal e sua aplicação nos estudos das funções fisiológicas dos dois segmentos intestinais: duodeno e cólon. Em primeiro lugar, são descritos os métodos para avaliar a atividade da enzima metabolizadora cyp3A4 no chip duodeno, bem como sua indução por compostos prototípicos como rifampicina e vitamina D3. Em segundo lugar, as etapas necessárias para modelar o "intestino vazão" no chip de cólon são descritas no protocolo, com a interrupção da barreira epitelial sendo realizada usando citocinas marcantes implicadas na patogênese do IBD. Resumidamente, organoides derivados de biópsias humanas são propagados in vitro, submetidos à digestão enzimática, e introduzidos no canal superior do chip. Na presença de perfusão contínua com mídia enriquecida com fator de crescimento, eles se desenvolvem em uma monocamada epitelial confluente com arquitetura 3D e uma superfície celular apical facilmente acessível. O compartimento de chip "vascular" inferior é semeado com células endoteliais microvasculares isoladas do intestino delgado ou grande. O epitélio e o endotélio são separados por uma membrana porosa elástica, que facilita as interações paracrinas entre os dois tecidos e, quando submetidas a deformações cíclicas, emula movimentos semelhantes à peristalse do intestino humano. A cocultura é mantida sob as condições dinâmicas de fluxo geradas pela perfusão luminal e vascular com meios de cultura celular adequados. Finalmente, descrevemos inúmeros tipos de ensaios e análises de ponto final que podem ser realizadas diretamente no chip ou a partir de efluentes de cultura celular amostrada.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>AlphaBioRegen</td>
			<td>ALHE15</td>
			<td>0.5 cells M/ml ; cryopreserved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>AlphaBioRegen</td>
			<td>ALHE16</td>
			<td>0.5 cells M/ml ; cryopreserved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy-derived Human Duodenal Organoids</td>
			<td>John Hopkin&#39;s University</td>
			<td>-</td>
			<td>The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy-derived Human Colonic Organoids</td>
			<td>John Hopkin&#39;s University</td>
			<td>-</td>
			<td>The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zo&#235; CM-1&#8482;&#160;Culture Module</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Culture module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orb-HM1&#8482;&#160;Hub Module</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>5% CO2, vacuum stretch, and power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1&#8482; Stretchable Chip</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pod&#8482; Portable Modules</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Portable module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Light Box</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip Cradle</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>1 per square culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip&#174;-HV Filters</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SE1M003M00</td>
			<td>0.45&#160;&#956;m&#160;PVDF filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82051-068</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld&#160;vacuum&#160;aspirator</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4930</td>
			<td>&#160;-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating&#160;pipettes</td>
			<td>Corning / Falcon</td>
			<td>357558</td>
			<td>2 mL,&#160;polystyrene, individually&#160;wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating tips</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
			<td>Sterile (autoclaved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological&#160;pipettes</td>
			<td></td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>2 mL, 5 mL,&#160;10 mL,&#160;and&#160;25 mL&#160;low endotoxin, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>P20, P200,&#160;P1000&#160;and standard multichannel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette&#160;tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>P20, P200,&#160;and&#160;P1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes&#160;(Protein&#160;LoBind&#174; Tubes)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030122216;&#160;0030122240</td>
			<td>15 mL, 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Tubes&#174;&#160;lo-bind</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431081</td>
			<td>1.5 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells black walled plate</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for epithelial permeability analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (with camera)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For bright-field&#160;imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (or beads)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Set to 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum set-up</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>-</td>
			<td>Minimum&#160;pressure: -70 kPa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>220033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td>Cell culture flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent-1&#160;(ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Chip coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent-2&#160;(ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Chip coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS&#160;(DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25055CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93595</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TryplE&#160;Express</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Organoids&#160;dissociation&#160;and endothelium cells&#160;detachment&#160;solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult&#8482; Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>Organoid Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22121</td>
			<td>Endothelial medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin&#8482;&#160;</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ANT-PM-1</td>
			<td>antimicrobial agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment Factor&#8482;</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>4Z0-210</td>
			<td>coating solution for flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - Growth Factor Reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Solubilized basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>ECM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>ECM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td>organoid media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-10</td>
			<td>organoid media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>Basement mebrane matrix dissociationsolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9576</td>
			<td>30%, Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25055CV</td>
			<td>Sterile, Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3KDa Dextran Cascade Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D7132</td>
			<td>10 mg powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin (RIF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# R3501</td>
			<td>CYP inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testosterone hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1500</td>
			<td>CYP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# D1530</td>
			<td>CYP inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>159002</td>
			<td>LCMS stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>157-4</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>566460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Occludin</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Claudin 4</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>36-4800</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-E-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1416</td>
			<td>epithelial adherens junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VE-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33168</td>
			<td>endothelial adherent junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>339194</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12183020</td>
			<td>RNA lysis, isolation and purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript&#8482; IV VILO&#8482; Master Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11756050</td>
			<td>reverse transcriptase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan&#8482; Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444557</td>
			<td>qPCR reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio&#8482; 5 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A28573</td>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs99999901_s1</td>
			<td>Eukaryotic 18S rRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP3A4 primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs00604506_m1</td>
			<td>Cytochrome&#160; family 3 subfamily A member 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23236</td>
			<td>Protein quantification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Tris lysis buffer</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R60TX-3</td>
			<td>Protein lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved/Total Caspase-3 Whole Cell Lysate Kit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15140D</td>
			<td>Caspase 3 detection kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15198D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex)</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15053D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>20X long-distance objective lenses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AXIOvert.A1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Brightfield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>10X objective lenses</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining human organoids and organ-on-a-chip technology to model intestinal region-specific functionality

A mucosa intestinal é uma barreira física e bioquímica complexa que cumpre uma miríade de funções importantes. Permite o transporte, absorção e metabolismo de nutrientes e xenobióticos, facilitando uma relação simbiótica com a microbiota e restringindo a invasão de microrganismos. A interação funcional entre vários tipos celulares e seu ambiente físico e bioquímico é vital para estabelecer e manter a homeostase do tecido intestinal. Modelar essas interações complexas e a fisiologia intestinal integrada in vitro é um objetivo formidável com o potencial de transformar a forma como novos alvos terapêuticos e candidatos a medicamentos são descobertos e desenvolvidos.
Organoides e tecnologias organoides e organ-on-a-chip foram recentemente combinados para gerar chips intestinais relevantes para o homem adequados para estudar os aspectos funcionais da fisiologia intestinal e da fisiopatologia in vitro. Organoides derivados das biópsias do intestino delgado (duodeno) e intestino grosso são semeados no compartimento superior de um chip de órgão e, em seguida, expandem com sucesso como monocamadas, preservando as características celulares, moleculares e funcionais distintas de cada região intestinal. Células microvasculares microvasculares específicas do intestino humano são incorporadas no compartimento inferior do chip de órgão para recriar a interface epitelial-endotelial. Esta nova plataforma facilita a exposição luminal a nutrientes, drogas e microrganismos, permitindo estudos de transporte intestinal, permeabilidade e interações hospedeiro-micróbio.
Aqui, um protocolo detalhado é fornecido para o estabelecimento de chips de intestino representando o duodeno humano (chip duodeno) e cólon (chip de cólon), e sua cultura subsequente sob fluxo contínuo e deformações semelhantes à peristalse. Demonstramos métodos para avaliar o metabolismo de drogas e indução CYP3A4 no chip duodeno usando indutores e substratos prototípicos. Por fim, fornecemos um procedimento passo-a-passo para a modelagem in vitro de interferon gama (IFNγ)-mediado ruptura de barreira (síndrome do intestino vazado) em um chip de cólon, incluindo métodos para avaliar a alteração da permeabilidade paracelular, alterações na secreção de citocinas e perfil transcriômico das células dentro do chip.

A Figura 1D resume a linha do tempo da cultura do chip intestinal e ilustra as células endoteliais intestinais e organoides antes e depois de semear o chip. Além disso, demonstra as distintas diferenças morfológicas entre o duodeno e os chips de cólon, destacados pela presença das formações semelhantes a villi no chip duodeno e representativa da pequena arquitetura intestinal.
Figura 3A,B demonstram as respost...

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Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

Organoides intestinais derivados da biópsia e tecnologias de órgãos em chips são combinados em uma plataforma microfisiológica para recapitular a funcionalidade intestinal específica da região.

Combinando organoides humanos e tecnologia organ-on-a-chip para modelar funcionalidade específica da região intestinal

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

Este protocolo mostra como usar organoides intestinais derivados da biópsia e tecnologia organ-on-a-chip para gerar um chip intestinal fisiologicamente relevante que pode então ser usado para prever farmacocinéticas e interação droga-droga e para estudar disfunção da barreira epitelial intestinal. A união de organoides na tecnologia organ-on-a-chip nos permite reproduzir a complexidade do epitélio intestinal. Além disso, permite maior controle experimental das pistas mecânicas, distribuição de fluxo e gradientes bioquímicos.Este método emula a complexa fisiologia do intestino humano, dando uma maior compreensão da base celular e molecular das funções pertestinais normais e patológicas. Isso ajuda a prever melhor a farmacocinética e a farmacodinâmica e potenciais candidatos a medicamentos para evitar danos inflamatórios. A semeadura é um passo crítico no protocolo.A fragmentação excessiva ou a densidade de semeadura imprecisa dos fragmentos organoides intestinais podem comprometer o desenvolvimento e a diferenciação da barreira epitelial. Para começar, aspire o meio da cultura organoide estática. Recuperar a mídia de poços suficientes para alcançar uma densidade final de semeadura de oito milhões de células por mililitro.Adicione 500 microliters de solução de dissociação BMM gelada a cada poço e conecte o BMM solubilizado da superfície do poço. Colete a suspensão em um tubo de ligação de baixa proteína de 15 mililitros e coloque-a no gelo. Agite suavemente o tubo a cada 15 minutos por uma hora.Centrifugar a 300 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius para obter uma pelota organoide. Se uma camada de gel transparente for observada acima da pelota, aspire a solução do tubo. Resuspenda a pelota e adicione um volume igual de solução de dissociação BMM.Incubar no gelo por 10 minutos e centrífuga. Repita até que não haja resíduos de BMM solubilizados. Em seguida, descarte o supernazio e resuspenque a pelota em dois mililitros de solução de digestão organoide.Incubar o tubo a 37 graus Celsius por um a três minutos e adicionar oito mililitros de DMEM F12 avançado para parar a reação enzimática. Centrifugar e resuspengar a pelota em meio completo de crescimento organoide para alcançar oito milhões de células por mililitro. Alíquota 360 microliters em tubos de ligação de baixa proteína de 1,5 mililitros.Em seguida, remova o meio do canal superior dos chips revestidos e adicione 30 microliters da suspensão celular. Incubar os chips a 37 graus Celsius durante a noite para aderir os fragmentos organoides à membrana. Adicione três mililitros de meio de crescimento organoide completo pré-equilibrado ao reservatório superior de entrada e três mililitros de meio de crescimento de células endoteliais pré-equilibradas no reservatório de entrada inferior.Adicione 300 microliters da mesma mídia nos respectivos reservatórios de saída superior e inferior. Transfira a bandeja que transporta os módulos portáteis para o módulo de cultura. No módulo de cultura, execute repetidamente o ciclo primo até que gotículas suficientes se formem para conectar com sucesso os chips.Em seguida, deslize o porta-chips para o módulo portátil. Em seguida, inicie o ciclo de regulação de duas horas para pressurizar a mídia cultural no módulo portátil e chip após o qual as condições programadas serão retomadas. Em seguida, altere as configurações de alongamento e inicie o módulo de cultura.Após 24 horas, repita o ciclo com 10% de elasticidade e a mesma frequência. Para preparar a mídia de dosagem ou o controle do veículo, diluir as soluções de estoque de indutores CYP ou DMSO em meio de crescimento organoide completo médio e meio de crescimento celular endotelial. Pausa o módulo de cultura e leve as bandejas para o armário de biossegurança.Substitua a mídia em todos os reservatórios de entrada e saída por dois mililitros de mídia de dosagem por indutores ou controle de veículos. Devolva os módulos portáteis de volta ao módulo de cultura e reinicie o fluxo a 30 microliters por hora. Substitua a mídia por uma solução indutora recém-preparada a cada 24 horas e continue a cultura por 48 a 72 horas.Em seguida, leve as bandejas para o armário de biossegurança e aspire o meio de dosagem de todos os reservatórios. Lave e substitua o reservatório de entrada superior por médio DMEM F12 avançado e o reservatório inferior por meio de crescimento de células endoteliais. Substitua o meio de lavagem por um mililitro da solução de substrato da sonda.Perfunda os chips a uma alta vazão de 1.000 microliters por hora durante cinco minutos e aspire tanto os reservatórios de saída superior quanto inferior. Devolva os chips ao módulo de cultura e incubar por uma hora sob um fluxo constante de 300 microliters por hora. Após uma hora de tratamento, pare o fluxo e leve as bandejas para o armário de biossegurança.Colete 100 microlitres de efluentes do reservatório superior e adicione-o a um tubo contendo 200 microliters de solução stop. Coloque os tubos imediatamente em gelo seco e armazene as amostras a menos 80 graus Celsius. Lave os dois canais com 200 microliters de DPBS estéreis.Em seguida, bloqueie a saída inferior do canal com uma ponta de pipeta de filtro de 200 microliter. Perfuse 50 microliters da solução de dissociação através do canal inferior e incubar por dois minutos em temperatura ambiente. Certifique-se de desprendimento completo das células endoteliais e remova a solução de dissociação do canal por pipetação.Repita a lavagem. Em seguida, bloqueie a tomada superior do canal e peruse 75 microliters de tampão de proteína lysis. Deixe a ponta da pipeta inserida e incubar por cinco minutos em temperatura ambiente.Colete os lises celulares em um tubo de 1,5 mililitro por tubulação de cinco a dez vezes. Repita a perfusão e a coleta para obter o descolamento completo das células e armazene os lises a menos 80 graus Celsius até a análise. Para lise RNA, siga o mesmo procedimento ao usar 150 microliters de tampão de RNA lysis.Primeiro, prepare uma solução de dosagem de gama de interferon diluindo as soluções de estoque no meio de crescimento celular endotelial desgaseado. No gabinete de biossegurança, remova o meio dos reservatórios de entrada do canal inferior e substitua-o por três mililitros da solução de dosagem diariamente. Em seguida, coloque as bandejas no módulo de cultura e perfunda os chips a uma alta taxa de fluxo de 1.000 microliters por hora durante cinco minutos.Mude a vazão para 60 microliters por hora e continue a cultura fluidica. Adicione 100 microliters de DPBS por poço em uma placa murada 96-bem preta. Utilizando uma pipeta multicanal, adicione 50 microlitres do efluente de todos os reservatórios aos respectivos poços.Para preparar uma curva padrão, realize uma diluição três vezes do meio contendo 100 microgramas por mililitro de três kilodalton dextran cascata azul em DPBS. Em seguida, realize delírios seriais usando uma diluição tripla do meio de crescimento celular endotelial em DPBS. Características morfológicas distintas do duodeno e chips de cólon foram destacadas pela presença das formações semelhantes a villi no chip duodeno representando a arquitetura do intestino delgado.No chip de duodeno exposto aos indutores citocromo P450 rifampicina e vitamina D3, houve uma expressão genética mRNA elevada para a droga metabolizadora enzimática citocromo P450 3A4 e atividade catalítica aprimorada da enzima citocromo P450, indicando respostas apropriadas de indução em todos os três doadores organoides. Ao tratar a monocamada epitelial do chip de cólon com interferon gama, foram observadas morfologia celular comprometida e perda do epitélio colunaar. Além disso, o tratamento com interferon gama levou ao aumento do sinal citoplasmical de proteínas de junção apertadas e aderentes em relação ao controle do veículo, mostrando o deslocamento dos marcadores de junção apertados ZO-1 e Claudin 4 e a internalização do occludin e E-cadherin.Observou-se aumento significativo da permeabilidade epitelial paracelular após 48 horas de estimulação gama de interferon em lascas de cólon. Da mesma forma, o interferon gama induz a ativação da apoptose indicada pelo aumento do conteúdo intracelular do Caspase 3. Interferon gama induziu uma secreção polarizada de moléculas pró-inflamatórias no chip de cólon, como mostrado pela secreção basolateral de VCAM-1 e interleucina-6 e a secreção apical do ICAM-1 e da proteína amiloide do soro A.Para uma cultura bem sucedida de chip intestinal, deve-se utilizar organoides indiferenciados e seguir as instruções de fragmentação e densidade de semeadura.Após o estabelecimento bem-sucedido do chip intestinal, podemos estudar absorção intestinal, transporte e metabolismo, níveis de nutrientes e secreção hormonal intestinal, interações de patógenos de micróbios hospedeiros, segurança e eficácia medicamentosa, mecanismos de doença específicos do paciente e respostas a terapias.

Research

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Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Cartilagem Human Tissue Fabricação Usando tridimensional Inkjet Tecnologia de Impressão

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Bioengenharia

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Monitoramento em Tempo Real de intracelular Bile Ácido Dynamics usando um sensor Ácido Bile baseado em FRET codificados geneticamente

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

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Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

Aplicação avançada em Vitro cultivo tecnologia para estudar a Microbiota do intestino humano

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

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A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Um ensaio de liposcopia única baseado em microscopia quantitativa para detectar a inhomogeneidade composicional entre lipossomos individuais

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Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery

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Construção de um Modelo de Organ-On-A-Chip de Células Musculares Lisas da Aorta Humana para Recapitulação da Deformação Biomecânica na Parede Aórtica

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Isolamento regional de tecido pulmonar descelularizado para estudar interações célula-célula e célula-ECM

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue

Autor em destaque: Dissecção e isolamento de tecido pulmonar descelularizado específico da região  

Dissecção e Isolamento de Tecido Pulmonar Descelularizado Regional-Específico

Lung transplantation is often the only option for patients in the later stages of severe lung disease, but this is limited both due to the supply of ...