Name: combining human organoids and organ-on-a-chip technology to model intestinal region-specific functionality
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality at JoVE.com

Мы благодарим профессора Марка Доновица за предоставление органоидов, полученных из биопсии кишечника, и Бретта Клера за разработку научных иллюстраций чипа, портативного и культурного модуля. Все остальные научные иллюстрации были сгенерированы с использованием BioRender.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все клеточные культуры должны обрабатываться с использованием надлежащей асептической техники.
Органоиды кишечника человека, используемые в этом исследовании, были получены из Университета Джона Хопкинса, и все методы были проведены в соответствии с утвер?...

<ol>
	<li>Fritz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+clinically+relevant+drug-metabolizing+enzymes+along+the+human+intestine+and+their+correlation+to+drug+transporters+and+nuclear+receptors:+An+intra-subject+analysis.">Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).</li><li>Okumura, R., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+intestinal+homeostasis+by+mucosal+barriers.">Maintenance of intestinal homeostasis by mucosal barriers.</a> Inflammation and Regeneration. 38 (1), 1-8 (2018).</li><li>Delgado, M. E., Grabinger, T., Brunner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+at+the+intestinal+epithelial+front+line.">Cell death at the intestinal epithelial front line.</a> FEBS Journal. 283 (14), 2701-2719 (2016).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+Differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology.</a> The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caco-2+cell+monolayer:+Usefulness+and+limitations.">The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+human+mini-intestines+to+the+study+of+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">The contributions of human mini-intestines to the study of intestinal physiology and pathophysiology.</a> Annual Review of Physiology. 79, 291-312 (2017).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett&#8217;s+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett&#8217;s epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).</li><li>Durel, J. F., Nerurkar, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+vertebrate+gut+morphogenesis.">Mechanobiology of vertebrate gut morphogenesis.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 63, 45-52 (2020).</li><li>Gayer, C. P., Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+mechanical+forces+on+intestinal+physiology+and+pathology.">The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology.</a> Cellular Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+activates+Piezo1+to+promote+mucin2+expression+in+goblet+cells.">Mechanical stimulation activates Piezo1 to promote mucin2 expression in goblet cells.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology (Australia). 36 (11), 3127-3139 (2021).</li><li>Navabi, N., McGuckin, M. A., Lind&#233;n, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+cell+lines+form+polarized+epithelia+with+an+adherent+mucus+layer+when+cultured+in+semi-wet+interfaces+with+mechanical+stimulation.">Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation.</a> PLoS One. 8 (7), 68761 (2013).</li><li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+human+Small+Intestine-on-a-Chip+using+biopsy-derived+organoids.">Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duodenum+intestine-chip+for+preclinical+drug+assessment+in+a+human+relevant+model.">Duodenum intestine-chip for preclinical drug assessment in a human relevant model.</a> eLife. 9, 50135 (2020).</li><li>Apostolou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microphysiological+colon+platform+to+decipher+mechanisms+driving+human+intestinal+permeability.">A novel microphysiological colon platform to decipher mechanisms driving human intestinal permeability.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (5), 1719-1741 (2021).</li><li>Jalili-Firoozinezhad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Author+correction:+A+complex+human+gut+microbiome+cultured+in+an+anaerobic+intestine-on-a-chip.">Author correction: A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 583 (2019).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+enhances+differentiation+of+jejunal+human+enteroids+in+Intestine-Chip.">Fluid shear stress enhances differentiation of jejunal human enteroids in Intestine-Chip.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), 258-271 (2021).</li><li>Sontheimer-Phelps, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon-on-a-chip+enables+continuous+in+vitro+analysis+of+colon+mucus+layer+accumulation+and+physiology.">Human colon-on-a-chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).</li><li>Tovaglieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+enhancement+of+enterohemorrhagic+E.+coli+pathogenesis+mediated+by+microbiome+metabolites.">Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites.</a> Microbiome. 7 (1), 43 (2019).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+human+organs-on-chips.">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).</li><li>Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genetic+engineering+of+human+intestinal+organoids+using+electroporation.">Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).</li><li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow.">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).</li><li>Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+motility:+From+bench+side+to+bedside.">Colonic motility: From bench side to bedside.</a> Morgan &amp; Claypool Life Sciences. , (2010).</li><li>Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradigms+for+mechanical+signal+transduction+in+the+intestinal+epithelium+-+category:+Molecular,+cell,+and+developmental+biology.">Paradigms for mechanical signal transduction in the intestinal epithelium - category: Molecular, cell, and developmental biology.</a> Digestion. 68 (4), 217-225 (2003).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression.">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> The American Journal of Pathology. 166 (2), 409-419 (2005).</li><li>Nava, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-&#947;+regulates+intestinal+epithelial+homeostasis+through+converging+&#946;-Catenin+signaling+pathways.">Interferon-&#947; regulates intestinal epithelial homeostasis through converging &#946;-Catenin signaling pathways.</a> Immunity. 32 (3), 392-402 (2010).</li><li>Madara, J. L., Stafford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-&#947;+directly+affects+barrier+function+of+cultured+intestinal+epithelial+monolayers.">Interferon-&#947; directly affects barrier function of cultured intestinal epithelial monolayers.</a> Journal of Clinical Investigation. 83 (2), 724-727 (1989).</li><li>Bruewer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+cytokines+disrupt+epithelial+barrier+function+by+apoptosis-independent+mechanisms.">Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms.</a> The Journal of Immunology. 171 (11), 6164-6172 (2003).</li><li>Jones, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+in+inflammatory+bowel+disease.">Adhesion molecules in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 36 (5), 724-730 (1995).</li><li>Uhlar, C. M., Whitehead, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+amyloid+A,+the+major+vertebrate+acute-phase+reactant.">Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant.</a> European Journal of Biochemistry. 265 (2), 501-523 (1999).</li><li>P&#233;rez-Gonz&#225;lez, C., Ceada, G., Matej&#269;i&#263;, M., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digesting+the+mechanobiology+of+the+intestinal+epithelium.">Digesting the mechanobiology of the intestinal epithelium.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 72, 82-90 (2022).</li><li>In, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterohemorrhagic+escherichia+coli+reduces+mucus+and+intermicrovillar+bridges+in+human+stem+cell-derived+colonoids.">Enterohemorrhagic escherichia coli reduces mucus and intermicrovillar bridges in human stem cell-derived colonoids.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (1), 48-62 (2016).</li><li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+organ-on-chip+reveals+intestinal+microenvironment+and+mechanical+forces+impacting+shigella+infection.">Bioengineered human organ-on-chip reveals intestinal microenvironment and mechanical forces impacting shigella infection.</a> Cell Host and Microbe. 26 (3), 435-444 (2019).</li><li>Kerns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunocompetent+organ-on-chip+platforms+allow+safety+profiling+of+tumor-targeted+t-cell+bispecific+antibodies.">Human immunocompetent organ-on-chip platforms allow safety profiling of tumor-targeted t-cell bispecific antibodies.</a> eLife. 10, 67106 (2021).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+engineering+human+pathophysiology+with+organs-on-chips.">Reverse engineering human pathophysiology with organs-on-chips.</a> Cell. 164 (6), 1105-1109 (2016).</li></ol>

Сочетание технологии «орган на чипе» и кишечных органоидов обещает точное моделирование физиологии кишечника человека и патофизиологии. Здесь мы предоставляем простой и надежный пошаговый протокол (описанный на рисунке 1) для создания чипа кишечника, содержащего эпит...

Кишечник человека является сложным и многозадачным органом, способным к саморегенерации. Он делится на тонкую и толстую кишку. Основная функция тонкой кишки заключается в дальнейшем переваривании пищи, поступающей из желудка, поглощении всех питательных веществ и передаче остатков в толстую кишку, которая восстанавливает воду и электролиты. Тонкая кишка далее делится на несколько анатомически различных областей: двенадцатиперстной кишки, тощей кишки и подвздошной кишки, каждая из которых приспособлена для выполнения определенных функций. Например, двенадцатиперстная кишка помогает расщеплять химус (содержимое желудка), чтобы обеспечить правильное поглощение питательных веществ, включая белки, углеводы, витамины и минералы в тощей кишке. Эта проксимальная часть тонкой кишки также является основным местом всасывания и метаболизма кишечного препарата, и она характеризуется более высокой экспрессией ферментов, метаболизирующих лекарство (например, CYP3A4) по сравнению с их экспрессией в подвздошной кишке и толстой кишке1. В дополнение к своей основной роли в переваривании и поглощении питательных веществ, кишечник также является эффективным барьером против потенциально вредного просветного содержимого, такого как патогенные микроорганизмы, микробные метаболиты, диетические антигены и токсины 2,3. Примечательно, что толстая кишка человека населена большим количеством микроорганизмов, намного превышающих общее количество клеток в организме человека, которые обеспечивают множество преимуществ для питания, обмена веществ и иммунитета. Таким образом, поддержание целостности слизистого барьера, образованного эпителиальными клетками кишечника, имеет решающее значение для обеспечения симбиотических отношений между микробиотой кишечника и клетками-хозяевами путем их физического разделения, чтобы избежать ненужной активации иммунных клеток2. Кроме того, запрограммированная гибель клеток кишечника играет важную роль в качестве самозащитного механизма, предотвращающего сохранение или пролиферацию инфицированных клеток, тем самым распространяя потенциальные патогены3, в то время как непрерывное самообновление кишечного эпителия каждые четыре-семь дней компенсирует потерю клеток, обеспечивая барьерную целостность и гомеостаз тканей. Нарушения описанных функций кишечника, включая всасывание питательных веществ, целостность барьера или дисбаланс в гибели и самообновлении клеток кишечника, могут привести к развитию ряда желудочно-кишечных расстройств, включая недоедание и воспалительные заболевания кишечника (ВЗК)2,3.
Ранее животные модели и трансформированные линии клеток кишечника, полученные из рака, использовались для изучения физиологических и патофизиологических функций кишечной ткани человека. Тем не менее, все более заметные опасения по поводу переводимости исследований на животных на человека, вызванные наличием значительных различий между двумя видами, подчеркнули необходимость в альтернативных методах4, имеющих отношение к человеку. Обычно используемые клеточные линии кишечника in vitro включают клетки T84, Caco-2 и HT29. Хотя они имитируют определенные аспекты кишечной барьерной функции и мембранного транспорта, они характеризуются измененной экспрессией ферментов5, метаболизирующих лекарство, поверхностных рецепторов и транспортеров4. Кроме того, им не хватает специфичности сегмента кишечника и они не могут повторить сложность кишечного эпителия, причем каждая модель содержит только один из пяти типов эпителиальных клеток, присутствующих в кишечнике6.
Недавно человеческие кишечные органоидные культуры, созданные из свежих биопсий тонкой кишки и толстой кишки 7,8 или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC)9, были введены в качестве альтернативных экспериментальных моделей с потенциалом для дополнения, уменьшения и, возможно, замены экспериментов на животных в будущем. В то время как ИПСК могут быть получены неинвазивным способом, создание органоидов из ИПСК требует использования сложных и длительных протоколов (с несколькими экспериментальными шагами) и генерирует культуры, напоминающие ткани плода человека. Напротив, органоиды, полученные из биопсии, обладают высокой масштабируемостью, поскольку они могут использовать присущую кишечной ткани способность к обновлению и могут бесконечно проходить и размножаться in vitro. Важно отметить, что органоиды, полученные из биопсии, поддерживают специфические для заболевания и области кишечника характеристики первичной ткани, из которой они были разработаны, и имитируют клеточное разнообразие кишечного эпителия. Органоиды могут быть использованы в качестве специфических для пациента аватаров in vitro для разгадки биологии и патогенеза различных желудочно-кишечных расстройств и улучшения их терапевтического управления. Хотя кишечные органоиды достигли впечатляющей степени физиологической функциональности, они все еще не в состоянии воспроизвести сложность местных органов из-за отсутствия у них критических стромальных компонентов, включая кровеносные сосуды, соединительную ткань, периферические нервы и иммунные клетки, а также механической стимуляции. Механические параметры, такие как поток, напряжение сдвига, растяжение и давление, как известно, влияют на морфогенез тканей и гомеостаз in vivo и ранее было показано, что они улучшают созревание клеток in vitro 10,11,12,13. Дополнительным важным недостатком органоидных систем является недоступность просвета и, таким образом, апикальной стороны эпителия. Это представляет собой проблему для исследования различных механизмов, связанных с поляризованной экспрессией транспортеров ионов и лекарств, взаимодействиями между хозяином и микробиомом и тестированием фармацевтической токсичности. Наконец, органоидные культуры страдают от значительной изменчивости в размерах, морфологии и функциях из-за стохастического характера процесса самоорганизации in vitro и выбора судьбы клеток. Поэтому, чтобы реализовать весь потенциал кишечных органоидов в моделировании заболеваний, скрининге лекарств и регенеративной медицине, необходимо изучить новые стратегии, которые уменьшают вариабельность в развитии органоидов, улучшают доступ к просветному компартменту и включают недостающие взаимодействия клетки и клетки.
Технология «орган на чипе» представила множество методов для включения механических сил и потока жидкости в культуры клеток кишечника in vitro. Однако, поскольку большинство первоначальных исследований, подтверждающих концепцию, использовали клеточные линии, полученные из рака, которые не проявляли достаточного клеточного разнообразия, актуальность этих систем была поставлена под сомнение. Недавно мы синергетически объединили кишечные органоиды и технологию «орган на чипе», чтобы включить лучшие особенности каждого подхода в одну систему in vitro 14,15,16. Полученный кишечный чип рекапитулирует многоклеточную архитектуру кишечного эпителия, наличие интерфейса эпителиально-эндотелиальной ткани и механические силы потока и растяжения жидкости, что позволяет эмулировать функции на уровне органов in vitro. Кроме того, использование органоидов, полученных из первичной ткани (которые могут быть отобраны из разных областей кишечника человека) в качестве исходного материала увеличивает универсальность этой модели, поскольку чипы, представляющие двенадцатиперстную кишку человека, тошку, подвздошную кишку и толстую кишку, могут быть установлены после аналогичных процедур посева и культивирования. Важно отметить, что кишечные чипы позволяют в режиме реального времени оценивать: целостность кишечного барьера; активность ферментов границы кисти и лекарственного обмена; производство муцинов; секреция цитокинов; и взаимодействие клеток кишечника с патогенными и комменсальными микроорганизмами, как показано в ранее опубликованных отчетах. Примечательно, что когда чипы кишечника были установлены с использованием органоидов, полученных из тканей разных людей, эти модели зафиксировали ожидаемую междонорскую вариабельность функциональных реакций на различные лекарства и методы лечения. В целом, слияние органоидов с технологией Organ-on-a-Chip открывает двери для более продвинутых, персонализированных, релевантных in vivo моделей, которые могут улучшить физиологическую значимость и точность результатов in vitro, а также их экстраполяцию на людей. Здесь представлен подробный протокол установления чипа кишечника и его применения в исследованиях физиологических функций двух сегментов кишечника: двенадцатиперстной кишки и толстой кишки. Во-первых, описаны методы оценки активности лекарственно-метаболизирующего фермента CYP3A4 в чипе двенадцатиперстной кишки, а также его индукции прототипными соединениями, такими как рифампицин и витамин D3. Во-вторых, шаги, необходимые для моделирования «протекающей кишки» в чипе толстой кишки, изложены в протоколе, при этом нарушение эпителиального барьера выполняется с использованием отличительных цитокинов, участвующих в патогенезе ВЗК. Вкратце, органоиды, полученные из биопсии человека, размножаются in vitro, подвергаются ферментативному пищеварению и вводятся в верхний канал чипа. В присутствии непрерывной перфузии с обогащенными фактором роста средами они превращаются в сливающийся эпителиальный монослой с 3D-архитектурой и легкодоступной поверхностью апикальной ячейки. Нижний, «сосудистый» чип-отсек засеян микрососудистыми эндотелиальными клетками, выделенными из тонкой или толстой кишки. Эпителий и эндотелий разделены пористой растягивающейся мембраной, которая облегчает паракринные взаимодействия между двумя тканями и при воздействии циклических деформаций имитирует перистальтикоподобные движения кишечника человека. Кокультура поддерживается в условиях динамического потока, генерируемого просветной и сосудистой перфузией с соответствующими клеточными культуральными средами. Наконец, мы описываем многочисленные типы анализов и анализов конечных точек, которые могут быть выполнены непосредственно на чипе или из отобранных сточных вод клеточной культуры.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>AlphaBioRegen</td>
			<td>ALHE15</td>
			<td>0.5 cells M/ml ; cryopreserved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>AlphaBioRegen</td>
			<td>ALHE16</td>
			<td>0.5 cells M/ml ; cryopreserved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy-derived Human Duodenal Organoids</td>
			<td>John Hopkin&#39;s University</td>
			<td>-</td>
			<td>The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy-derived Human Colonic Organoids</td>
			<td>John Hopkin&#39;s University</td>
			<td>-</td>
			<td>The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zo&#235; CM-1&#8482;&#160;Culture Module</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Culture module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orb-HM1&#8482;&#160;Hub Module</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>5% CO2, vacuum stretch, and power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1&#8482; Stretchable Chip</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pod&#8482; Portable Modules</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Portable module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Light Box</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip Cradle</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>1 per square culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip&#174;-HV Filters</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SE1M003M00</td>
			<td>0.45&#160;&#956;m&#160;PVDF filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82051-068</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld&#160;vacuum&#160;aspirator</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4930</td>
			<td>&#160;-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating&#160;pipettes</td>
			<td>Corning / Falcon</td>
			<td>357558</td>
			<td>2 mL,&#160;polystyrene, individually&#160;wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating tips</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
			<td>Sterile (autoclaved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological&#160;pipettes</td>
			<td></td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>2 mL, 5 mL,&#160;10 mL,&#160;and&#160;25 mL&#160;low endotoxin, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>P20, P200,&#160;P1000&#160;and standard multichannel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette&#160;tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>P20, P200,&#160;and&#160;P1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes&#160;(Protein&#160;LoBind&#174; Tubes)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030122216;&#160;0030122240</td>
			<td>15 mL, 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Tubes&#174;&#160;lo-bind</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431081</td>
			<td>1.5 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells black walled plate</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for epithelial permeability analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (with camera)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For bright-field&#160;imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (or beads)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Set to 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum set-up</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>-</td>
			<td>Minimum&#160;pressure: -70 kPa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>220033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td>Cell culture flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent-1&#160;(ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Chip coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent-2&#160;(ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Chip coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS&#160;(DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25055CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93595</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TryplE&#160;Express</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Organoids&#160;dissociation&#160;and endothelium cells&#160;detachment&#160;solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult&#8482; Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>Organoid Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22121</td>
			<td>Endothelial medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin&#8482;&#160;</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ANT-PM-1</td>
			<td>antimicrobial agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment Factor&#8482;</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>4Z0-210</td>
			<td>coating solution for flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - Growth Factor Reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Solubilized basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>ECM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>ECM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td>organoid media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-10</td>
			<td>organoid media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>Basement mebrane matrix dissociationsolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9576</td>
			<td>30%, Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25055CV</td>
			<td>Sterile, Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3KDa Dextran Cascade Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D7132</td>
			<td>10 mg powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin (RIF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# R3501</td>
			<td>CYP inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testosterone hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1500</td>
			<td>CYP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# D1530</td>
			<td>CYP inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>159002</td>
			<td>LCMS stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>157-4</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>566460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Occludin</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Claudin 4</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>36-4800</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-E-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1416</td>
			<td>epithelial adherens junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VE-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33168</td>
			<td>endothelial adherent junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>339194</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12183020</td>
			<td>RNA lysis, isolation and purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript&#8482; IV VILO&#8482; Master Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11756050</td>
			<td>reverse transcriptase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan&#8482; Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444557</td>
			<td>qPCR reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio&#8482; 5 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A28573</td>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs99999901_s1</td>
			<td>Eukaryotic 18S rRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP3A4 primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs00604506_m1</td>
			<td>Cytochrome&#160; family 3 subfamily A member 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23236</td>
			<td>Protein quantification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Tris lysis buffer</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R60TX-3</td>
			<td>Protein lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved/Total Caspase-3 Whole Cell Lysate Kit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15140D</td>
			<td>Caspase 3 detection kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15198D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex)</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15053D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>20X long-distance objective lenses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AXIOvert.A1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Brightfield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>10X objective lenses</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining human organoids and organ-on-a-chip technology to model intestinal region-specific functionality

Слизистая оболочка кишечника представляет собой сложный физический и биохимический барьер, который выполняет множество важных функций. Он обеспечивает транспорт, поглощение и метаболизм питательных веществ и ксенобиотиков, одновременно облегчая симбиотические отношения с микробиотой и ограничивая инвазию микроорганизмов. Функциональное взаимодействие между различными типами клеток и их физической и биохимической средой имеет жизненно важное значение для установления и поддержания гомеостаза кишечной ткани. Моделирование этих сложных взаимодействий и интегрированной физиологии кишечника in vitro является сложной целью с потенциалом для преобразования способа обнаружения и разработки новых терапевтических мишеней и кандидатов в лекарства.
Органоиды и технологии Organ-on-a-Chip недавно были объединены для создания соответствующих человеку чипов кишечника, подходящих для изучения функциональных аспектов физиологии кишечника и патофизиологии in vitro. Органоиды, полученные из биопсии тонкой (двенадцатиперстной кишки) и толстой кишки, засеиваются в верхний компартмент чипа органа, а затем успешно расширяются в виде монослоев, сохраняя при этом различные клеточные, молекулярные и функциональные особенности каждой области кишечника. Специфические для тканеспецифической ткани кишечника микрососудистые эндотелиальные клетки человека включены в нижний отсек чипа органа для воссоздания эпителиально-эндотелиального интерфейса. Эта новая платформа облегчает люминальное воздействие питательных веществ, лекарств и микроорганизмов, позволяя изучать кишечный транспорт, проницаемость и взаимодействие хозяина и микроба.
Здесь приведен подробный протокол создания чипов кишечника, представляющих двенадцатиперстную кишку человека (чип двенадцатиперстной кишки) и толстой кишки (чип толстой кишки), и их последующей культивации при непрерывном потоке и перистальтикоподобных деформациях. Показаны методы оценки метаболизма лекарственных средств и индукции CYP3A4 в чипе двенадцатиперстной кишки с использованием прототипных индукторов и субстратов. Наконец, мы предоставляем пошаговую процедуру моделирования in vitro опосредованного интерфероном гамма (IFNγ) барьерного разрушения (синдром протекающего кишечника) в чипе толстой кишки, включая методы оценки изменения параклеточной проницаемости, изменений секреции цитокинов и транскриптомного профилирования клеток внутри чипа.

На рисунке 1D обобщена временная шкала культуры кишечного чипа и проиллюстрирована кишечные эндотелиальные клетки и органоиды до и после посева на чип. Кроме того, он демонстрирует отчетливые морфологические различия между чипами двенадцатиперстной кишки и толстой ки?...

Watch this Scientific Journal Video about Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality at JoVE.com

Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

Полученные из биопсии кишечные органоиды и технологии «орган на чипах» объединены в микрофизиологическую платформу для рекапитуляции специфической для региона функциональности кишечника.

Объединение человеческих органоидов и технологии «орган на чипе» для моделирования функциональности, специфичной для области кишечника

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

Этот протокол показывает, как использовать кишечные органоиды, полученные из биопсии, и технологию «орган на чипе» для создания физиологически значимого чипа кишечника, который затем может быть использован для прогнозирования фармакокинетики и лекарственного взаимодействия, а также для изучения дисфункции кишечного эпителиального барьера. Объединение органоидов в технологии «орган на чипе» позволяет воспроизвести сложность кишечного эпителия. Кроме того, это позволяет лучше экспериментально контролировать механические сигналы, распределение потока и биохимические градиенты.Этот метод имитирует сложную физиологию кишечника человека, давая более глубокое понимание клеточной и молекулярной основы нормальных и патологических функций кишечника. Это помогает лучше прогнозировать фармакокинетику и фармакодинамику, а также потенциальные кандидаты на лекарства для предотвращения воспалительных повреждений. Посев является критическим шагом в протоколе.Чрезмерная фрагментация или неточная плотность посева кишечных органоидных фрагментов могут поставить под угрозу развитие и дифференцировку эпителиального барьера. Для начала аспирируйте среду из статической органоидной культуры. Извлекайте среду из достаточного количества скважин для достижения конечной плотности посева в восемь миллионов клеток на миллилитр.Добавьте 500 микролитров ледяного раствора диссоциации BMM в каждую скважину и прикрепите солюбилизированный BMM к поверхности скважины. Соберите суспензию в 15-миллилитровую трубку с низким содержанием белка и поместите ее на лед. Осторожно встряхивайте тюбик каждые 15 минут в течение одного часа.Центрифуга в 300 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия для получения органоидной гранулы. Если над гранулой наблюдается прозрачный слой геля, раствор аспирата из тюбика. Повторно суспендировать гранулу и добавить равный объем диссоциационного раствора БММ.Инкубировать на льду в течение 10 минут и центрифугировать. Повторять до тех пор, пока не появятся солюбилизированные остатки BMM. Затем выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах раствора органоидного пищеварения.Инкубируйте трубку при температуре 37 градусов Цельсия в течение одной-трех минут и добавьте восемь миллилитров усовершенствованного DMEM F12, чтобы остановить ферментативную реакцию. Центрифугируйте и повторно суспендируйте гранулу в полной органоидной среде роста, чтобы достичь восьми миллионов клеток на миллилитр. Aliquot 360 микролитров в стерильных 1,5 миллилитрах низкобелковых связывающих трубках.Далее снимите среду с верхнего канала покрытых стружкой и добавьте 30 микролитров клеточной суспензии. Инкубируйте чипы при температуре 37 градусов цельсия в течение ночи, чтобы приклеить фрагменты органоидов к мембране. Добавьте три миллилитра предварительно уравновешенной полной органоидной питательной среды к верхнему впускному резервуару и три миллилитра предварительно уравновешенной среды роста эндотелиальных клеток в нижний входной резервуар.Добавьте 300 микролитров той же среды в соответствующие верхние и нижние выпускные резервуары. Перенесите лоток с переносными модулями в модуль культуры. На модуле культуры многократно запускайте основной цикл до тех пор, пока не образуется достаточное количество капель для успешного соединения чипов.Затем вставьте держатель чипа в портативный модуль. Затем запустите двухчасовой цикл регулирования для создания давления на питательные среды в портативном модуле и чипе, после чего запрограммированные условия возобновятся. Затем измените параметры растяжения и запустите модуль языка и региональных параметров.Через 24 часа повторите цикл с 10% растяжением и той же частотой. Для приготовления дозирующей среды или контроля транспортного средства разбавляют растворы индуктора CYP или ДМСО в полной органоидной среде роста и среде роста эндотелиальных клеток. Приостановите модуль культуры и поднесите лотки в шкаф биобезопасности.Замените среду во всех входных и выходных резервуарах двумя миллилитрами дозирующих сред с индукторами или управлением транспортным средством. Верните портативные модули обратно в модуль культуры и перезапустите поток со скоростью 30 микролитров в час. Заменяйте среду свежеприготовленным индуцирующим раствором каждые 24 часа и продолжайте культивирование в течение 48-72 часов.Затем поднесите лотки в шкаф биобезопасности и аспирируйте дозирующую среду из всех резервуаров. Промыть и заменить верхний входной резервуар теплой усовершенствованной средой DMEM F12, а нижний резервуар средой для роста эндотелиальных клеток. Замените промывочную среду одним миллилитром раствора подложки зонда.Перфьминируйте стружку с высокой скоростью потока 1000 микролитров в час в течение пяти минут и аспирируйте как верхние, так и нижние выпускные резервуары. Верните чипсы в модуль культивирования и инкубируйте в течение одного часа при постоянном потоке 300 микролитров в час. После одного часа обработки остановите поток и отнесите лотки в шкаф биобезопасности.Соберите 100 микролитров сточных вод из верхнего выходного резервуара и добавьте его в трубку, содержащую 200 микролитров стоп-раствора. Поместите трубки сразу на сухой лед и храните образцы при минус 80 градусах Цельсия. Промывайте оба канала 200 микролитрами стерильного DPBS.Затем заблокируйте выпускное отверстие нижнего канала с помощью наконечника пипетки фильтра 200 микролитра. Перфьюировать 50 микролитров диссоциационного раствора через нижний канал и инкубировать в течение двух минут при комнатной температуре. Обеспечить полное отсоединение эндотелиальных клеток и удалить диссоциационный раствор из канала путем пипетки.Повторите стирку. Затем заблокируйте выход верхнего канала и перфьминируйте 75 микролитров буфера лизиса белка. Оставьте наконечник пипетки вставленным и высиживайте в течение пяти минут при комнатной температуре.Соберите лизаты клеток в 1,5-миллилитровую трубку, пипетировав от пяти до 10 раз. Повторяют перфузию и сбор для получения полного отслоения клеток и хранят лизаты при минус 80 градусах Цельсия до анализа. Для лизиса РНК следуйте той же процедуре, используя 150 микролитров буфера лизиса РНК.Сначала готовят раствор для дозирования гамма-интерферона путем разбавления исходных растворов в дегазированной среде роста эндотелиальных клеток. В шкафу биобезопасности удалите среду из нижнего канала впускных резервуаров и замените ее тремя миллилитрами дозирующего раствора ежедневно. Затем поместите лотки в модуль культивирования и перфьминируйте чипсы с высокой скоростью потока 1000 микролитров в час в течение пяти минут.Переключите расход на 60 микролитров в час и продолжайте текучую культуру. Добавьте 100 микролитров DPBS на скважину в 96-луночную черностенную пластину. Используя многоканальную пипетку, добавьте 50 микролитров сточных вод из всех резервуаров в соответствующие скважины.Для подготовки стандартной кривой выполняют трехкратное разведение среды, содержащей 100 мкг на миллилитр трех килодалтон декстран каскадного синего цвета в DPBS. Затем выполняют серийный бред с помощью трехкратного разведения среды роста эндотелиальных клеток в DPBS. Отчетливые морфологические особенности чипов двенадцатиперстной кишки и толстой кишки были подчеркнуты наличием ворсинчатых образований в чипе двенадцатиперстной кишки, представляющих архитектуру тонкой кишки.В чипе двенадцатиперстной кишки, подвергшемся воздействию индукторов цитохрома P450 рифампицина и витамина D3, наблюдалась повышенная экспрессия гена мРНК для препарата, метаболизирующего фермент цитохрома P450 3A4, и повышенная каталитическая активность фермента цитохрома P450, что указывает на соответствующие индукционные реакции у всех трех доноров органоидов. При обработке эпителиального монослоя чипа толстой кишки интерфероном гамма наблюдалась нарушенная морфология клеток и потеря столбчатого эпителия. Кроме того, лечение интерфероном гамма приводило к увеличению цитоплазматического сигнала белков плотного и адгезивного соединения по сравнению с контролем транспортного средства, показывая смещение маркеров плотного соединения ZO-1 и клаудина 4 и интернализацию окклюдина и E-кадгерина.Значительное увеличение эпителиальной параклеточной проницаемости наблюдалось после 48 часов гамма-стимуляции интерфероном на чипах толстой кишки. Аналогично, интерферон гамма индуцирует активацию апоптоза, о чем свидетельствует увеличение внутриклеточного содержания расщепленной Каспазы 3. Интерферон гамма индуцировал поляризованную секрецию провоспалительных молекул в чипе толстой кишки, о чем свидетельствует базолатеральная секреция VCAM-1 и интерлейкина-6 и апикальная секреция ICAM-1 и сывороточного амилоидного белка A. Для успешной культуры чипа кишечника следует использовать недифференцированные органоиды и следовать инструкциям по фрагментации и плотности посева.После успешного создания кишечного чипа мы можем изучать кишечное всасывание, транспорт и метаболизм, уровни питательных веществ и секрецию кишечных гормонов, взаимодействие патогенов микробов хозяина, безопасность и эффективность лекарств, механизмы заболевания для конкретного пациента и реакции на терапию.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Человека хрящевой ткани Изготовление с использованием трехмерных струйных технологии печати

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Недвижимость Мониторинг Время внутриклеточного желчных кислот Dynamics Использование генетически кодируемых FRET основе желчных кислот датчик

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Развитие многоклеточного трехмерной модели Органотипической слизистой оболочки пищеварительного тракта человека Выращенный в условиях микрогравитации

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

Применение передовых в Vitro культивирования технологии для изучения человеческого кишка микробиоты

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases

Человеческие нейронные органоиды для изучения рака мозга и нейродегенеративных заболеваний

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Количественная флуоресценция на основе однолипосомы анализ для обнаружения композиционной неоднородности между отдельными липосомы

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

В vitro Модель человека кожные гипертрофические рубцы с помощью макромолекулярной crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery

Скрининг токсичности органоидов сетчатки человека для фармацевтических открытий

Organoids provide a promising platform to study disease mechanism and treatments, directly in the context of human tissue with the versatility and ...

Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall

Построение модели гладкомышечных клеток гладкой мускулатуры человека для рекапитуляции биомеханического штамма в стенке аорты

Conventional two-dimensional cell culture techniques and animal models have been used in the study of human thoracic aortic aneurysm and dissection ...

Регионарная децеллюляризованная изоляция легочной ткани для изучения межклеточного взаимодействия и взаимодействия клетки-ЭКМ

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue

В центре внимания автора: Диссекция и изоляция регионально-специфической децеллюляризованной легочной ткани  

Диссекция и выделение регионоспецифической децеллюляризированной ткани легких

Lung transplantation is often the only option for patients in the later stages of severe lung disease, but this is limited both due to the supply of ...