Name: combining human organoids and organ-on-a-chip technology to model intestinal region-specific functionality
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality at JoVE.com

Agradecemos al profesor Mark Donowitz por proporcionar los organoides derivados de la biopsia intestinal y a Brett Clair por diseñar las ilustraciones científicas del chip, el módulo portátil y de cultivo. Todo el resto de las ilustraciones científicas se generaron utilizando el BioRender.

NOTA: Todos los cultivos celulares deben manejarse utilizando una técnica aséptica adecuada.
Los organoides intestinales humanos empleados en este estudio se obtuvieron de la Universidad Johns Hopkins y todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas y regulaciones aprobadas. Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Johns Hopkins (IRB #NA 00038329).
1. Preparación de los r...

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	<li>Fritz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+clinically+relevant+drug-metabolizing+enzymes+along+the+human+intestine+and+their+correlation+to+drug+transporters+and+nuclear+receptors:+An+intra-subject+analysis.">Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).</li><li>Okumura, R., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+intestinal+homeostasis+by+mucosal+barriers.">Maintenance of intestinal homeostasis by mucosal barriers.</a> Inflammation and Regeneration. 38 (1), 1-8 (2018).</li><li>Delgado, M. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+cell+lines+form+polarized+epithelia+with+an+adherent+mucus+layer+when+cultured+in+semi-wet+interfaces+with+mechanical+stimulation.">Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation.</a> PLoS One. 8 (7), 68761 (2013).</li><li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+human+Small+Intestine-on-a-Chip+using+biopsy-derived+organoids.">Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duodenum+intestine-chip+for+preclinical+drug+assessment+in+a+human+relevant+model.">Duodenum intestine-chip for preclinical drug assessment in a human relevant model.</a> eLife. 9, 50135 (2020).</li><li>Apostolou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microphysiological+colon+platform+to+decipher+mechanisms+driving+human+intestinal+permeability.">A novel microphysiological colon platform to decipher mechanisms driving human intestinal permeability.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (5), 1719-1741 (2021).</li><li>Jalili-Firoozinezhad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Author+correction:+A+complex+human+gut+microbiome+cultured+in+an+anaerobic+intestine-on-a-chip.">Author correction: A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 583 (2019).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+enhances+differentiation+of+jejunal+human+enteroids+in+Intestine-Chip.">Fluid shear stress enhances differentiation of jejunal human enteroids in Intestine-Chip.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), 258-271 (2021).</li><li>Sontheimer-Phelps, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon-on-a-chip+enables+continuous+in+vitro+analysis+of+colon+mucus+layer+accumulation+and+physiology.">Human colon-on-a-chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).</li><li>Tovaglieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+enhancement+of+enterohemorrhagic+E.+coli+pathogenesis+mediated+by+microbiome+metabolites.">Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites.</a> Microbiome. 7 (1), 43 (2019).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+human+organs-on-chips.">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).</li><li>Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genetic+engineering+of+human+intestinal+organoids+using+electroporation.">Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).</li><li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow.">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).</li><li>Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+motility:+From+bench+side+to+bedside.">Colonic motility: From bench side to bedside.</a> Morgan &amp; Claypool Life Sciences. , (2010).</li><li>Basson, M. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+amyloid+A,+the+major+vertebrate+acute-phase+reactant.">Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant.</a> European Journal of Biochemistry. 265 (2), 501-523 (1999).</li><li>P&#233;rez-Gonz&#225;lez, C., Ceada, G., Matej&#269;i&#263;, M., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digesting+the+mechanobiology+of+the+intestinal+epithelium.">Digesting the mechanobiology of the intestinal epithelium.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 72, 82-90 (2022).</li><li>In, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterohemorrhagic+escherichia+coli+reduces+mucus+and+intermicrovillar+bridges+in+human+stem+cell-derived+colonoids.">Enterohemorrhagic escherichia coli reduces mucus and intermicrovillar bridges in human stem cell-derived colonoids.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (1), 48-62 (2016).</li><li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+organ-on-chip+reveals+intestinal+microenvironment+and+mechanical+forces+impacting+shigella+infection.">Bioengineered human organ-on-chip reveals intestinal microenvironment and mechanical forces impacting shigella infection.</a> Cell Host and Microbe. 26 (3), 435-444 (2019).</li><li>Kerns, S. 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La combinación de la tecnología de órganos en un chip y los organoides intestinales es prometedora para el modelado preciso de la fisiología intestinal humana y la fisiopatología. Aquí, proporcionamos un protocolo paso a paso simple y robusto (descrito en la Figura 1) para el establecimiento del chip intestinal que contiene epitelio intestinal delgado o colónico derivado de la biopsia y células endoteliales microvasculares intestinales cocultivadas en un dispositivo microfluídico. E...

El intestino humano es un órgano complejo y multitarea capaz de autorregenerarse. Se divide en el intestino delgado y grueso. La función principal del intestino delgado es digerir aún más los alimentos que provienen del estómago, absorber todos los nutrientes y pasar el residuo al intestino grueso, que recupera el agua y los electrolitos. El intestino delgado se divide en múltiples regiones anatómicamente distintas: el duodeno, el yeyuno y el íleon, cada uno de los cuales está adaptado para realizar funciones específicas. Por ejemplo, el duodeno ayuda a descomponer el quimo (contenido del estómago) para permitir la absorción adecuada de nutrientes que involucran proteínas, carbohidratos, vitaminas y minerales en el yeyuno. Esta parte proximal del intestino delgado es también el sitio principal de absorción y metabolismo intestinal de fármacos, y se caracteriza por la mayor expresión de enzimas metabolizadoras de fármacos (por ejemplo, CYP3A4) en comparación con su expresión en el íleon y el colon1. Además de su papel principal en la digestión y absorción de nutrientes, el intestino también es una barrera eficaz contra los contenidos luminales potencialmente dañinos, como microorganismos patógenos, metabolitos microbianos, antígenos dietéticos y toxinas 2,3. Cabe destacar que el colon humano está habitado por una gran cantidad de microorganismos, muy superiores a los del total de células en el cuerpo humano, que proporcionan muchos beneficios a la nutrición, el metabolismo y la inmunidad. Por lo tanto, el mantenimiento de la integridad de la barrera mucosa formada por las células epiteliales intestinales es fundamental para permitir la relación simbiótica entre la microbiota intestinal y las células huésped separándolas físicamente para evitar la activación innecesaria de las células inmunes2. Además, la muerte celular intestinal programada juega un papel esencial como mecanismo de autoprotección que evita que las células infectadas persistan o proliferen, diseminando así patógenos potenciales3, mientras que la autorrenovación continua del epitelio intestinal cada cuatro a siete días compensa la pérdida celular asegurando la integridad de la barrera y la homeostasis tisular. Las alteraciones de las funciones intestinales descritas, incluida la absorción de nutrientes, la integridad de la barrera o el desequilibrio en la muerte celular intestinal y la autorrenovación, pueden dar lugar al desarrollo de una variedad de trastornos gastrointestinales, incluida la desnutrición y la enfermedad inflamatoria intestinal (EII)2,3.
Anteriormente, se han utilizado modelos animales y líneas celulares intestinales transformadas derivadas del cáncer para estudiar las funciones fisiológicas y fisiopatológicas del tejido intestinal humano. Sin embargo, las preocupaciones cada vez más prominentes sobre la traducibilidad de la investigación con animales a los seres humanos, causadas por la presencia de disparidades significativas entre las dos especies, destacaron la necesidad de métodos alternativos relevantes para los humanos4. Las líneas celulares intestinales in vitro comúnmente utilizadas incluyen células T84, Caco-2 y HT29. Si bien imitan ciertos aspectos de la función de barrera intestinal y el transporte de membrana, se caracterizan por una expresión alterada de las enzimas metabolizadoras de fármacos5, receptores de superficie y transportadores4. Además, carecen de especificidad del segmento intestinal y no logran recapitular la complejidad del epitelio intestinal, ya que cada modelo contiene solo uno de los cinco tipos de células epiteliales presentes en el intestino6.
Recientemente, los cultivos de organoides intestinales humanos establecidos a partir de biopsias frescas del intestino delgado y el colon 7,8 o células madre pluripotentes inducidas (iPSC)9 se introdujeron como modelos experimentales alternativos con potencial para complementar, reducir y tal vez reemplazar la experimentación con animales en el futuro. Si bien las iPSC se pueden obtener de manera no invasiva, el establecimiento de organoides a partir de iPSC requiere el uso de protocolos complejos y largos (con varios pasos experimentales) y genera cultivos que se asemejan al tejido fetal humano. Por el contrario, los organoides derivados de biopsias son altamente escalables, ya que pueden aprovechar la capacidad de renovación inherente del tejido intestinal y pueden pasarse y propagarse indefinidamente in vitro. Es importante destacar que los organoides derivados de biopsias mantienen las características específicas de la enfermedad y la región intestinal del tejido primario a partir del cual se desarrollaron y emulan la diversidad celular del epitelio intestinal. Los organoides se pueden utilizar como avatares específicos del paciente in vitro para desentrañar la biología y la patogénesis de diversos trastornos gastrointestinales y mejorar su manejo terapéutico. Aunque los organoides intestinales han alcanzado un grado impresionante de funcionalidad fisiológica, todavía no logran reproducir la complejidad de los órganos nativos debido a su falta de componentes estromales críticos, incluidos los vasos sanguíneos, el tejido conectivo, los nervios periféricos y las células inmunes, así como la estimulación mecánica. Se sabe que los parámetros mecánicos, como el flujo, la tensión cortante, el estiramiento y la presión, influyen en la morfogénesis tisular y la homeostasis in vivo y anteriormente se demostró que mejoran la maduración de las células in vitro 10,11,12,13. Un inconveniente importante adicional de los sistemas organoides es la inaccesibilidad de la luz y, por lo tanto, del lado apical del epitelio. Esto presenta un desafío para investigar varios mecanismos asociados con la expresión polarizada de los transportadores de iones y medicamentos, las interacciones huésped-microbioma y las pruebas de toxicidad farmacéutica. Por último, los cultivos de organoides sufren de una variabilidad considerable en tamaño, morfología y función, debido a la naturaleza estocástica del proceso de autoorganización in vitro y las elecciones de destino celular. Por lo tanto, para aprovechar todo el potencial de los organoides intestinales en el modelado de enfermedades, la detección de medicamentos y la medicina regenerativa, es necesario explorar nuevas estrategias que reduzcan la variabilidad en el desarrollo de organoides, mejoren el acceso al compartimiento luminal e incorporen las interacciones célula-célula faltantes.
La tecnología Organ-on-a-Chip ha introducido muchas técnicas para la incorporación de fuerzas mecánicas y flujo de fluidos a cultivos celulares intestinales in vitro. Sin embargo, dado que la mayoría de los estudios iniciales de prueba de concepto han utilizado líneas celulares derivadas del cáncer que no exhibieron suficiente diversidad celular, la relevancia de estos sistemas ha sido cuestionada. Recientemente, hemos combinado sinérgicamente organoides intestinales y tecnología organ-on-a-chip para incorporar las mejores características de cada enfoque en un sistema in vitro 14,15,16. El chip intestinal resultante recapitula la arquitectura multicelular del epitelio intestinal, la presencia de la interfaz del tejido epitelial-endotelial y las fuerzas mecánicas del flujo y estiramiento del fluido, lo que permite la emulación de las funciones a nivel de órganos in vitro. Además, el uso de organoides derivados de tejidos primarios (que se pueden muestrear de diferentes regiones del intestino humano) como material de partida aumenta la versatilidad de este modelo, ya que se pueden establecer chips que representan duodeno humano, yeyuno, íleon y colon siguiendo procedimientos similares de siembra y cultivo. Es importante destacar que los Chips Intestinales permiten la evaluación en tiempo real de: la integridad de la barrera intestinal; actividad del borde del cepillo y las enzimas del metabolismo de los medicamentos; producción de mucinas; secreción de citoquinas; e interacción de las células intestinales con microorganismos patógenos y comensales, como se demuestra en los informes publicados anteriormente. En particular, cuando se establecieron chips intestinales utilizando organoides generados a partir de tejido de diferentes individuos, estos modelos capturaron la variabilidad esperada entre donantes en las respuestas funcionales a diversos medicamentos y tratamientos. En conjunto, la fusión de organoides con la tecnología Organ-on-a-Chip abre la puerta a modelos más avanzados, personalizados e in vivo relevantes que podrían mejorar la relevancia fisiológica y la precisión de los hallazgos in vitro, así como su extrapolación a los humanos. Aquí, se presenta un protocolo detallado para establecer el chip intestinal y su aplicación en los estudios de funciones fisiológicas de los dos segmentos intestinales: duodeno y colon. En primer lugar, se describen los métodos para evaluar la actividad de la enzima metabolizadora de fármacos CYP3A4 en el chip duodeno, así como su inducción por compuestos prototípicos como la rifampicina y la vitamina D3. En segundo lugar, los pasos necesarios para modelar el "intestino permeable" en el chip de colon se describen en el protocolo, con la interrupción de la barrera epitelial que se realiza utilizando citoquinas distintivas implicadas en la patogénesis de la EII. Brevemente, los organoides derivados de biopsias humanas se propagan in vitro, se someten a digestión enzimática y se introducen en el canal superior del chip. En presencia de perfusión continua con medios enriquecidos con factor de crecimiento, se convierten en una monocapa epitelial confluente con arquitectura 3D y una superficie celular apical de fácil acceso. El compartimento inferior del chip "vascular" está sembrado con células endoteliales microvasculares aisladas del intestino delgado o grueso. El epitelio y el endotelio están separados por una membrana estirable porosa, que facilita las interacciones paracrinas entre los dos tejidos y, cuando se somete a deformaciones cíclicas, emula los movimientos similares a la peristalsis del intestino humano. El cocultivo se mantiene bajo las condiciones de flujo dinámico generado por la perfusión luminal y vascular con medios de cultivo celular apropiados. Finalmente, describimos numerosos tipos de ensayos y análisis de punto final que se pueden realizar directamente en chip o a partir de efluentes de cultivo celular muestreados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>AlphaBioRegen</td>
			<td>ALHE15</td>
			<td>0.5 cells M/ml ; cryopreserved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>AlphaBioRegen</td>
			<td>ALHE16</td>
			<td>0.5 cells M/ml ; cryopreserved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy-derived Human Duodenal Organoids</td>
			<td>John Hopkin&#39;s University</td>
			<td>-</td>
			<td>The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy-derived Human Colonic Organoids</td>
			<td>John Hopkin&#39;s University</td>
			<td>-</td>
			<td>The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zo&#235; CM-1&#8482;&#160;Culture Module</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Culture module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orb-HM1&#8482;&#160;Hub Module</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>5% CO2, vacuum stretch, and power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1&#8482; Stretchable Chip</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pod&#8482; Portable Modules</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Portable module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Light Box</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip Cradle</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>1 per square culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip&#174;-HV Filters</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SE1M003M00</td>
			<td>0.45&#160;&#956;m&#160;PVDF filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82051-068</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld&#160;vacuum&#160;aspirator</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4930</td>
			<td>&#160;-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating&#160;pipettes</td>
			<td>Corning / Falcon</td>
			<td>357558</td>
			<td>2 mL,&#160;polystyrene, individually&#160;wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating tips</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
			<td>Sterile (autoclaved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological&#160;pipettes</td>
			<td></td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>2 mL, 5 mL,&#160;10 mL,&#160;and&#160;25 mL&#160;low endotoxin, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>P20, P200,&#160;P1000&#160;and standard multichannel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette&#160;tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>P20, P200,&#160;and&#160;P1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes&#160;(Protein&#160;LoBind&#174; Tubes)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030122216;&#160;0030122240</td>
			<td>15 mL, 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Tubes&#174;&#160;lo-bind</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431081</td>
			<td>1.5 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells black walled plate</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for epithelial permeability analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (with camera)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For bright-field&#160;imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (or beads)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Set to 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum set-up</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>-</td>
			<td>Minimum&#160;pressure: -70 kPa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>220033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td>Cell culture flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent-1&#160;(ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Chip coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent-2&#160;(ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Chip coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS&#160;(DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25055CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93595</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TryplE&#160;Express</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Organoids&#160;dissociation&#160;and endothelium cells&#160;detachment&#160;solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult&#8482; Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>Organoid Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22121</td>
			<td>Endothelial medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin&#8482;&#160;</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ANT-PM-1</td>
			<td>antimicrobial agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment Factor&#8482;</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>4Z0-210</td>
			<td>coating solution for flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - Growth Factor Reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Solubilized basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>ECM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>ECM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td>organoid media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-10</td>
			<td>organoid media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>Basement mebrane matrix dissociationsolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9576</td>
			<td>30%, Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25055CV</td>
			<td>Sterile, Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3KDa Dextran Cascade Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D7132</td>
			<td>10 mg powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin (RIF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# R3501</td>
			<td>CYP inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testosterone hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1500</td>
			<td>CYP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# D1530</td>
			<td>CYP inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>159002</td>
			<td>LCMS stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>157-4</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>566460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Occludin</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Claudin 4</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>36-4800</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-E-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1416</td>
			<td>epithelial adherens junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VE-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33168</td>
			<td>endothelial adherent junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>339194</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12183020</td>
			<td>RNA lysis, isolation and purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript&#8482; IV VILO&#8482; Master Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11756050</td>
			<td>reverse transcriptase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan&#8482; Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444557</td>
			<td>qPCR reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio&#8482; 5 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A28573</td>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs99999901_s1</td>
			<td>Eukaryotic 18S rRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP3A4 primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs00604506_m1</td>
			<td>Cytochrome&#160; family 3 subfamily A member 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23236</td>
			<td>Protein quantification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Tris lysis buffer</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R60TX-3</td>
			<td>Protein lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved/Total Caspase-3 Whole Cell Lysate Kit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15140D</td>
			<td>Caspase 3 detection kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15198D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex)</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15053D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>20X long-distance objective lenses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AXIOvert.A1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Brightfield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>10X objective lenses</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining human organoids and organ-on-a-chip technology to model intestinal region-specific functionality

La mucosa intestinal es una barrera física y bioquímica compleja que cumple una miríada de funciones importantes. Permite el transporte, la absorción y el metabolismo de nutrientes y xenobióticos, al tiempo que facilita una relación simbiótica con la microbiota y restringe la invasión de microorganismos. La interacción funcional entre varios tipos de células y su entorno físico y bioquímico es vital para establecer y mantener la homeostasis del tejido intestinal. Modelar estas interacciones complejas y la fisiología intestinal integrada in vitro es un objetivo formidable con el potencial de transformar la forma en que se descubren y desarrollan nuevas dianas terapéuticas y candidatos a fármacos.
Los organoides y las tecnologías Organ-on-a-Chip se han combinado recientemente para generar chips intestinales relevantes para el ser humano adecuados para estudiar los aspectos funcionales de la fisiología intestinal y la fisiopatología in vitro. Los organoides derivados de las biopsias del intestino delgado (duodeno) y grueso se siembran en el compartimento superior de un chip de órgano y luego se expanden con éxito como monocapas mientras preservan las características celulares, moleculares y funcionales distintivas de cada región intestinal. Las células endoteliales microvasculares específicas del tejido del intestino humano se incorporan en el compartimento inferior del chip del órgano para recrear la interfaz epitelial-endotelial. Esta novedosa plataforma facilita la exposición luminal a nutrientes, fármacos y microorganismos, lo que permite estudios de transporte intestinal, permeabilidad e interacciones huésped-microbio.
Aquí, se proporciona un protocolo detallado para el establecimiento de chips intestinales que representan el duodeno humano (chip de duodeno) y el colon (chip de colon), y su posterior cultivo bajo flujo continuo y deformaciones similares a la peristalsis. Demostramos métodos para evaluar el metabolismo de fármacos y la inducción de CYP3A4 en chip duodeno utilizando inductores y sustratos prototípicos. Por último, proporcionamos un procedimiento paso a paso para el modelado in vitro de la interrupción de la barrera mediada por interferón gamma (IFNγ) (síndrome del intestino permeable) en un chip de colon, incluidos los métodos para evaluar la alteración de la permeabilidad paracelular, los cambios en la secreción de citoquinas y el perfil transcriptómico de las células dentro del chip.

La Figura 1D resume la línea de tiempo del cultivo de chips intestinales e ilustra las células endoteliales intestinales y los organoides antes y después de la siembra en el chip. Además, demuestra las diferencias morfológicas distintivas entre las virutas de duodeno y colon, destacadas por la presencia de formaciones similares a vellosidades en la vilipruta de duodeno y representativas de la arquitectura del intestino delgado.
La Figura ...

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Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

Los organoides intestinales derivados de biopsias y las tecnologías de organ-on-a-chips se combinan en una plataforma microfisiológica para recapitular la funcionalidad intestinal específica de la región.

Combinación de organoides humanos y tecnología organ-on-a-chip para modelar la funcionalidad específica de la región intestinal

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

Este protocolo muestra cómo utilizar organoides intestinales derivados de biopsia y tecnología de órgano en un chip para generar un chip intestinal fisiológicamente relevante que luego se puede utilizar para predecir la farmacocinética y la interacción fármaco-fármaco y para estudiar la disfunción de la barrera epitelial intestinal. La unión de organoides en la tecnología de órgano en un chip nos permite reproducir la complejidad del epitelio intestinal. Además, permite un mayor control experimental de las señales mecánicas, la distribución del flujo y los gradientes bioquímicos.Este método emula la compleja fisiología del intestino humano, dando una mayor comprensión de las bases celulares y moleculares de las funciones intestinales normales y patológicas. Esto ayuda a predecir mejor la farmacocinética y la farmacodinámica y los posibles candidatos a fármacos para prevenir el daño inflamatorio. La siembra es un paso crítico en el protocolo.La fragmentación excesiva o la densidad de siembra inexacta de los fragmentos organoides intestinales pueden comprometer el desarrollo y la diferenciación de la barrera epitelial. Para comenzar, aspire el medio del cultivo de organoides estáticos. Recupere los medios de suficientes pozos para lograr una densidad de siembra final de ocho millones de células por mililitro.Agregue 500 microlitros de solución de disociación de BMM helada a cada pocillo y conecte el BMM solubilizado de la superficie del pozo. Recoja la suspensión en un tubo de unión a proteínas bajas en 15 mililitros y colóquela en hielo. Agite suavemente el tubo cada 15 minutos durante una hora.Centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para obtener un pellet de organoide. Si se observa una capa de gel transparente sobre el pellet, aspire la solución del tubo. Vuelva a suspender el pellet y agregue un volumen igual de solución de disociación BMM.Incubar en hielo durante 10 minutos y centrifugar. Repita hasta que no haya residuos de BMM solubilizados. Luego deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de solución de digestión organoide.Incubar el tubo a 37 grados centígrados durante uno a tres minutos y añadir ocho mililitros de DMEM F12 avanzado para detener la reacción enzimática. Centrifugar y resuspender el pellet en medio de crecimiento organoide completo para lograr ocho millones de células por mililitro. Alícuota 360 microlitros en tubos estériles de 1,5 mililitros de baja unión proteica.A continuación, retire el medio del canal superior de los chips recubiertos y agregue 30 microlitros de la suspensión celular. Incubar los chips a 37 grados centígrados durante la noche para adherir los fragmentos de organoides a la membrana. Agregue tres mililitros de medio de crecimiento organoide completo preequilibrado al depósito de entrada superior y tres mililitros de medio de crecimiento de células endoteliales preequilibradas en el depósito de entrada inferior.Agregue 300 microlitros del mismo medio en los respectivos depósitos de salida superior e inferior. Transfiera la bandeja que lleva los módulos portátiles al módulo de cultivo. En el módulo de cultivo, ejecute repetidamente el ciclo primario hasta que se formen gotas suficientes para conectar correctamente los chips.A continuación, deslice el portador de chip en el módulo portátil. Luego comience el ciclo de regulación de dos horas de duración para presurizar los medios de cultivo en el módulo portátil y el chip, después de lo cual se reanudarán las condiciones programadas. A continuación, cambie la configuración de ampliación e inicie el módulo de cultivo.Después de 24 horas, repita el ciclo con 10% de estiramiento y la misma frecuencia. Para preparar los medios de dosificación o el control del vehículo, diluir las soluciones madre inductoras del CYP o DMSO en un medio de crecimiento organoide completo y un medio de crecimiento de células endoteliales. Pausa el módulo de cultivo y lleva las bandejas al gabinete de bioseguridad.Reemplace el medio en todos los depósitos de entrada y salida con dos mililitros de medios dosificadores con inductores o control del vehículo. Devuelva los módulos portátiles al módulo de cultivo y reinicie el flujo a 30 microlitros por hora. Reemplace el medio con una solución inductora recién preparada cada 24 horas y continúe el cultivo durante 48 a 72 horas.Luego lleve las bandejas al gabinete de bioseguridad y aspire el medio dosificador de todos los depósitos. Lave y reemplace el depósito de entrada superior con un medio DMEM F12 avanzado y el depósito inferior con un medio de crecimiento de células endoteliales. Reemplace el medio de lavado con un mililitro de solución de sustrato de sonda.Perfundir las virutas a un alto caudal de 1.000 microlitros por hora durante cinco minutos y aspirar los depósitos de salida superior e inferior. Devuelva los chips al módulo de cultivo e incube durante una hora bajo un flujo constante de 300 microlitros por hora. Después de una hora de tratamiento, detenga el flujo y lleve las bandejas al gabinete de bioseguridad.Recoja 100 microlitros de efluente del depósito de salida superior y agréguelo a un tubo que contenga 200 microlitros de solución de parada. Coloque los tubos inmediatamente sobre hielo seco y almacene las muestras a menos 80 grados centígrados. Lave ambos canales con 200 microlitros de DPBS estéril.A continuación, bloquee la salida del canal inferior con una punta de pipeta de filtro de 200 microlitros. Perfundir 50 microlitros de la solución de disociación a través del canal inferior e incubar durante dos minutos a temperatura ambiente. Asegurar el desprendimiento completo de las células endoteliales y eliminar la solución de disociación del canal mediante pipeteo.Repita el lavado. A continuación, bloquee la salida del canal superior y perfunda 75 microlitros de tampón de lisis de proteínas. Deje la punta de la pipeta insertada e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.Recoja los lisados celulares en un tubo de 1,5 mililitros pipeteando de cinco a 10 veces. Repita la perfusión y la recolección para obtener el desprendimiento completo de las células y almacene los lisados a menos 80 grados centígrados hasta el análisis. Para la lisis de ARN, siga el mismo procedimiento mientras usa 150 microlitros de tampón de lisis de ARN.Primero, prepare una solución dosificadora de interferón gamma diluyendo las soluciones madre en un medio de crecimiento de células endoteliales desgasificadas. En el gabinete de bioseguridad, retire el medio de los depósitos de entrada del canal inferior y reemplácelo con tres mililitros de la solución dosificadora diariamente. Luego coloque las bandejas en el módulo de cultivo y perfunda las virutas a un alto caudal de 1, 000 microlitros por hora durante cinco minutos.Cambie el caudal a 60 microlitros por hora y continúe el cultivo fluídico. Agregue 100 microlitros de DPBS por pocillo en una placa de pared negra de 96 pocillos. Usando una pipeta multicanal, agregue 50 microlitros del efluente de todos los reservorios a los pozos respectivos.Para preparar una curva estándar, realice una dilución triple del medio que contiene 100 microgramos por mililitro de tres kilodalton dextrano en cascada azul en DPBS. Luego realice delirios seriados utilizando una dilución triple del medio de crecimiento de células endoteliales en DPBS. Las características morfológicas distintivas del duodeno y los chips de colon se destacaron por la presencia de las formaciones similares a vellosidades en el chip del duodeno que representan la arquitectura del intestino delgado.En el chip duodeno expuesto a los inductores del citocromo P450 rifampicina y vitamina D3, hubo una expresión génica de ARNm elevada para la enzima metabolizadora del fármaco citocromo P450 3A4 y una mayor actividad catalítica de la enzima citocromo P450, lo que indica respuestas de inducción apropiadas en los tres donantes de organoides. Al tratar la monocapa epitelial del chip de colon con interferón gamma, se observó una morfología celular comprometida y pérdida del epitelio columnar. Además, el tratamiento con interferón gamma condujo a un aumento de la señal citoplasmática de las proteínas de unión estrecha y adherente en comparación con el control del vehículo, mostrando el desplazamiento de los marcadores de unión estrecha ZO-1 y claudina 4 y la internalización de la ocludina y la E-cadherina.Se observó un aumento significativo en la permeabilidad paracelular epitelial después de 48 horas de estimulación con interferón gamma en chips de colon. Del mismo modo, el interferón gamma induce la activación de la apoptosis indicada por el aumento en el contenido intracelular de la Caspasa 3 escindida. El interferón gamma indujo una secreción polarizada de moléculas proinflamatorias en el chip del colon, como lo demuestra la secreción basolateral de VCAM-1 e interleucina-6 y la secreción apical de ICAM-1 y la proteína amiloide sérica A.Después del establecimiento exitoso del chip intestinal, podemos estudiar la absorción, el transporte y el metabolismo intestinal, los niveles de nutrientes y la secreción de hormonas intestinales, las interacciones de patógenos microbianos del huésped, la seguridad y eficacia de los medicamentos, los mecanismos de enfermedad específicos del paciente y las respuestas a las terapias.

Research

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Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

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Monitoreo en tiempo real de intracelular del ácido biliar Dinámica El uso de un sensor de ácido biliar basada FRET-codificados genéticamente

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