Name: combining human organoids and organ-on-a-chip technology to model intestinal region-specific functionality
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality at JoVE.com

Bağırsak biyopsisinden türetilmiş organoidleri sağladığı için Profesör Mark Donowitz'e ve çip, taşınabilir ve kültür modülünün bilimsel illüstrasyonlarını tasarladığı için Brett Clair'e teşekkür ederiz. Geri kalan tüm bilimsel illüstrasyonlar BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.

NOT: Tüm hücre kültürleri uygun bir aseptik teknik kullanılarak ele alınmalıdır.
Bu çalışmada kullanılan insan bağırsak organoidleri Johns Hopkins Üniversitesi'nden elde edilmiş ve tüm yöntemler onaylanmış kılavuz ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm deneysel protokoller Johns Hopkins Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB #NA 00038329) tarafından onaylanmıştır.
1. Hücre kültürü reaktiflerinin hazırl...

<ol>
	<li>Fritz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+clinically+relevant+drug-metabolizing+enzymes+along+the+human+intestine+and+their+correlation+to+drug+transporters+and+nuclear+receptors:+An+intra-subject+analysis.">Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).</li><li>Okumura, R., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+intestinal+homeostasis+by+mucosal+barriers.">Maintenance of intestinal homeostasis by mucosal barriers.</a> Inflammation and Regeneration. 38 (1), 1-8 (2018).</li><li>Delgado, M. E., Grabinger, T., Brunner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+at+the+intestinal+epithelial+front+line.">Cell death at the intestinal epithelial front line.</a> FEBS Journal. 283 (14), 2701-2719 (2016).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+Differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology.</a> The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caco-2+cell+monolayer:+Usefulness+and+limitations.">The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+human+mini-intestines+to+the+study+of+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">The contributions of human mini-intestines to the study of intestinal physiology and pathophysiology.</a> Annual Review of Physiology. 79, 291-312 (2017).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett&#8217;s+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett&#8217;s epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).</li><li>Durel, J. F., Nerurkar, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+vertebrate+gut+morphogenesis.">Mechanobiology of vertebrate gut morphogenesis.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 63, 45-52 (2020).</li><li>Gayer, C. P., Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+mechanical+forces+on+intestinal+physiology+and+pathology.">The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology.</a> Cellular Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+activates+Piezo1+to+promote+mucin2+expression+in+goblet+cells.">Mechanical stimulation activates Piezo1 to promote mucin2 expression in goblet cells.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology (Australia). 36 (11), 3127-3139 (2021).</li><li>Navabi, N., McGuckin, M. A., Lind&#233;n, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+cell+lines+form+polarized+epithelia+with+an+adherent+mucus+layer+when+cultured+in+semi-wet+interfaces+with+mechanical+stimulation.">Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation.</a> PLoS One. 8 (7), 68761 (2013).</li><li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+human+Small+Intestine-on-a-Chip+using+biopsy-derived+organoids.">Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duodenum+intestine-chip+for+preclinical+drug+assessment+in+a+human+relevant+model.">Duodenum intestine-chip for preclinical drug assessment in a human relevant model.</a> eLife. 9, 50135 (2020).</li><li>Apostolou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microphysiological+colon+platform+to+decipher+mechanisms+driving+human+intestinal+permeability.">A novel microphysiological colon platform to decipher mechanisms driving human intestinal permeability.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (5), 1719-1741 (2021).</li><li>Jalili-Firoozinezhad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Author+correction:+A+complex+human+gut+microbiome+cultured+in+an+anaerobic+intestine-on-a-chip.">Author correction: A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 583 (2019).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+enhances+differentiation+of+jejunal+human+enteroids+in+Intestine-Chip.">Fluid shear stress enhances differentiation of jejunal human enteroids in Intestine-Chip.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), 258-271 (2021).</li><li>Sontheimer-Phelps, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon-on-a-chip+enables+continuous+in+vitro+analysis+of+colon+mucus+layer+accumulation+and+physiology.">Human colon-on-a-chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).</li><li>Tovaglieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+enhancement+of+enterohemorrhagic+E.+coli+pathogenesis+mediated+by+microbiome+metabolites.">Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites.</a> Microbiome. 7 (1), 43 (2019).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+human+organs-on-chips.">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).</li><li>Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genetic+engineering+of+human+intestinal+organoids+using+electroporation.">Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).</li><li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow.">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).</li><li>Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+motility:+From+bench+side+to+bedside.">Colonic motility: From bench side to bedside.</a> Morgan &amp; Claypool Life Sciences. , (2010).</li><li>Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradigms+for+mechanical+signal+transduction+in+the+intestinal+epithelium+-+category:+Molecular,+cell,+and+developmental+biology.">Paradigms for mechanical signal transduction in the intestinal epithelium - category: Molecular, cell, and developmental biology.</a> Digestion. 68 (4), 217-225 (2003).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression.">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> The American Journal of Pathology. 166 (2), 409-419 (2005).</li><li>Nava, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-&#947;+regulates+intestinal+epithelial+homeostasis+through+converging+&#946;-Catenin+signaling+pathways.">Interferon-&#947; regulates intestinal epithelial homeostasis through converging &#946;-Catenin signaling pathways.</a> Immunity. 32 (3), 392-402 (2010).</li><li>Madara, J. L., Stafford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-&#947;+directly+affects+barrier+function+of+cultured+intestinal+epithelial+monolayers.">Interferon-&#947; directly affects barrier function of cultured intestinal epithelial monolayers.</a> Journal of Clinical Investigation. 83 (2), 724-727 (1989).</li><li>Bruewer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+cytokines+disrupt+epithelial+barrier+function+by+apoptosis-independent+mechanisms.">Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms.</a> The Journal of Immunology. 171 (11), 6164-6172 (2003).</li><li>Jones, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+in+inflammatory+bowel+disease.">Adhesion molecules in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 36 (5), 724-730 (1995).</li><li>Uhlar, C. M., Whitehead, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+amyloid+A,+the+major+vertebrate+acute-phase+reactant.">Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant.</a> European Journal of Biochemistry. 265 (2), 501-523 (1999).</li><li>P&#233;rez-Gonz&#225;lez, C., Ceada, G., Matej&#269;i&#263;, M., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digesting+the+mechanobiology+of+the+intestinal+epithelium.">Digesting the mechanobiology of the intestinal epithelium.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 72, 82-90 (2022).</li><li>In, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterohemorrhagic+escherichia+coli+reduces+mucus+and+intermicrovillar+bridges+in+human+stem+cell-derived+colonoids.">Enterohemorrhagic escherichia coli reduces mucus and intermicrovillar bridges in human stem cell-derived colonoids.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (1), 48-62 (2016).</li><li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+organ-on-chip+reveals+intestinal+microenvironment+and+mechanical+forces+impacting+shigella+infection.">Bioengineered human organ-on-chip reveals intestinal microenvironment and mechanical forces impacting shigella infection.</a> Cell Host and Microbe. 26 (3), 435-444 (2019).</li><li>Kerns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunocompetent+organ-on-chip+platforms+allow+safety+profiling+of+tumor-targeted+t-cell+bispecific+antibodies.">Human immunocompetent organ-on-chip platforms allow safety profiling of tumor-targeted t-cell bispecific antibodies.</a> eLife. 10, 67106 (2021).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+engineering+human+pathophysiology+with+organs-on-chips.">Reverse engineering human pathophysiology with organs-on-chips.</a> Cell. 164 (6), 1105-1109 (2016).</li></ol>

Çip üzerinde organ teknolojisi ve bağırsak organoidlerinin kombinasyonu, insan bağırsak fizyolojisinin ve patofizyolojisinin doğru modellenmesi için umut vaat etmektedir. Burada, biyopsiden türetilmiş ince bağırsak veya kolonik epitel ve mikroakışkan bir cihazda birlikte kültürlenmiş bağırsak mikrovasküler endotel hücrelerini içeren bağırsak çipinin kurulması için basit ve sağlam bir adım adım protokol ( Şekil 1'de özetlenmiştir) sunuyoruz. İnsan bağırsağ...

İnsan bağırsağı, kendini yenileyebilen karmaşık ve çok görevli bir organdır. İnce ve kalın bağırsağa ayrılır. İnce bağırsağın birincil işlevi, mideden gelen yiyecekleri daha fazla sindirmek, tüm besinleri emmek ve kalıntıyı suyu ve elektrolitleri geri kazandıran kalın bağırsağa geçirmektir. İnce bağırsak ayrıca anatomik olarak farklı bölgelere ayrılır: duodenum, jejunum ve ileum, her biri belirli işlevleri yerine getirmek için uyarlanmıştır. Örneğin, duodenum, jejunumdaki proteinleri, karbonhidratları, vitaminleri ve mineralleri içeren besinlerin uygun şekilde emilimini sağlamak için kekiğin (mide içeriği) parçalanmasına yardımcı olur. İnce bağırsağın bu proksimal kısmı aynı zamanda bağırsak ilaç emilimi ve metabolizmasının ana bölgesidir ve ilam ve kolon1'deki ekspresyonlarına kıyasla ilaç metabolize edici enzimlerin (örneğin, CYP3A4) daha yüksek ekspresyonu ile karakterizedir. Besinlerin sindirilmesi ve emilmesindeki ana rolüne ek olarak, bağırsak ayrıca patojenik mikroorganizmalar, mikrobiyal metabolitler, diyet antijenleri ve toksinler gibi potansiyel olarak zararlı luminal içeriklere karşı etkili bir bariyerdir 2,3. İnsan kolonunun, insan vücudundaki toplam hücrelerinkinden çok daha fazla, beslenme, metabolizma ve bağışıklığa birçok fayda sağlayan çok sayıda mikroorganizma tarafından yaşadığı dikkat çekicidir. Bu nedenle, bağırsak epitel hücreleri tarafından oluşturulan mukozal bariyerin bütünlüğünün korunması, bağırsak mikrobiyotası ile konakçı hücreler arasındaki simbiyotik ilişkinin, gereksiz immün hücre aktivasyonunu önlemek için fiziksel olarak ayrılarak izin vermesi açısından kritik öneme sahiptir2. Ek olarak, programlanmış bağırsak hücresi ölümü, enfekte hücrelerin devam etmesini veya çoğalmasını önleyen kendi kendini koruyucu bir mekanizma olarak önemli bir rol oynar - böylece potansiyel patojenleri yayar3 - bağırsak epitelinin her dört ila yedi günde bir sürekli kendini yenilemesi, bariyer bütünlüğünü ve doku homeostazını sağlayan hücre kaybını telafi eder. Besin emilimi, bariyer bütünlüğü veya bağırsak hücresi ölümü ve kendini yenilemedeki dengesizlik dahil olmak üzere tanımlanmış bağırsak fonksiyonlarının bozulması, yetersiz beslenme ve enflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) dahil olmak üzere bir dizi gastrointestinal bozukluğun gelişmesine neden olabilir2,3.
Daha önce, insan bağırsak dokusunun fizyolojik ve patofizyolojik işlevlerini incelemek için hayvan modelleri ve dönüştürülmüş kanser kaynaklı bağırsak hücre hatları kullanılmıştır. Bununla birlikte, iki tür arasındaki önemli eşitsizliklerin varlığından kaynaklanan hayvan araştırmalarının insanlara çevrilebilirliği konusunda giderek daha belirgin hale gelen endişeler, insanla ilgili alternatif yöntemlere duyulan ihtiyacı vurgulamıştır4. Yaygın olarak kullanılan in vitro bağırsak hücre hatları T84, Caco-2 ve HT29 hücrelerini içerir. Bağırsak bariyer fonksiyonunun ve membran transportunun belirli yönlerini taklit ederken, ilaç metabolize edici enzimler5, yüzey reseptörleri ve taşıyıcıların4'ün değiştirilmiş bir ekspresyonu ile karakterize edilirler. Ek olarak, bağırsak segmenti özgüllüğünden yoksundurlar ve bağırsak epitelinin karmaşıklığını özetlemekte başarısız olurlar, her model bağırsakta bulunan beş epitel hücre tipinden sadece birini içerir6.
Son zamanlarda, ince bağırsak ve kolon7,8 veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC)9 taze biyopsilerinden oluşturulan insan bağırsak organoid kültürleri, gelecekte hayvan deneylerini tamamlama, azaltma ve belki de yerini alma potansiyeline sahip alternatif deneysel modeller olarak tanıtılmıştır. İPSC'ler invaziv olmayan bir şekilde elde edilebilirken, iPSC'lerden organoidlerin oluşturulması, karmaşık ve uzun protokollerin (birkaç deneysel adımla) kullanılmasını gerektirir ve insan fetal dokusuna benzeyen kültürler üretir. Buna karşılık, biyopsi kaynaklı organoidler, bağırsak dokusunun doğal yenileme kapasitesinden yararlanabildikleri ve in vitro olarak süresiz olarak geçilebildikleri ve çoğaltılabildikleri için oldukça ölçeklenebilirler. Önemli olarak, biyopsi kaynaklı organoidler, geliştirildikleri birincil dokunun hastalığını ve bağırsak bölgesine özgü özelliklerini korur ve bağırsak epitelinin hücresel çeşitliliğini taklit eder. Organoidler, çeşitli gastrointestinal bozuklukların biyolojisini ve patogenezini çözmek ve terapötik yönetimlerini iyileştirmek için in vitro olarak hastaya özgü avatarlar olarak kullanılabilir. Bağırsak organoidleri etkileyici bir fizyolojik işlevsellik derecesine ulaşmış olsalar da, kan damarları, bağ dokusu, periferik sinirler ve bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere kritik stromal bileşenlerin yanı sıra mekanik stimülasyon eksikliği nedeniyle doğal organların karmaşıklığını yeniden üretememektedirler. Akış, kayma gerilmesi, gerilme ve basınç gibi mekanik parametrelerin doku morfogenezini ve homeostazı in vivo olarak etkilediği bilinmektedir ve daha önce in vitro10,11,12,13 hücrelerinin olgunlaşmasını iyileştirdiği gösterilmiştir. Organoid sistemlerin bir diğer önemli dezavantajı, lümenin ve dolayısıyla epitelin apikal tarafına erişilememesidir. Bu, iyon ve ilaç taşıyıcılarının polarize ekspresyonu, konakçı-mikrobiyom etkileşimleri ve farmasötik toksisite testi ile ilişkili çeşitli mekanizmaları araştırmak için bir zorluk teşkil etmektedir. Son olarak, organoid kültürler, in vitro öz-organizasyon sürecinin stokastik doğası ve hücre kaderi seçimleri nedeniyle boyut, morfoloji ve fonksiyonda önemli farklılıklardan muzdariptir. Bu nedenle, bağırsak organoidlerinin hastalık modelleme, ilaç taraması ve rejeneratif tıptaki tam potansiyelini gerçekleştirmek için, organoid gelişimindeki değişkenliği azaltan, luminal bölmeye erişimi artıran ve eksik hücre-hücre etkileşimlerini içeren yeni stratejiler araştırmak gerekir.
Çip üzerinde organ teknolojisi, mekanik kuvvetlerin ve sıvı akışının bağırsak hücre kültürlerine in vitro olarak dahil edilmesi için birçok teknik getirmiştir. Bununla birlikte, ilk kavram kanıtı çalışmalarının çoğu, yeterli hücresel çeşitlilik göstermeyen kanser kaynaklı hücre hatları kullandığından, bu sistemlerin alaka düzeyi sorgulanmıştır. Son zamanlarda, her yaklaşımın en iyi özelliklerini bir in vitro sistem14,15,16'ya dahil etmek için bağırsak organoidlerini ve çip üzerinde organ teknolojisini sinerjik olarak birleştirdik. Ortaya çıkan bağırsak-çip, bağırsak epitelinin çok hücreli mimarisini, epitelyal-endotel doku arayüzünün varlığını ve sıvı akışı ve gerilmesinin mekanik kuvvetlerini özetleyerek in vitro organ seviyesi fonksiyonlarının emülasyonunu sağlar. Ek olarak, birincil doku kaynaklı organoidlerin (insan bağırsağının farklı bölgelerinden örneklenebilen) bir başlangıç materyali olarak kullanılması, bu modelin çok yönlülüğünü arttırır, çünkü insan duodenum, jejunum, ileum ve kolonunu temsil eden çipler benzer tohumlama ve kültür prosedürlerini takiben kurulabilir. Önemli olarak, Bağırsak Çipleri gerçek zamanlı değerlendirmeyi sağlar: bağırsak bariyeri bütünlüğü; fırça sınırının ve ilaç metabolizması enzimlerinin aktivitesi; müsin üretimi; sitokinlerin salgılanması; ve bağırsak hücrelerinin patojenik ve kommensal mikroorganizmalarla etkileşimi, daha önce yayınlanan raporlarda gösterildiği gibi. Özellikle, farklı bireylerin dokularından üretilen organoidler kullanılarak bağırsak çipleri kurulduğunda, bu modeller çeşitli ilaçlara ve tedavilere fonksiyonel yanıtlarda beklenen donörler arası değişkenliği yakaladı. Organoidlerin Organ-on-a-Chip teknolojisi ile birleştirilmesi, in vitro bulguların fizyolojik alaka düzeyini ve doğruluğunu ve ayrıca insanlara ekstrapolasyonunu artırabilecek daha gelişmiş, kişiselleştirilmiş, in vivo ilgili modellere kapı açar. Burada, bağırsak çipinin kurulması ve iki bağırsak segmentinin fizyolojik fonksiyonlarının çalışmalarında uygulanması için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır: duodenum ve kolon. İlk olarak, duodenum çipindeki ilaç metabolize edici enzim CYP3A4'ün aktivitesini ve ayrıca rifampisin ve D3 Vitamini gibi prototipik bileşikler tarafından indüksiyonunu değerlendirme yöntemleri açıklanmaktadır. İkincisi, kolon çipinde "sızdıran bağırsak" ı modellemek için gereken adımlar protokolde özetlenmiştir, epitel bariyerinin bozulması, IBD'nin patogenezinde rol oynayan ayırt edici sitokinler kullanılarak gerçekleştirilmektedir. Kısaca, insan biyopsilerinden elde edilen organoidler in vitro olarak yayılır, enzimatik sindirime tabi tutulur ve çipin üst kanalına sokulur. Büyüme faktörü ile zenginleştirilmiş ortamlarla sürekli perfüzyon varlığında, 3D mimarisi ve kolayca erişilebilen apikal hücre yüzeyi ile birleştirilmiş bir epitel tek katmanına dönüşürler. Altta, "vasküler" çip bölmesi, ince veya kalın bağırsaktan izole edilen mikrovasküler endotel hücreleri ile tohumlanır. Epitel ve endotel, iki doku arasındaki parakrin etkileşimleri kolaylaştıran gözenekli gerilebilir bir zar ile ayrılır ve siklik deformasyonlara maruz kaldığında, insan bağırsağının peristalsis benzeri hareketlerini taklit eder. Ko-kültür, uygun hücre kültürü ortamı ile luminal ve vasküler perfüzyonun oluşturduğu dinamik akış koşulları altında korunur. Son olarak, doğrudan çip üzerinde veya örneklenmiş hücre kültürü atık sularından gerçekleştirilebilecek çok sayıda tahlil ve uç nokta analizi türünü açıklıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>AlphaBioRegen</td>
			<td>ALHE15</td>
			<td>0.5 cells M/ml ; cryopreserved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>AlphaBioRegen</td>
			<td>ALHE16</td>
			<td>0.5 cells M/ml ; cryopreserved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy-derived Human Duodenal Organoids</td>
			<td>John Hopkin&#39;s University</td>
			<td>-</td>
			<td>The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy-derived Human Colonic Organoids</td>
			<td>John Hopkin&#39;s University</td>
			<td>-</td>
			<td>The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zo&#235; CM-1&#8482;&#160;Culture Module</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Culture module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orb-HM1&#8482;&#160;Hub Module</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>5% CO2, vacuum stretch, and power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1&#8482; Stretchable Chip</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pod&#8482; Portable Modules</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Portable module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Light Box</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip Cradle</td>
			<td>Emulate&#160;Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>1 per square culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip&#174;-HV Filters</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SE1M003M00</td>
			<td>0.45&#160;&#956;m&#160;PVDF filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82051-068</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld&#160;vacuum&#160;aspirator</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4930</td>
			<td>&#160;-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating&#160;pipettes</td>
			<td>Corning / Falcon</td>
			<td>357558</td>
			<td>2 mL,&#160;polystyrene, individually&#160;wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating tips</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
			<td>Sterile (autoclaved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological&#160;pipettes</td>
			<td></td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>2 mL, 5 mL,&#160;10 mL,&#160;and&#160;25 mL&#160;low endotoxin, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>P20, P200,&#160;P1000&#160;and standard multichannel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette&#160;tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>P20, P200,&#160;and&#160;P1000.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes&#160;(Protein&#160;LoBind&#174; Tubes)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030122216;&#160;0030122240</td>
			<td>15 mL, 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Tubes&#174;&#160;lo-bind</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431081</td>
			<td>1.5 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells black walled plate</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for epithelial permeability analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (with camera)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For bright-field&#160;imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (or beads)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Set to 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum set-up</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>-</td>
			<td>Minimum&#160;pressure: -70 kPa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>220033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td>Cell culture flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent-1&#160;(ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Chip coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent-2&#160;(ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Chip coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS&#160;(DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25055CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93595</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TryplE&#160;Express</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Organoids&#160;dissociation&#160;and endothelium cells&#160;detachment&#160;solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult&#8482; Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>Organoid Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22121</td>
			<td>Endothelial medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin&#8482;&#160;</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ANT-PM-1</td>
			<td>antimicrobial agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment Factor&#8482;</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>4Z0-210</td>
			<td>coating solution for flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - Growth Factor Reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Solubilized basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>ECM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>ECM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td>organoid media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-10</td>
			<td>organoid media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>Basement mebrane matrix dissociationsolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9576</td>
			<td>30%, Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25055CV</td>
			<td>Sterile, Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3KDa Dextran Cascade Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D7132</td>
			<td>10 mg powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin (RIF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# R3501</td>
			<td>CYP inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testosterone hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1500</td>
			<td>CYP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# D1530</td>
			<td>CYP inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>159002</td>
			<td>LCMS stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>157-4</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>566460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Occludin</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Claudin 4</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>36-4800</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-E-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1416</td>
			<td>epithelial adherens junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VE-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33168</td>
			<td>endothelial adherent junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>339194</td>
			<td>tight junctions marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher&#160;Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12183020</td>
			<td>RNA lysis, isolation and purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript&#8482; IV VILO&#8482; Master Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11756050</td>
			<td>reverse transcriptase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan&#8482; Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444557</td>
			<td>qPCR reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio&#8482; 5 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A28573</td>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs99999901_s1</td>
			<td>Eukaryotic 18S rRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP3A4 primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs00604506_m1</td>
			<td>Cytochrome&#160; family 3 subfamily A member 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23236</td>
			<td>Protein quantification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Tris lysis buffer</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R60TX-3</td>
			<td>Protein lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved/Total Caspase-3 Whole Cell Lysate Kit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15140D</td>
			<td>Caspase 3 detection kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15198D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex)</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>K15053D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>20X long-distance objective lenses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AXIOvert.A1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Brightfield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>10X objective lenses</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining human organoids and organ-on-a-chip technology to model intestinal region-specific functionality

Bağırsak mukozası, sayısız önemli işlevi yerine getiren karmaşık bir fiziksel ve biyokimyasal bariyerdir. Besin maddelerinin ve ksenobiyotiklerin taşınmasını, emilimini ve metabolizmasını sağlarken, mikrobiyota ile simbiyotik bir ilişkiyi kolaylaştırır ve mikroorganizmaların istilasını kısıtlar. Çeşitli hücre tipleri ile fiziksel ve biyokimyasal ortamları arasındaki fonksiyonel etkileşim, bağırsak dokusu homeostazını kurmak ve sürdürmek için hayati öneme sahiptir. Bu karmaşık etkileşimlerin ve entegre bağırsak fizyolojisinin in vitro olarak modellenmesi, yeni terapötik hedeflerin ve ilaç adaylarının keşfedilme ve geliştirilme şeklini dönüştürme potansiyeline sahip zorlu bir hedeftir.
Organoidler ve Organ-on-a-Chip teknolojileri, yakın zamanda, bağırsak fizyolojisinin ve patofizyolojisinin in vitro fonksiyonel yönlerini incelemek için uygun insanla ilgili bağırsak çipleri üretmek için birleştirilmiştir. Küçük (duodenum) ve kalın bağırsağın biyopsilerinden elde edilen organoidler, bir organ çipinin üst bölmesine ekilir ve daha sonra her bağırsak bölgesinin farklı hücresel, moleküler ve fonksiyonel özelliklerini korurken tek katmanlı olarak başarıyla genişler. İnsan bağırsak dokusuna özgü mikrovasküler endotel hücreleri, epitelyal-endotel arayüzünü yeniden oluşturmak için organ çipinin alt bölmesine dahil edilir. Bu yeni platform, besinlere, ilaçlara ve mikroorganizmalara luminal maruziyeti kolaylaştırarak bağırsak taşınması, geçirgenlik ve konakçı-mikrop etkileşimleri üzerine çalışmalara olanak tanır.
Burada, insan duodenum (duodenum çipi) ve kolon (kolon çipi) temsil eden bağırsak yongalarının ve bunların sürekli akış ve peristalsis benzeri deformasyonlar altında müteakip kültürlerinin oluşturulması için ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır. Prototipik indükleyiciler ve substratlar kullanarak duodenum çipinde ilaç metabolizmasını ve CYP3A4 indüksiyonunu değerlendirmek için yöntemler gösteriyoruz. Son olarak, bir kolon çipinde interferon gama (IFNγ) aracılı bariyer bozulmasının (sızdıran bağırsak sendromu) in vitro modellenmesi için, parasellüler geçirgenliğin değişimini, sitokin sekresyonundaki değişiklikleri ve çip içindeki hücrelerin transkriptomik profillemesini değerlendirme yöntemleri de dahil olmak üzere adım adım bir prosedür sunuyoruz.

Şekil 1D, bağırsak çip kültürünün zaman çizelgesini özetler ve çip üzerinde tohumlamadan önce ve sonra bağırsak endotel hücrelerini ve organoidlerini gösterir. Ayrıca, duodenum çipindeki villus benzeri oluşumların varlığı ve ince bağırsak mimarisinin temsilcisi olarak vurgulanan duodenum ve kolon çipleri arasındaki belirgin morfolojik farklılıkları göstermektedir.
Şekil 3A,B, üç fark...

Watch this Scientific Journal Video about Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality at JoVE.com

Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

Biyopsi kaynaklı intestinal organoidler ve çip üzerinde organ teknolojileri, bölgeye özgü bağırsak işlevselliğini özetlemek için mikrofizyolojik bir platformda birleştirilir.

Bağırsak Bölgesine Özgü İşlevselliği Modellemek için İnsan Organoidlerini ve Çip Üzerinde Organ Teknolojisini Birleştirme

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

Bu protokol, biyopsi kaynaklı intestinal organoidlerin ve çip üzerinde organ teknolojisinin, farmakokinetiği ve ilaç-ilaç etkileşimini tahmin etmek ve bağırsak epitel bariyeri disfonksiyonunu incelemek için kullanılabilecek fizyolojik olarak ilgili bir bağırsak çipi oluşturmak için nasıl kullanılacağını göstermektedir. Organoidleri çip üzerinde organ teknolojisinde birleştirmek, bağırsak epitelinin karmaşıklığını yeniden üretmemize izin verir. Ek olarak, mekanik ipuçlarının, akış dağılımının ve biyokimyasal gradyanların daha fazla deneysel kontrolünü sağlar.Bu yöntem, insan bağırsağının karmaşık fizyolojisini taklit ederek, normal ve patolojik bağırsak fonksiyonlarının hücresel ve moleküler temelini daha iyi anlamasını sağlar. Bu, farmakokinetiğin ve farmakodinamiğin ve enflamatuar hasarı önlemek için potansiyel ilaç adaylarının daha iyi tahmin edilmesine yardımcı olur. Tohumlama, protokolde kritik bir adımdır.Bağırsak organoid fragmanlarının aşırı parçalanması veya yanlış tohumlama yoğunluğu, epitel bariyerinin gelişimini ve farklılaşmasını tehlikeye atabilir. Başlamak için, ortamı statik organoid kültürden aspire edin. Mililitre başına sekiz milyon hücrelik nihai bir tohumlama yoğunluğu elde etmek için yeterli kuyudan medyayı geri kazanın.Her bir kuyucuğa 500 mikrolitre buz gibi soğuk BMM ayrışma çözeltisi ekleyin ve çözünür BMM'yi kuyu yüzeyinden çıkarın. Süspansiyonu 15 mililitrelik düşük proteinli bir bağlama tüpüne toplayın ve buzun üzerine yerleştirin. Tüpü bir saat boyunca her 15 dakikada bir yavaşça sallayın.Bir organoid pelet elde etmek için dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın. Pelet üzerinde şeffaf bir jel tabakası gözlenirse, tüpten aspirat çözeltisi. Peleti yeniden askıya alın ve eşit miktarda BMM ayrışma çözeltisi ekleyin.10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatışın ve santrifüj yapın. Çözünür BMM kalıntıları kalmayana kadar tekrarlayın. Daha sonra süpernatantı atın ve peleti iki mililitre organoid sindirim çözeltisi içinde yeniden askıya alın.Tüpü bir ila üç dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve enzimatik reaksiyonu durdurmak için sekiz mililitre gelişmiş DMEM F12 ekleyin. Mililitre başına sekiz milyon hücre elde etmek için peleti tam organoid büyüme ortamında santrifüj yapın ve yeniden askıya alın. Aliquot 360 mikrolitrelik steril 1.5 mililitre düşük proteinli bağlayıcı tüplerde.Daha sonra, ortamı kaplanmış talaşların üst kanalından çıkarın ve 30 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Organoid parçalarını membrana yapıştırmak için çipleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Üst giriş rezervuarına üç mililitre önceden dengelenmiş tam organoid büyüme ortamı ve alt giriş rezervuarına üç mililitre önceden dengelenmiş endotel hücre büyüme ortamı ekleyin.İlgili üst ve alt çıkış rezervuarlarına aynı ortamdan 300 mikrolitre ekleyin. Taşınabilir modülleri taşıyan tepsiyi kültür modülüne aktarın. Kültür modülünde, yongaları başarılı bir şekilde bağlamak için yeterli damlacık oluşana kadar asal döngüyü tekrar tekrar çalıştırın.Ardından çip taşıyıcısını taşınabilir modüle kaydırın. Ardından, taşınabilir modül ve çipteki kültür ortamını basınçlandırmak için iki saat süren düzenleme döngüsünü başlatın ve ardından programlanan koşullar devam edecektir. Ardından, esnetme ayarlarını değiştirin ve kültür modülünü başlatın.24 saat sonra, döngüyü% 10 germe ve aynı frekansla tekrarlayın. Dozaj ortamını veya araç kontrolünü hazırlamak için, CYP indükleyici stok çözeltilerini veya DMSO'yu tam organoid büyüme ortamında ve endotel hücre büyüme ortamında seyreltin. Kültür modülünü duraklatın ve tepsileri biyogüvenlik kabinine getirin.Tüm giriş ve çıkış rezervuarlarındaki ortamı, indükleyiciler veya araç kontrolü ile iki mililitre dozaj ortamı ile değiştirin. Taşınabilir modülleri kültür modülüne geri döndürün ve akışı saatte 30 mikrolitrede yeniden başlatın. Ortamı her 24 saatte bir taze hazırlanmış indükleyici çözelti ile değiştirin ve kültüre 48 ila 72 saat devam edin.Daha sonra tepsileri biyogüvenlik kabinine getirin ve dozaj ortamını tüm rezervuarlardan aspire edin. Üst giriş haznesini ılık gelişmiş DMEM F12 ortamı ile ve alt rezervuarı endotel hücre büyüme ortamı ile yıkayın ve değiştirin. Yıkama ortamını bir mililitre prob substrat çözeltisi ile değiştirin.Talaşları beş dakika boyunca saatte 1.000 mikrolitrelik yüksek bir akış hızında perfüze edin ve hem üst hem de alt çıkış rezervuarlarını aspire edin. Talaşları kültür modülüne geri döndürün ve saatte 300 mikrolitrelik sabit bir akış altında bir saat boyunca inkübe edin. Bir saatlik işlemden sonra, akışı durdurun ve tepsileri biyogüvenlik kabinine getirin.Üst çıkış rezervuarından 100 mikrolitre atık su toplayın ve 200 mikrolitre durdurma çözeltisi içeren bir tüpe ekleyin. Tüpleri hemen kuru buz üzerine yerleştirin ve numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. Her iki kanalı da 200 mikrolitre steril DPBS ile yıkayın.Ardından alt kanal çıkışını 200 mikrolitrelik filtre pipet ucuyla bloke edin. Ayrışma çözeltisinin 50 mikrolitresini alt kanaldan geçirin ve oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin. Endotel hücrelerinin tamamen ayrılmasını sağlayın ve pipetleme ile ayrışma çözeltisini kanaldan çıkarın.Yıkamayı tekrarlayın. Ardından, üst kanal çıkışını bloke edin ve 75 mikrolitre protein lizis tamponunu perfüze edin. Pipet ucunu takılı bırakın ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın.Hücre lizatlarını 1,5 mililitrelik bir tüpte beş ila 10 kez pipetleyerek toplayın. Hücrelerin tamamen ayrılmasını sağlamak için perfüzyon ve toplamayı tekrarlayın ve lizatları analize kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. RNA lizisi için, 150 mikrolitre RNA lizis tamponu kullanırken aynı prosedürü izleyin.İlk olarak, stok çözeltilerini gazdan arındırılmış endotel hücresi büyüme ortamında seyrelterek bir interferon gama dozajlama çözeltisi hazırlayın. Biyogüvenlik kabininde, ortamı alt kanal giriş rezervuarlarından çıkarın ve günlük üç mililitre dozaj çözeltisi ile değiştirin. Daha sonra tepsileri kültür modülüne yerleştirin ve talaşları beş dakika boyunca saatte 1.000 mikrolitrelik yüksek bir akış hızında perfüze edin.Akış hızını saatte 60 mikrolitreye değiştirin ve akışkan kültüre devam edin. 96 delikli siyah duvarlı bir plakaya kuyucuk başına 100 mikrolitre DPBS ekleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, tüm rezervuarlardan ilgili kuyucuklara 50 mikrolitre atık su ekleyin.Standart bir eğri hazırlamak için, DPBS'de mililitre başına 100 mikrogram üç kilodalton dekstran kaskad mavisi içeren ortamın üç kat seyreltilmesini gerçekleştirin. Daha sonra DPBS'de endotel hücre büyüme ortamının üç kat seyreltilmesini kullanarak seri sanrılar gerçekleştirin. Duodenum ve kolon yongalarının farklı morfolojik özellikleri, ince bağırsağın mimarisini temsil eden duodenum çipindeki villus benzeri oluşumların varlığı ile vurgulanmıştır.Sitokrom P450 indükleyicileri rifampisin ve D3 vitaminine maruz kalan duodenum çipinde, ilaç metabolize edici enzim sitokrom P450 3A4 için yüksek bir mRNA gen ekspresyonu ve sitokrom P450 enziminin katalitik aktivitesini arttırdı. Kolon çipinin epitel tek katmanının interferon gama ile tedavi edilmesinde hücre morfolojisinde bozulma ve kolumnar epitel kaybı gözlendi. Ayrıca, interferon gama ile tedavi, araç kontrolüne kıyasla sıkı ve yapışkan bağlantı proteinlerinin sitoplazmik sinyalinin artmasına yol açmış, sıkı bağlantı belirteçleri ZO-1 ve claudin 4'ün yer değiştirmesini ve oklüdin ve E-kadherinin içselleştirilmesini göstermiştir.Kolon yongalarında 48 saatlik interferon gama stimülasyonunu takiben epitelyal parasellüler geçirgenlikte anlamlı bir artış gözlendi. Benzer şekilde, interferon gama, yarıklı Kaspaz 3'ün hücre içi içeriğindeki artışla gösterilen apoptozun aktivasyonunu indükler. İnterferon gama, VCAM-1 ve interlökin-6'nın bazolateral sekresyonu ve ICAM-1 ve serum amiloid proteininin apikal sekresyonu ile gösterildiği gibi kolon çipinde pro-inflamatuar moleküllerin polarize bir sekresyonunu indükledi.Bağırsak çipinin başarılı bir şekilde kurulmasını takiben, bağırsak emilimi, taşınması ve metabolizması, besin seviyeleri ve bağırsak hormonu sekresyonu, konakçı mikrop patojen etkileşimleri, ilaç güvenliği ve etkinliği, hastaya özgü hastalık mekanizmaları ve tedavilere verilen yanıtları inceleyebiliriz.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Üç boyutlu Mürekkep Püskürtmeli Baskı Teknolojisi Kullanımı İnsan Kıkırdak Doku Fabrikasyon

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı Safra Asit Sensor Kullanımı Hücre içi Safra Asit Dynamics Gerçek Zamanlı İzleme

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

İnsan bağırsak mukozasının bir Multisellüler Üç boyutlu Organotipik Modelinin Geliştirilmesi yerçekimi Yetiştirilen

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

Bir CRISPR-konkantör kullanarak Fare Küçük Bağırsak Organoidleri Üzerinde Birden Fazla Gen Kıyamet Protokolü

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

Uygulama gelişmiş teknoloji insan Gut Microbiota Eğitim Kültür Vitro

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases

Beyin kanseri ve nörodejeneratif hastalıkların Incelenmesi için insan nöral Organoidler

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Bireysel Lipozomlar Arasındaki Bileşimsel Homojenliği Saptamak için Kantitatif Floresan Mikroskopesi Bazlı Tek Lipozom Testi

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

Makromoleküler Kalabalık Kullanılarak İnsan Kutanöz Hipertrofik YaraNın In Vitro Modeli

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Olgun Serebellar Organoidlerin Ölçeklenebilir Üretimi ve İmmünboyama ile Karakterizasyonu

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...