Name: shotgun lipidomics of rodent tissues
Uploaded: 2022-11-18T13:00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues at JoVE.com

يود المؤلفون أن يشكروا فريق الدراسة ويقدروا بشكل خاص المساعدة الفنية والدعم المقدم من فرق البحث الحيوي والهباء الجوي في PMI R&D ، مختبرات فيليب موريس الدولية للأبحاث Pte. المحدودة، سنغافورة، وشركة فيليب موريس موريس برودكتس إس إيه، نوشاتيل، سويسرا. يشكر المؤلفون سام أنصاري على إدارته للبنوك الحيوية ويقرون بدعم Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy لتحرير مسودة المخطوطة.

جميع المؤلفين موظفون في شركة فيليب موريس إنترناشونال. فيليب موريس إنترناشيونال هي المصدر الوحيد لتمويل وراعي هذا المشروع.

يعرف دخان السجائر (CS) بأنه عامل خطر رئيسي مرتبط بتطور الأمراض الالتهابية المزمنة في الرئة ، بما في ذلك سرطان الرئة والتهاب الشعب الهوائية ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)1. بالإضافة إلى تأثير الرئة ، يلعب التعرض ل CS دورا مهما في تطور أمراض أخرى مثل مرض الشريان التاجي تصلب الشرايين وأمراض الأوعية الدموية الطرفية1. أمراض القلب والأوعية الدموية ، جنبا إلى جنب مع مرض الانسداد الرئوي المزمن ، هي الأسباب الرئيسية الأولى والثالثة للوفاة في جميع أنحاء العالم ، على التوالي. اعتمدت نهج تقييم المخاطر السمية تاريخيا على استخدام النماذج الحيوانية مثل القوارض. في الجسم الحي ، تستخدم نماذج الفئران والفأر للأنف فقط أو الجسم بالكامل بشكل شائع لدراسة الآثار طويلة المدى للتعرض ل CS.
على سبيل المثال ، بشكل عام ، يؤدي التعرض للدخان لمدة 6 أشهر إلى حدوث تشوهات نسيجية ووظيفية في رئتي الفئران تحاكي تلك الخاصة بالأمراض البشرية ، بما في ذلك انتفاخ الرئة وإعادة تشكيل مجرى الهواء وارتفاع ضغط الدم الرئوي ، على الرغم من أن التغييرات خفيفة نسبيا مقارنة بتلك التي لوحظت في المدخنين البشريين على المدىالطويل 2. في كل من الأنسجة الحيوانية والبشرية ، لاحظت الدراسات مجموعة واسعة من التغيرات الجزيئية استجابة للتعرض ل CS ، بما في ذلك استجابات الإجهاد التأكسدي ، والالتهاب ، وتغيرات الأنسجة الهيكلية 3,4. ليس من المستغرب أن يكون للتعرض ل CS تأثير بعيد المدى على دهون الرئة ، بما في ذلك التأثيرات على الدهون الخافضة للتوتر السطحي ، ووسطاء إشارات الدهون ، والدهون الهيكلية4،5،6.
لتوصيف التغيرات في الدهون السائبة الناجمة عن التعرض طويل الأمد ل CS لرئتي الفأر ، أجرينا تحليلا سريعا وكميا لقياس الطيف الكتلي بالتسريب المباشر للبندقية. بعد إدخال طريقة الدهون في البندقية في 20057 ، تم استخدام هذه الطريقة بشكل فعال لتوسيع معرفتنا حول التمثيل الغذائي الخلوي للدهون8،9،10 في أنظمة نموذجية مثل الخميرة 11 ، Caenorhabditis elegans12 ، و Drosophila melanogaster13 ، وكذلك في مجموعة واسعة من أنواع عينات الثدييات مثل خطوط الخلايا 14 ، 15,16 مختلف الإنسان17,18 وأنسجة القوارض 19,20 وسوائل الجسم21,22.
على مدى العقود الماضية ، كشفت الدراسات عن تعقيد الاستجابات الخلوية للتغيرات البيئية ، والتي تشمل الآلاف من البروتينات والدهون والأيضات المترابطة. وقد أوضح ذلك أن استخدام أحدث التقنيات التحليلية أمر ضروري للحصول على رؤية متعمقة للآليات الجزيئية وللكشف عن الحجم الكامل للتأثيرات الفسيولوجية الخارجية. في هذا السياق ، يمكن أن تضيف بصمات الدهون الكمية الشاملة التي تنتجها مناهج الدهون في البندقية بشكل فعال إلى معرفتنا حول التمثيل الغذائي الخلوي للدهون8،9،10.
فيما يتعلق بالتعرض ل CS كعامل خطر للعديد من الأمراض ، اعتمدت مناهج تقييم المخاطر السمية تاريخيا على استخدام النماذج الحيوانية مثل القوارض. يوفر Shotgun lipidomics MS أداة تحليلية سريعة وحساسة وكمية لتقييم اضطراب الدهون في العديد من أنواع العينات. الميزة الفريدة لعلم الدهون في البندقية هي التحليل الآلي للحقن المباشر لمستخلص الدهون الكلي - المسنن بمعايير داخلية موسومة - بدون فصل كروماتوغرافي إلى أداة MS عالية الدقة باستخدام رقاقة نانوية موصلة تولد رذاذ نانوي بالتأين الكهربائي (ESI)23.
توفر معلومات نسبة الكتلة إلى الشحن التي يتم الحصول عليها في وقت واحد في وضع MS1 البصمة الدهنية الكلية لجميع الدهون الداخلية السليمة. اختياريا ، يوفر وضع MS2 / MS3 ، الذي يتم فيه تجزئة جزيئات الدهون الأصلية وتحليلها ، معلومات هيكلية إضافية. يتطلب تحليل البيانات برامج متخصصة ويتضمن فك التفاف الأطياف وتخصيصات الذروة في الأطياف المجمعة التي تؤدي إلى تحديد الدهون وتوضيح التركيب الكيميائي المفترض. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء القياس الكمي المطلق عن طريق رفع خليط المعايير الداخلية المسمى الذي يحتوي على معيار دهني واحد على الأقل لكل فئة دهنية ذات أهمية. بشكل عام ، مع التقنية الحالية ، يمكن أن يغطي تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد الذي يستغرق بضع دقائق لكل عينة تحديد وتقدير ما يصل إلى 800 دهون من 14 فئة دهنية24 في أنسجة القوارض.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1, 5, and 2 mL self-lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086, 30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm stainless still beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.1 &#181;m nozzle chip</td>
			<td>Advion</td>
			<td>HD-D-384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>45754-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14267-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;23209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33065-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650498-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34856-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34873-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse pooled plasma</td>
			<td>BioIvt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse SPLASH standard</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>330710X</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-flat bottom well transparent plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62409-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z560049-300EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum diluent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment/software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPrep CP02 impactor instrument</td>
			<td>Covaris</td>
<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Magnetic hammer</td>
			
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChipSoft 8.3</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidXplorer 1.2.8.1</td>
			<td>N/A</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to identify lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak By Peak</td>
			<td>SpectroSwiss</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoWizard</td>
			<td>ProteoWizard</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive MS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>High resolution orbitrap mass spectrometer</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
<td>.&#160; &#160;</td>		
	<td>Tissue lyser</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac SPD140DDA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite M nano plus</td>
			<td>Tecan</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Plate reader</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriVersa Nanomate</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Direct infusion nano-source</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur 4.3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun lipidomics of rodent tissues

تلعب الليبيدات دورا حيويا كمكونات أساسية لجميع الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة. جعلت التحسينات التكنولوجية المستمرة في قياس الطيف الكتلي من علم الدهون أداة تحليلية قوية لمراقبة تركيبات الدهون في الأنسجة في حالات الاستتباب وكذلك المرض. تقدم هذه الورقة بروتوكولا خطوة بخطوة لطريقة تحليل دهون البندقية التي تدعم الكشف المتزامن والقياس الكمي لبضع مئات من أنواع الدهون الجزيئية في عينات مختلفة من الأنسجة والسوائل الحيوية ذات الإنتاجية العالية. تستفيد هذه الطريقة من الحقن المباشر الآلي لتدفق النانو لمستخلص دهني كلي تم رفعه بمعايير داخلية موسومة دون فصل كروماتوغرافي في أداة قياس الطيف الكتلي عالية الدقة. بدءا من كميات أقل من ميكروغرام من أنسجة القوارض ، يستغرق تحليل MS 10 دقائق لكل عينة ويغطي ما يصل إلى 400 دهون من 14 فئة دهنية في أنسجة رئة الفئران. الطريقة المعروضة هنا مناسبة تماما لدراسة آليات المرض وتحديد وقياس المؤشرات الحيوية التي تشير إلى السمية المبكرة أو الآثار المفيدة داخل أنسجة القوارض.

هنا ، كنتائج تمثيلية ، نقدم بيانات توضح كيف يمكن استخدام دهون البندقية لدراسة آثار CS على رئتي الفئران. تم تطبيق بروتوكول تحليل الدهون في البندقية بنجاح لدراسة في الجسم الحي للتحليل المقارن لمجموعتين من العينات: أنسجة الرئة التي تم تشريحها من تسع إناث من الفئران Apoe- / - المعرضة ل CS (مجموعة 3R4F ؛ التحكم الإيجابي) وعدد متساو من الفئران التي تم الاحتفاظ بها تحت ظروف الهواء النقي (مجموعة وهمية) كسيطرة سلبية تم جمعها في 3 أشهر ، 4 أشهر ، و 6 أشهر نقاط وقت التعرض. تم الاحتفاظ بالحيوانات تحت الهواء النقي المصفى والمكيف عند 22 درجة مئوية ± درجة حرارة 2 درجة مئوية و 55٪ ± 15٪ رطوبة وتغذت على نظام غذائي بالحبيبات المشععة بأشعة جاما. تم الحفاظ على نظام الضوء في 12 ساعة في اليوم. تم إيواء ما يصل إلى ثمانية فئران لكل قفص. تم شراء السجائر المرجعية 3R4F لمعالجة التعرض من جامعة كنتاكي لتوليد الهباء الجوي 3R4F CS (600 ميكروغرام من إجمالي الجسيمات TPM / L الهباء الجوي) لتركيز التعرض المستهدف ما يعادل 28 ميكروغرام من النيكوتين / لتر.CS تم إنتاج الدخان من سجائر 3R4F باستخدام آلات تدخين دوارة ذات 30 منفذا وفقا ل Phillips et al.27 . استنادا إلى بروتوكول التدخين المكثف في وزارة الصحة الكندية ، تم تطبيق 55 مل من حجم النفخة ، ونفخة واحدة لكل 30 ثانية ، وانسداد فتحات التهوية بنسبة 100٪ على سجائر 3R4F لتوفير التعرض الكافي. تم الإبلاغ عن جميع التفاصيل الإضافية حول تصميم الدراسة سابقا27,28.
بشكل عام ، تم تحديد ~ 400 نوع من الدهون الجزيئية من فئات الدهون ال 14 الأكثر وفرة وقياسها كميا (الشكل 3). كان إجمالي تركيز الدهون الطبيعي لكل فئة مرتفعا بشكل طفيف لفئات الدهون PE و PEO و PC و PCO و PI و PG ، ولوحظ بعض التنظيم الناقص للدهون SM و LPE و PA (الشكل 3A) ، بينما لا يمكن رؤية أي فرق ل TAGs و PS. ومن المثير للاهتمام ، تم الإبلاغ عن مستويات مرتفعة من دهون البلازمالوجين PCO و PEO في مجموعة CS في الخلايا الالتهابية29 . واحدة من وظائف داخل الخلايا من الدهون البلازمالوجين هو نشاط مضاد للأكسدة. تحت التعرض للأكسجين التفاعلي (ROS) وأنواع النيتروجين (RNS) ، تم الإبلاغ عن الأكسدة الانتقائية للبلازمالوجينات مقارنة ب diacyl phospholipids30. رابطة إنيل الأثير في التركيب الكيميائي للبلازمالوجينات حساسة للهجوم الجذري على الإجهاد التأكسدي31. المنتجات الرئيسية للهجوم الجذري هي أحماض إيكوساتيتراينويك الهيدروكسيلية ، 2-أحادي الجلسرين الفوسفوليبيدات ، بنتاديكانول ، أحماض الفورميك ، α-هيدروكسي ألدهيدات بأطوال سلسلة مختلفة ، 1-فورميل-2-أراكيدونويل غليسيروفوسفوليبيد ، وليسوفوسفوليبيدات.
تظهر هذه النتائج أنه من بين السمات الجزيئية القائمة على الصيغة الجزيئية الكلية ، تأثر 100-120 مركبا بشكل كبير بالتعرض ل CS (الشكل 3D). سمح الالتفاف التفصيلي لمعلومات تجزئة MS2 وتطبيع شدة إشارة الشظايا بالتعريف التقريبي للكمية الإجمالية لكل حمض دهني مقترن (FA) ممثل في كل فئة دهنية (الشكل 3E) ومقارنة هذه البيانات بين المجموعات المكشوفة والمجموعة الضابطة. لوحظ انخفاض واضح في كل من FAs المشبعة بالكامل وتلك التي تحتوي على عدد قليل من عدم التشبع ، معظمها في سياق الدهون الليزو. في المقابل ، كانت الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة (PUFA) في تكوين فئات الفوسفوليبيد PC و PE و PG مرتفعة في مجموعة CS لجميع النقاط الزمنية. تم الكشف عن الحالات القصوى من PC و PG المترافقة مع eicosapentanoic (EPA) وحمض الدوكوساهيكسانويك (DHA) حصريا في مجموعة التعرض 3R4F CS (الشكل 3E ، اللون الأحمر).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig01.jpg"> الشكل 1: تخطيط اللوحة لتوزيع العينات في مقايسة برادفورد. توضع العينات الفارغة والقياسية في ثلاث نسخ في الأعمدة 1-3 ؛ يتم وضع عينات غير معروفة في نسختين في الأعمدة 4-11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig02.jpg"> الشكل 2: تخطيط لوحة لوحة المعايرة الدقيقة ذات 96 بئرا لتحليل مطياف كتلة البندقية. يتم تعيين توزيع العينات الفارغة والقياسية وغير المعروفة ومراقبة الجودة للاقتناء في وضع التأين الإيجابي على الجانب الأيسر من اللوحة (الأعمدة 1-6) ؛ يتم وضع جميع العينات لوضع التأين السلبي على اليمين (الأعمدة 7-12). الاختصارات: pos = إيجابي ؛ مراقبة الجودة = مراقبة الجودة ؛ neg = سلبي ؛ TB = إجمالي فارغ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig03.jpg"> الشكل 3: تحليل شحوم البندقية لرئتي الفأر المعرضتين لدخان السجائر. تعرضت فئران Apoe− / - ل CS من السيجارة المرجعية 3R4F أو الهواء النقي (الوهمية). أ: تركيزات فئة الليبيدات وعدد أنواع الليبيدات لكل طبقة. لكل فئة، يعطى عدد أنواع الليبيدات الكمية بين قوسين. فترات ثقة متوسطة و 95٪ لكل فئة دهون ، بشكل منفصل لكل نوع من أنواع التعرض (مجمعة عبر ثلاث نقاط زمنية). (ب) مخططات البركان التي توضح حجم التأثير (تغير أضعاف log2) والأهمية (-log10 قيمة p المعدلة ب FDR) لأنواع الدهون الكمية لمقارنة 3R4F CS مقابل الوهمية في النقاط الزمنية الثلاث. يتم تمييز الدهون المرتفعة بشكل ملحوظ باللون الأصفر. يتم تمييز الدهون المنخفضة بشكل ملحوظ باللون السماوي (قيمة p المعدلة بنسبة FDR < 0.05). ج: الوفرة التفاضلية لأنواع الليبيدات البالغ عددها 25 نوعا مع أكبر تغيرات في متوسط الطيات المطلقة. تغييرات أضعاف Log2 لمقارنة 3R4F CS مقابل الوهمية مرمزة بالألوان ، ويشار إلى الأهمية الإحصائية: *: قيمة p المعدلة من قبل FDR < 0.01 ؛ X: قيمة p المعدلة من قبل FDR < 0.05. (د) قطع المقارنة. معاملات الارتباط لمقارنات تغير الطيات مرمزة بالألوان ، ويشار إلى عدد الدهون الوفيرة التفاضلية المشتركة (إجمالي الأرقام في الهوامش). تظهر المخططات الدائرية النسبة المئوية للدهون الوفيرة التفاضلية المشتركة بنفس اتجاه التغيير (علامة FC). تشير العلامة النجمية إلى تداخل كبير في الدهون الوفيرة التفاضلية. ه: الوفرة التفاضلية للاتحادات الفاسدة المترافقة لكل فئة من فئات الدهون. خريطة الحرارة كما في اللوحة C للأحماض الدهنية المترافقة مع اختلافات وفرة كبيرة بين 3R4F والتعرض الوهمي في جميع النقاط الزمنية الثلاث (قيمة p المعدلة ب FDR < 0.05). تم تقدير كمية كل حمض دهني لكل فئة دهنية بناء على شدة MS2 لشظايا الأحماض الدهنية. الاختصارات: CS = دخان السجائر. FDR = معدل الاكتشاف الخاطئ ؛ FC = أضعاف التغيير ؛ FA = الأحماض الدهنية. PC = فوسفاتيديل كولين. PS = فوسفاتيديل سيرين. TAG = ثلاثي الجلسرين ؛ SM = سفينغوميلين. PEO = بلازمالوجين فوسفاتيديل إيثانولامين. PE = فوسفاتيديل إيثانولامين. PG = فوسفاتيديل الجلسرين. PI = فوسفاتيديلينوسيتول. DAG = دياسيل الجلسرين ؛ SE = استرات ستيرول / كوليستيريل ؛ PCO = بلازمالوجين فوسفاتيديل كولين. LPC = ليسو فوسفاتيديل كولين. LPE = ليسو فوسفاتيديل إيثانولامين. PA = حمض الفوسفاتيديك. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>التركيز النهائي ل BSA (ملغم / مل)</td>
			<td>محلول BSA عند 2 ملغم / مل (ميكرولتر)</td>
			<td>عازلة بيكربونات الأمونيوم (μL)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0.75</td>
			<td>37.5</td>
			<td>62.5</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>25</td>
			<td>75</td>
		</tr><tr><td>0.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>87.5</td>
		</tr><tr><td>0.125</td>
			<td>12.5</td>
			<td>187.5</td>
		</tr><tr><td>0.0625</td>
			<td>50 من محلول 0.125 ملغم/مل</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 1: مخطط التخفيف للمعيار الداخلي BSA لمنحنى المعايرة لمقايسة برادفورد. اختصار: BSA = ألبومين مصل الأبقار.
معلومات تكميلية: ملفات MFQL المستخدمة لتحديد الدهون LipidXplorer. تتكون الحزمة .zip من ملفات MFQL الفردية المطلوبة ، كل منها مسمى باتباع هذا النمط: اختصار فئة < الدهون>__<وضع التأين>_MS2.mfql (على سبيل المثال ، PE_neg_MS2.mfql). تتضمن أسماء الملفات للتعريف القياسي الداخلي المسمى علامة D7 (D9) في <اختصار الدهون> (على سبيل المثال ، PED7_neg_MS2.mfql). يتم استخدام هذه الملفات MFQL للتحقق من كمية الديوتيريوم في المعيار الداخلي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/-_Supplementary%20Information%20JoVE%20Review.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues at JoVE.com

Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

تقدم الدهون القائمة على قياس الطيف الكتلي للبندقية لقطة كمية حساسة لمجموعة واسعة من فئات الدهون في وقت واحد في قياس واحد من أنسجة القوارض المختلفة.

بندقية الدهون من أنسجة القوارض

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...

يسمح البروتوكول المقدم بتحديد مجموعة واسعة من الدهون في الأنسجة الحيوانية. إنها أداة سهلة لدراسة آليات الدهون وأيضا لتحديد العلامات الحيوية التي تشير إلى السمية المبكرة في النماذج الحيوانية. تقدم الطريقة لمحة كمية لأكثر من 400 دهون جزيئية في 14 فئة دهون مختلفة في مجموعة متنوعة من مصفوفات العينات مع وقت اتجاه مدته 10 دقائق لكل عينة.للبدء ، تمييع الطرد المركزي القسمة 1 طاف ضعف التركيز مع عازلة بيكربونات الأمونيوم. بعد تحضير منحنى الألبومين المصلي البقري القياسي ، دوامة الأنابيب القياسية وأجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 18،200 غرام لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة. من الأنابيب القياسية المعدة مسبقا ، انقل 6 ميكرولتر لكل من الفراغ والمعايير والعينات إلى لوحة مسطحة القاع 96 بئرا.بعد ذلك ، أضف 250 ميكرولترا من كاشف برادفورد إلى كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات ومزيج. بعد الحضانة لمدة 5 دقائق ، قم بقياس الامتصاص بطول موجي 595 نانومتر باستخدام قارئ لوحة. تحضير أنابيب 2 ملليلتر مع 100 ميكرولتر من محلول بيكربونات الأمونيوم في كل أنبوب من إجمالي الفراغ والمعيار الداخلي فارغة والاحتفاظ بجميع العينات على الجليد.إعداد عينات مراقبة الجودة ، مع الأخذ في الاعتبار وضع عينة واحدة لمراقبة الجودة بين كل مجموعة من 10 عينات. أضف 10 ميكرولتر من البلازما البشرية المجمعة إلى أنابيب 2 ملليلتر ، ثم قم برفع 10 ميكرولتر من المحلول القياسي الداخلي في جميع عينات الفراغ ومراقبة الجودة والدراسة القياسية الداخلية. أضف 300 ميكرولتر من خليط البيوتانول ميثانول 20 درجة مئوية تحت الصفر إلى كل عينة ورجها عند 450 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على خلاط حراري.بعد ذلك ، أضف 300 ميكرولتر من خليط أسيتات إيثيل الهبتان ورج عند 450 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على الخلاط الحراري ، ثم أضف 300 ميكرولتر من خليط حمض الزهد 1٪ ورجه لمدة 5 دقائق عند 450 جم في درجة حرارة الغرفة على الخلاط الحراري. أجهزة الطرد المركزي عند 2،800 جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ونقل 360 ميكرولتر من المرحلة العليا إلى أنبوب قفل ذاتي جديد سعة 2 ملليلتر يسمى 2. بعد إضافة 320 ميكرولتر من أسيتات إيثيل الهبتان إلى أنبوب طور الماء المسمى 1 ، رج عند 450 جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على الخلاط الحراري ، ثم الطرد المركزي عند 2،800 جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة كما هو موضح سابقا.انقل 320 ميكرولترا من المرحلة العليا وادمجها مع الكسر من الخطوة السابقة في الأنبوب 2. وبالمثل ، أضف 250 ميكرولترا من أسيتات إيثيل الهبتان إلى مرحلة الماء في الأنبوب 1 ورجها عند 450 جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على الخلاط الحراري. مرة أخرى ، أجهزة الطرد المركزي عند 2،800 جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم نقل 200 ميكرولتر من المرحلة العليا ودمجها مع الكسور من الخطوات السابقة في الأنبوب 2.يتبخر حتى يجف عند 35 درجة مئوية في مكثف فراغ ويعاد إذابته في 300 ميكرولتر من محلول مزيج MS. دوامة كل أنبوب لمدة 5 ثوان لضمان إذابة كل شيء وأجهزة الطرد المركزي في 18،200 غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل حصة 50 ميكرولترا إلى لوحة الميكرولتر لتحليل وضع التأين الإيجابي وقم بتخفيفها باستخدام 50 ميكرولتر من محلول مزيج MS.مرة أخرى ، قم بتخفيف 80 ميكرولترا من مزيج MS ونقل حصة 20 ميكرولتر إلى لوحة MTP لتحليل وضع التأين السلبي. لف اللوحة بورق القصدير واحفظها عند 4 درجات مئوية قبل التحليل. قم بمعايرة مرض التصلب العصبي المتعدد في كل من الأوضاع الإيجابية والسلبية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة قبل 5 أيام أو أقل من التحليل.قم بتثبيت مصدر نانو التسريب المباشر مقدما ، مع التأكد من محاذاته بشكل صحيح مع الشعيرات الدموية للنقل ل MS وشريحة فوهة 4.1 ميكرومتر في حامل الرقاقة ، ثم تحقق من معلمات التسريب الإيجابي والسلبي المقابل لضغط غاز يبلغ 1.25 رطل / بوصة مربعة ، جهد المصدر 1.1 كيلو فولت ، 5 ميكرولتر من حجم حقن العينة ، إغلاق ملامسة الإخراج Rel1 لمدة 2.5 ثانية ، 5 دقائق من وقت التسليم ، تبريد اللوحة عند 4 درجات مئوية ، ثم قم بإعداد وحدة التحكم في درجة الحرارة وإنشاء لوحة جديدة. بالنسبة للوضع الإيجابي ، تحقق من البرنامج واضبطه بحيث تم إعداد طريقة MS بدرجة حرارة شعرية تبلغ 250 درجة مئوية ومستوى S Lens RF عند 65.0. في برنامج Xcalibur ، افتح الطريقة الإيجابية وتحقق من إعداد اكتساب MS للمسح الكامل من صفر إلى دقيقة واحدة في نطاق 550 إلى 1،000 m / z بدقة 140،000 مع التحكم الآلي في الكسب من 1 مليون والحد الأقصى لوقت الحقن من 50 مللي ثانية.تطبيق كتلة القفل 680.48022. تحقق من إعداد طريقة اكتساب MS / MS المستقلة عن البيانات بين النطاق الزمني 1 و 5 دقائق بدقة 17،500 مع كتلة أولى ثابتة تبلغ 250 م / ض. تحقق من إعداد التحكم الآلي في الكسب ل MS2 عند 100،000 والحد الأقصى لوقت الحقن عند 64 مللي ثانية ، وطاقة تصادم تبلغ 20 NCE ، ونافذة العزل عند 1 m / z وأن قائمة كتلة التضمين من 398 إلى 1،100 m / z تستخدم مع خطوة كتلة 1 دالتون.للحصول على في الوضع السلبي ، تحقق من برنامج الضبط الذي تم إعداد طريقة MS مع درجة حرارة الشعيرات الدموية عند 250 درجة مئوية في مستوى RF S-lens عند 65.0 في ملف MS tune. بعد ذلك ، في برنامج Xcalibur ، تحقق من إعداد وضع اكتساب المسح الكامل من صفر إلى 1 دقيقة بدقة 140،000 تغطي نطاق 400 إلى 940 م / ض ، والتحكم الآلي في الكسب من 1 مليون ، والحد الأقصى لوقت الحقن من 200 مللي ثانية ، وكتلة قفل من 526.46262. تحقق من أن اكتساب MS2 في وضع DIA تم إعداده بين 1 و 5 دقائق من التشغيل بدقة 17 ، 500 مع كتلة أولى ثابتة تبلغ 150 م / ض ، والتحكم الآلي في الكسب يبلغ 100،000 ، و 64 مللي ثانية من الحد الأقصى لوقت الحقن و 35 NCE من طاقة الاصطدام باستخدام قائمة كتلة التضمين من 400 إلى 940 مع خطوة كتلة 1 دالتون.قم بإنشاء قائمة انتظار تسلسل التحليل في برنامج Xcalibur في الوضع الإيجابي وقم بتشغيله ، ثم قم بإنشاء التسلسل في برنامج ChipSoft وابدأ التحليل أثناء انتظار الحصول على العينة ليتم تشغيله بواسطة إشارة إغلاق اتصال قادمة من روبوت التسريب المباشر لكل عينة. عند اكتمال تحليل الوضع الإيجابي ، قم بإنشاء قائمة انتظار تسلسل التحليل في برنامج Xcalibur في الوضع السلبي وقم بتشغيله ، ثم قم بإنشاء التسلسل في برنامج ChipSoft وابدأ التحليل أثناء انتظار الحصول على العينة ليتم تشغيله بواسطة إشارة إغلاق الاتصال القادمة من روبوت التسريب المباشر لكل عينة. تم تحديد إجمالي تركيز الدهون الطبيعي وقياسه كميا من فئات الدهون ال 14 الأكثر وفرة ، والتي كانت مرتفعة قليلا لفئات الدهون PE و PEO و PC و PCO و PI و PG ولوحظ بعض التنظيم السفلي للدهون SM و LPE و PA.بينما لا يمكن رؤية أي فرق بين TAGs و PS. تظهر هذه النتائج أيضا أنه من بين الميزات الجزيئية القائمة على الصيغة الجزيئية الكلية ، تأثر 100 إلى 120 مركبا بشكل كبير بالتعرض لدخان السجائر. سمح فك التفاف تجزئة MS2 وتطبيع شدة إشارة الشظية بالتعريف التقريبي للكمية الإجمالية لكل حمض دهني مقترن ممثل في كل زجاج دهني ومقارنة هذه البيانات بين المجموعات المكشوفة والمجموعة الضابطة. لوحظ انخفاض في الأحماض الدهنية المشبعة بالكامل وعدد قليل من الأحماض الدهنية غير المشبعة ، في حين أن الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة في تكوين فئات الفوسفوليبيد PC و PE و PG كانت مرتفعة في مجموعة دخان السجائر لجميع النقاط الزمنية.تم الكشف عن الحالات القصوى من PC و PG المترافقة مع حمض eicosapentaenoic و docosahexaenoic حصريا في مجموعة التعرض 3R4F CS. يجب أن يتم سحب عينة العينة وعينة مراقبة الجودة بأطراف منخفضة النطاق وأن تكون دقيقة ، مما يعني أنه يجب فحص النصائح بين كل عينة. يعد سحب الحل القياسي الداخلي أمرا بالغ الأهمية ويجب أن يكون دقيقا.يجب التعامل مع محلول الميثانول ثنائي كلورو الميثان 1 إلى 1 بعناية ويجب استخدام أطراف غير ملدنة تحتوي على تجنب وجود بوليمرات بلاستيكية في العينات. يجب تغيير النصائح بين كل عينة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

طريقة لقياس الحمض النووي الريبي<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine تعديلات في الخلايا والأنسجة

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

تعزيز نموذج المتعدد من الأنسجة عن طريق الجمع بين السلائف النظائر وسمها وإسوي الضغط توصيف (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS للمتعمقة توصيف والكمي لالجلوتامين والهليونين نزع الأميد في البندقية البروتيوميات

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

عزل بروتينات الشعيرة المتوسطة من أنسجة الفئران المتعددة لدراسة التعديلات المرتبطة بالشيخوخة بعد الترجمة

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

تصوير الأنسجة اميلويد ملطخة بالانارة أوليجوثيوفينيس مترافق بالفائقة الطيفية [كنفوكل] مجهرية والأسفار تصوير مدى الحياة

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

نبات رذاذ الكتلي: أسلوب تاين المحيطة سريع مباشرة تقييم نواتج الأيض من الأنسجة النباتية

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

البروتين خارج الخلية ميكرواري تكنولوجيا للكشف عن ارتفاع الإنتاجية منخفضة تقارب مستقبلات-يجند التفاعلات

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

مقارنة مستويات البروتين عبر الأنسجة، وفي جميع أنحاء تطوير استخدام النشاف الغربية كمية موحدة قوية

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

القياس الكمي لانزيم A في الخلايا والانسجه

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

إثراء الأنسجة الثديية وأوسيتس زينوبوس مع الكوليسترول

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...