Name: shotgun lipidomics of rodent tissues
Uploaded: 2022-11-18T13:00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke undersøgelsesteamet og især anerkende den tekniske bistand og støtte fra bioforsknings- og aerosolholdene hos PMI R&D, Philip Morris International Research Laboratories Pte. Ltd., Singapore, og PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, Schweiz. Forfatterne takker Sam Ansari for at styre biobanken og anerkender støtten fra Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy for at redigere et udkast til manuskriptet.

Alle forfattere er ansatte hos Philip Morris International. Philip Morris International er den eneste kilde til finansiering og sponsor af dette projekt.

Selv om fremskridt inden for MS har givet en række forskellige metoder til nøjagtig overvågning af mange lipidarter, viste den tidligere lipidprofilering af forskellige pattedyrvæv ikke konsistente resultater, og derfor er lipidernes særlige vævsspecifikke funktioner fortsat uklare. I sammenligning med proteinfunktionel analyse, for hvilken der findes mere robuste tilgange til at slå ekspressionen af bestemte forbindelser ud, kan størstedelen af lipider ikke selektivt slukkes eller overudtrykkes i væv, hvilket gør den funktionelle evaluering af lipider vanskelig. Avanceret profilering af vævslipidomkoncentrationer kan give en alternativ tilgang til at identificere sammenhænge mellem cirkulerende lipider og humane sygdomme.
Ved evaluering af omfattende lipidomics-metoder, der kvalitativt og kvantitativt kan dække den endogene lipidprofil af ethvert musevæv, foretrak vi shotgun lipidomics-metoden. Generelt er to modsatte typer prøveanalyse mulige: enten en fuldstændig ikke-målrettet screening af lipider ved hjælp af væskekromatografi (LC) -baseret adskillelse med yderligere massespektrometrisk detektion for at afsløre prøvens samlede lipidkompleksitet eller målrettede tilgange, som for det meste muliggør meget præcis kvantificering af specifikke lipider af interesse. I modsætning hertil er det stærke træk ved den præsenterede shotgun lipidomics workflow den hurtige omfattende dækning af hundredvis af endogene lipider fra foruddefinerede lipidklasser, som stadig kan udføres på en robust semikvantitativ måde.
Ioniseringseffektiviteten af forskellige lipidklasser er strukturafhængige og kan variere drastisk afhængigt af de forskellige eksperimentelle ioniseringsbetingelser. I modsætning til LC-baserede separationsmetoder minimerer haglgeværanalyse disse forskelle på grund af den direkte samtidige infusion af hele lipidekstraktet under de samme ioniseringsbetingelser i MS-instrumentet. Anvendelsen af isotopisk mærkede lipidanaloger eller strukturelt lignende ikke-endogene standarder tillader semi-kvantificering af alle lipidklasser. Shotgun lipidomics giver lav inter- og intra-run variabilitet under MS-analyse; Som følge heraf producerer denne metode lavere variationskoefficienter21 end ikke-målrettede væskekromatografibaserede metoder, som kræver flere standarder for tilstrækkelig kvantificering. Det er vigtigt, at selv om der ikke anvendes nogen ekstern kalibreringskurve i den nuværende metode, betragtes metoden stadig som fuldt kvantitativ32.
Et niveau af mærket intern standard (eller umærket standard, der ikke udtrykkes endogent) pr. lipidklasse er tilstrækkelig til kvantificering af de fleste lipider. Kun få publikationer har rapporteret en delvis metodevalidering for en shotgun lipidomics-metode. For eksempel blev der i Gryzbek et al.17 og Surma et al.21 fremstillet omvendte kalibreringskurver ved hjælp af interne standarder og en fast mængde prøvematrix. Linearitet blev vurderet ved lineær regression af log-transformerede lipidmængder og deres intensiteter og rapporteret som henholdsvis R2 og hældning. Detektionsgrænsen (LOD) og kvantificeringsgrænsen (LOQ) blev bestemt ved vægtet lineær regression baseret på et signal-støj-forhold på 3 for LOD og 10 for LOQ. For de fleste lipidklasser blev LOQ defineret mellem 2-9,8 pmol for fedtvæv og 0,05-5μM i plasma. I begge tilfælde blev ikke-endogene interne enkeltstandarder pr. klasse anvendt til at udlede estimater for alle lipider i klassen. I dette arbejde leverer vi imidlertid ikke LOD / LOQ på grund af flere bekymringer: den endogene matrix er ikke stoffri, og surrogatmatrixen for væv er ikke tilgængelig - med dette er spidsen af små kendte mængder standarder ikke mulig. Vi udfører ikke en klassisk målrettet kvantificeringsmetode ved brug af en kalibreringskurveserie af en bestemt forbindelse normaliseret af dens identiske isotopmærkede standard på grund af ikke-eksistensen af rene standarder og den meget begrænsede tilgængelighed af isotopisk mærkede lipider. Orbitrap-detektorer udfører automatisk konverteringen af det forbigående signal ved at anvende en Fourier-transformation, og noget signal er allerede erstattet - som følge heraf vil det lavere koncentrationsområde kun være lineært ned til et minimumssignal, under hvilket molekylet ikke længere kan detekteres. Xcalibur-softwarens signal-støj-værdier afhænger af molekylets m/z-forhold; Som følge heraf vil forbindelserne i hver lipidklasse, der indeholder forskellige kombinationer af fedtsyrer, have forskellige støjværdier. Desuden er LOQ/LOQ-værdier strengt knyttet til matrixtypen, og når kvantificering af lipidomet udføres i forskellige gnavervæv, bør det afspejles ved vurderingen af LOQ'er for hver vævstype individuelt.
Faktisk tilbyder metoden et højt lineært dynamisk kvantificeringsområde på op til fire størrelsesordener33 og meget god følsomhed til at dække de vigtigste endogene strukturelle lipider, som kan øges yderligere ved tekniske forbedringer i MS-erhvervelse32. Variationskoefficienterne for de gennemsnitlige lipidkoncentrationer var for det meste under 15%, hvilket betyder, at shotgun lipidomics overholder Food and Drug Administration (FDA) krav som en metode, der skal overvejes til god laboratoriepraksis (GLP) og god klinisk praksis (GCLP) undersøgelser34.
Det skal dog bemærkes, at nogle lipidklasser på grund af deres forskellige polaritet bliver meget mere påvirket af bidraget fra specifikke konjugerede FA'er. Dette fører til forvrængning i intensitetsresponsen i ækvimolære blandinger, der indeholder en bred vifte af konjugerede FA'er, hvilket resulterer i kvantificeringsbias, som fremhævet af Koivusalo et al.35 for phospholipidklasser. Det skal bemærkes, at disse forfattere præsenterede data for en bred vifte af FA'er fra 24-48 kædelængde, hvilket sandsynligvis ikke afspejler situationen i en reel biologisk prøve. Responset for flerumættede arter var 40% højere end for fuldt mættede arter, men denne effekt blev kun observeret for højere koncentrationer. Når blandingen gradvist blev fortyndet, faldt effekten af umættethed gradvist og forsvandt praktisk talt ved 0,1 pmol/μL pr. art. Derudover blev alle målinger udført på ionfælde og tredobbelte quadrupoles instrumenter og ikke på Q-Exactive udstyr.
En anden fordel ved den præsenterede arbejdsgang er dens tekniske fleksibilitet, som muliggør tilpasning til specifikke projektkrav. For eksempel kan enhver lipidekstraktionsprotokol - såsom de modificerede Bligh og Dyer36, methyltert-butylether 37 eller butanol-methanol38 metoder - anvendes til fremstilling af et totalt lipidekstrakt før MS-analyse. Hovedbegrænsningen ved chloroform-methanolekstraktion er, at den nedre fase indeholder lipidfraktionen, hvilket komplicerer rutinearbejde og især automatisering; Derudover skal chloroforms toksicitet overvejes. Tert-butyletherekstraktion anvendes i vid udstrækning til lipidanalyse af plasmaprøver37, og en automatiseret version er blevet foreslået21. I dette tilfælde valgte vi BUME-metoden, fordi den giver endnu bedre genvinding for de spikede PG-, PI-, PA- og PS-lipidklasser38, lavere opløsningsmiddelforbrug og muligheden for automatisering39, mens de samlede koncentrationer kvantificeret for vævsprøver ekstraheret ved alle tre metoder var sammenlignelige. Derudover, mens prøveekstraktionen blev udført manuelt i det aktuelle arbejde, er det også muligt at opnå reproducerbare og præcise resultater fra store prøvesæt ved automatiseret prøveforberedelse og lipidekstraktion i et 96-brøndformat40,41. Dette gør det muligt at implementere lipidomics-analyse i store kliniske og toksikologiske undersøgelser.
I det aktuelle arbejde udførte vi MS-erhvervelsen af positive og negative tilstande separat uden polaritetsskift som beskrevet af Schuhmann et al.42. Stabiliteten af nanomatsignalet er bedre i negativ tilstand for en lidt mindre koncentreret opløsning end i positiv tilstand. Derudover udviklede vi en fuldt sporbar procedure med konverteringssoftware fra .raw filer til mzML, som giver de værdier, der skal specificeres i LipidXplorer-softwaren - med dette er manuelle opløsningshældningsberegninger ikke påkrævet. Vi anvendte også forskellige støjindstillingssubstitutioner, fordi spektrenes støjniveauer i positiv tilstand er højere end i negativ tilstand. Alle trin blev optimeret til sporbare rutineanalyser med højt gennemløb.
Til identifikation kan shotgun lipidomics analyse udnytte den unikke opførsel af forskellige lipidklasser, som danner unikke addukter i forskellige polaritetstilstande. I denne metode kan PC- og PE-arter med samme molekylmasse, der overlapper hinanden i den positive ioniseringstilstand, adskilles fuldstændigt i den negative ioniseringstilstand, da PC danner acetat- eller formikataddukter, og PE ioniseres i en deprotoneret form. Desuden er (delvis) strukturel dekonvolution mulig for metoden, der ikke kun anvender molekylformlen, men også bulkfedtsyrestrukturen. For eksempel fungerer FA-identifikation på niveauet af totalt kulstof og totalt umætningsantal for alle fosfolipider, DAG'er, TAG'er og lyso-phospholipider. Bottom-up-kvantificeringen af hver isomere form kan delvist udføres for nogle af phospholipidklasserne43 , men er meget mere kompleks for DAG'er og TAG'er på grund af det ulige signalrespons fra forskellige FA'er i MS2-spektrene.
Det er også vigtigt at understrege behovet for at gennemføre passende kvalitetskontrolprocedurer, der er i fuld overensstemmelse med de seneste initiativer på dette område44. Da vi ønsker at sikre korrekt datasporbarhed og reproducerbarhed mellem og inden for laboratoriet, er der taget en række skridt, såsom korrekt randomisering af prøverne til alle trin i analysen, arbejde med leverandørcertificerede standardblandinger, inkludering af kvalitetskontrolprøver, procedurer til verifikation af batchaccept eller afvisning og oprettelse af en intern database til sporing af QC-ydeevne på lang sigt. I overensstemmelse med disse initiativer er behovet for en standardiseret metode til håndtering af prøvestabilitet. Generelt påvirkes størstedelen af strukturelle lipider ikke af lipidoxidation, hvilket er mere relevant for oxilipiner, oxiderede lipider og flerumættede fedtsyrer, der derfor er meget mere følsomme over for opbevarings- og håndteringsbetingelser. Den korrekte vurdering af prøvestabilitet er dog stadig en teknisk udfordrende opgave.
Denne protokol har imidlertid en begrænsning, når det kommer til bestemmelse af submolekylære niveauer af forbindelser. I betragtning af at der ikke er nogen adskillelse af det samlede ekstrakt, fusioneres alle isoformer af lipider med samme molekylmasse, men forskellige fedtsyresammensætninger i MS-analysen. For de fleste klasser er det muligt at opnå delvis dekonvolution af strukturen ved at anvende fragmenteringsforholdene mellem resterende fedtsyrefragmenter i MS2. Den uafhængige kvantificering af hver isoform er imidlertid fortsat en særlig udfordrende opgave på grund af de store forskelle i forskellige isoformers fragmenteringsadfærd og det faktum, at rene kemiske standarder ikke er tilgængelige i stor nok variation til at definere kompensationsværdierne. En anden begrænsning er, at ESI-processen uundgåeligt genererer artefakter, hvilket resulterer i kunstig generering af toppe for nogle lipider såsom DAG'er, PA'er og FA'er, hvilket kan føre til fejlagtig kvantificering.
Dernæst opsummerer vi de mest kritiske dele af protokollen baseret på vores erfaring. Den første er relateret til det faktum, at hver musevævstype har en unik lipidprofil med hensyn til både lipidmængden og klasseforholdene. Med dette skal udgangsmængderne af vævet baseret på det samlede proteinindhold før ekstraktion bestemmes omhyggeligt for ikke at mætte MS-signalet og ikke forlade det dynamiske kvantificeringsområde på grund af lipidaggregering ved høje koncentrationer33 eller - i den modsatte ekstrem - for at give tilstrækkeligt MS-signal til at dække de vigtigste lipidforbindelser for hver lipidklasse.
Det andet kritiske aspekt er at sikre en korrekt justering af placeringen af nanokildechipudløbet med massespektrometerets overførselskapillær. I betragtning af at fuld kalibrering af massespektrometeret i begge tilstande udføres ugentligt, kan skift mellem kalibreringskilden og nanokildechipopsætningen være årsagen til dramatisk variation i signalintensitet på grund af forkert justering under installationen.
En anden kritisk del af protokollen er den omhyggelige håndtering af det interne standardmix. Da denne blanding indeholder en betydelig mængde dichlormethan, bør den, når den er åbnet, indtages hurtigt for at undgå lang opbevaring og flere anvendelser, der fører til fordampning og kunstig koncentrationsændring. Desuden er konsekvent håndtering af standardblandingen efter fjernelse fra -20 °C-lagring vigtig, da temperaturforskelle kan føre til volumenuoverensstemmelser under pipetteringen med luftpudepipetter. En mulighed ville være at erstatte dichlormethan i standardresuspensionsbufferen med ren methanol, hvilket kunne forbedre håndteringskomforten, men kunne have en negativ indvirkning på opløseligheden af nogle lipidklasser og dermed mindske kvantificeringsnøjagtigheden for disse lipidklasser.
Den sidste kritiske del er databehandling. Databehandlingsworkflowet kombinerer Peak by Peak-softwarekonvertering fra .raw til .mzML-format, anvender MS2-scanningsgennemsnit og MS1- og MS2-støjfiltrering samt peak picking og datakomprimering. Som et alternativ kan Proteowizard-softwaren også bruges til datakonvertering, men i dette tilfælde skal flere indstillinger i LipidXplorer defineres manuelt. Al kompleksiteten af haglgeværlipidomics er især koncentreret om trinnet med dekonvolution af direkte injektion MS1 og MS2 spektre. Open source LipidXplorer-softwaren importerer de konverterede spektre fra mzML-filformat baseret på massenøjagtighed, masseopløsning og hældningen af dens ændring med stigende m / z. Softwaren fusionerer flere individuelle MS- og MS / MS-spektre erhvervet inden for en analysekørsel. Derefter justerer den individuelle toppe inden for forskellige prøvekørsler, og i hver klynge af justerede toppe erstatter den deres masser med deres enkeltintensitetsvægtede gennemsnitsmasse, mens deres overflod i hver datafil forbliver uberørt. Repræsentative masser af justerede topklynger og individuelle spidsintensiteter gemmes i en masterscanningsdatabase. Masterscanningsdatabasen indeholder alle MS1- og MS2-spektre, der genereres for alle prøver i batchen, og kan dekonvolueres til lipididentifikationer ved forespørgsler skrevet i forespørgselssproget for molekylær fragmentering (MFQL).
Samlet set dækker metoden identifikation af DAG-, TAG- og SE-lipider baseret på positiv tilstand og PC-, PE-, PS-, PI-, PA-, PG-, SM-, LPC- og LPE-lipider baseret på erhvervelse af negativ tilstand. Under lipididentifikation udføres isotopkorrektion for MS1 og MS2, og justerede intensiteter rapporteres i .xlsx-outputfilen. Alternativt er flere andre software tilgængelige til behandling af haglgeværdata, såsom ALEX45 og LipidHunter46.
Fedtsyrer - vigtige nukleare og cellulære membrankomponenter - opbevares i form af fosfolipider til yderligere omdannelse til bioaktive molekyler. De kan omdannes af lysophospholipidacyltransferaseenzymer til lysophospholipider gennem Lands-stien47. LPCAT3-enzymet er for eksempel kendt for at vise høj specificitet for at inkorporere AA i lysophosphatidylcholin og lysophosphatidylserinmellemprodukter. Den relativt høje ekspression af disse enzymer blev rapporteret inden for inflammatoriske celler, såsom alveolære makrofager og bronchiale epitelceller47, hvilket førte til frigivelse af større relative andele af AA-holdige phospholipider i disse celler. Efter deres frigørelse fra membranfosfolipider ved phospholipase A2 katalyseres omdannelsen af PUFA'er til forskellige typer lipidmediatorer imidlertid af mange enzymer48. Endvidere kan disse PUFA'er blive substratet for produktionen af proinflammatoriske og antiinflammatoriske prostaglandiner via virkningen af cyclooxygenase (COX)-1 og COX-2 enzymer47. Fosfolipider er en af kilderne til lipidmediatorer, der frigives på bestemte steder, hvor disse mediatorer skal demonstrere deres biologiske virkninger.
Lungen er et komplekst organ, der består af flere celletyper, der hver spiller overlappende og nicheroller for at lette normal lungeudvikling og funktion. Der er kun udført få undersøgelser for at isolere og profilere forskellige celletyper i mus eller menneskelig lunge (f.eks. alveolære type 2-celler)49,50; Andre større lungecelletyper er ikke blevet karakteriseret. En anden interessant undersøgelse51 blev udført for at isolere og udføre lipidanalyse af endotel-, epitel-, mesenkymale og blandede immunceller i muselungen. Det blev observeret, at koncentrationen af PUFA'er inkorporeret i PCO og PG blev beriget i immuncellerne. I betragtning af det faktum, at CS inducerer en stigning i immunceller i lungen (4-5 gange), som vurderet ved bronchoalveolær skylning (BAL)52, kunne de samlede lipidændringer, der blev observeret i denne undersøgelse, forklares ved en kumulativ stigning i immuncellerekruttering i muselungen.
Afslutningsvis kan den observerede forvrængning af monoumættede fedtsyrer og PUFA'er inkorporeret i fosfolipider afspejle overskuddet af visse FA'er i cellen og / eller udgøre en intracellulær ressource af oxilipinprækursorer, der overproduceres under oxidativ stress og inflammatoriske tilstande. Imidlertid er yderligere data om fri EPA, DHA og andre oxilipiner afgørende for at afklare dette punkt og ligger uden for anvendelsesområdet for den nuværende metodeapplikation.

Cigaretrøg (CS) anerkendes som en vigtig risikofaktor forbundet med udviklingen af kroniske inflammatoriske lungesygdomme, herunder lungekarcinom, bronkitis og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL)1. Ud over lungepåvirkningen spiller CS-eksponering en væsentlig rolle i udviklingen af andre sygdomme såsom aterosklerotisk koronararteriesygdom og perifer vaskulær sygdom1. Hjerte-kar-sygdomme er sammen med KOL henholdsvis den første og tredje førende dødsårsag på verdensplan. Toksikologiske risikovurderingsmetoder har historisk været baseret på brugen af dyremodeller såsom gnavere. In vivo næse-only eller full-body rotte- og musemodeller bruges almindeligvis til at studere de langsigtede virkninger af eksponering for CS.
For eksempel inducerer generelt 6 måneders røgeksponering histologiske og funktionelle abnormiteter i murine lunger, der efterligner dem af menneskelig sygdom, herunder emfysem, luftvejsremodellering og pulmonal hypertension, selvom ændringerne er relativt milde sammenlignet med dem, der observeres hos langsigtede menneskelige rygere2. I både animalsk og humant væv har undersøgelser observeret en lang række molekylære ændringer som reaktion på CS-eksponering, herunder oxidative stressresponser, inflammation og strukturelle vævsændringer 3,4. Ikke overraskende er CS-eksponering også blevet rapporteret at have en vidtrækkende indvirkning på lungelipidomet, herunder virkninger på overfladeaktive lipider, lipidsignalmediatorer og strukturelle lipider 4,5,6.
For at karakterisere de vigtigste lipidændringer induceret af langvarig CS-eksponering af muselunger udførte vi en hurtig og kvantitativ haglgevær-massespektrometrianalyse. Efter introduktionen af shotgun lipidomics-metoden i 20057 er denne metode effektivt blevet brugt til at udvide vores viden om lipidcellulær metabolisme 8,9,10 i modelsystemer som gær 11, Caenorhabditis elegans12 og Drosophila melanogaster13 samt i en lang række pattedyrprøvetyper såsom cellelinjer 14, 15,16 Forskellige humane17,18 og gnavervæv19,20 og kropsvæsker21,22.
I løbet af de sidste årtier har undersøgelser afsløret kompleksiteten af cellulære reaktioner på miljøændringer, der involverer tusindvis af sammenkoblede proteiner, lipider og metabolitter. Dette har gjort det klart, at brug af state-of-the-art analytiske teknikker er afgørende for at få et dybtgående overblik over de molekylære maskiner og for at afdække det fulde omfang af eksogene fysiologiske virkninger. I denne sammenhæng kan de omfattende, kvantitative lipidfingeraftryk, der produceres af shotgun lipidomics-tilgange, effektivt føje til vores viden om lipidcellulær metabolisme 8,9,10.
Med hensyn til CS-eksponering som en risikofaktor for flere sygdomme har toksikologiske risikovurderingsmetoder historisk været afhængige af brugen af dyremodeller såsom gnavere. Shotgun lipidomics MS giver et hurtigt, følsomt og kvantitativt analytisk værktøj til vurdering af lipidomforstyrrelse i adskillige prøvetyper. Det unikke ved haglgeværlipidomics er den automatiserede direkte injektionsanalyse af et samlet lipidekstrakt - spiket med mærkede interne standarder - uden kromatografisk adskillelse i et MS-instrument med høj opløsning ved hjælp af en ledende nanochip, der genererer en elektrosprayionisering (ESI) nanospray23.
Oplysningerne om masse-til-ladningsforhold, der samtidig hentes i MS1-tilstand, giver det samlede lipidfodaftryk for alle intakte endogene lipider. MS2/MS3-tilstanden, hvor moderlipidmolekylerne fragmenteres og analyseres, giver eventuelt yderligere strukturelle oplysninger. Dataanalyse kræver specialiseret software og omfatter dekonvolution af spektre og toptildelinger i poolede spektre, der fører til lipididentifikation og formodet kemisk strukturbelysning. Derudover kan absolut kvantificering udføres ved at spike en mærket intern standardblanding, der indeholder mindst en lipidstandard pr. Lipidklasse af interesse. Samlet set kan MS-analyse, der tager et par minutter pr. prøve, med den nuværende teknik dække identifikation og kvantificering af op til 800 lipider fra 14 lipidklasser24 i gnavervæv.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1, 5, and 2 mL self-lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086, 30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm stainless still beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.1 &#181;m nozzle chip</td>
			<td>Advion</td>
			<td>HD-D-384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>45754-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14267-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;23209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33065-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650498-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34856-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34873-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse pooled plasma</td>
			<td>BioIvt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse SPLASH standard</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>330710X</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-flat bottom well transparent plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62409-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z560049-300EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum diluent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment/software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPrep CP02 impactor instrument</td>
			<td>Covaris</td>
<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Magnetic hammer</td>
			
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChipSoft 8.3</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidXplorer 1.2.8.1</td>
			<td>N/A</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to identify lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak By Peak</td>
			<td>SpectroSwiss</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoWizard</td>
			<td>ProteoWizard</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive MS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>High resolution orbitrap mass spectrometer</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
<td>.&#160; &#160;</td>		
	<td>Tissue lyser</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac SPD140DDA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite M nano plus</td>
			<td>Tecan</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Plate reader</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriVersa Nanomate</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Direct infusion nano-source</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur 4.3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun lipidomics of rodent tissues

Lipider spiller en afgørende rolle som væsentlige komponenter i alle prokaryote og eukaryote celler. Konstante teknologiske forbedringer i massespektrometri har gjort lipidomics til et kraftfuldt analytisk værktøj til overvågning af vævlipidomsammensætninger i homeostatiske såvel som sygdomstilstande. Dette papir præsenterer en trin-for-trin protokol til en haglgeværlipidanalysemetode, der understøtter samtidig påvisning og kvantificering af et par hundrede molekylære lipidarter i forskellige vævs- og biovæskeprøver ved høj gennemstrømning. Denne metode udnytter automatiseret nano-flow direkte injektion af et totalt lipidekstrakt spiked med mærkede interne standarder uden kromatografisk adskillelse i et massespektrometriinstrument med høj opløsning. Fra submikrogram mængder gnavervæv tager MS-analysen 10 minutter pr. prøve og dækker op til 400 lipider fra 14 lipidklasser i muselungevæv. Metoden, der præsenteres her, er velegnet til at studere sygdomsmekanismer og identificere og kvantificere biomarkører, der indikerer tidlig toksicitet eller gavnlige virkninger i gnavervæv.

Her præsenterer vi som repræsentative resultater data, der illustrerer, hvordan haglgeværlipidomics kan bruges til at studere virkningerne af CS på lungerne hos mus. Shotgun-lipidanalyseprotokollen blev med succes anvendt til en in vivo-undersøgelse til sammenlignende analyse af to grupper af prøver: lungevæv dissekeret fra ni kvindelige Apoe-/-mus udsat for CS (3R4F-gruppe; positiv kontrol) og et tilsvarende antal mus opretholdt under friske luftforhold (skingruppe) som negativ kontrol indsamlet efter 3 måneder, 4 måneder og 6 måneders eksponeringstider. Dyrene blev holdt under filtreret og konditioneret frisk luft ved 22 °C ± 2 °C temperatur og 55% ± 15% fugtighed og fodret med en gammabestrålet pelletfoder. Lysregimet blev opretholdt ved 12 timer om dagen. Op til otte mus blev anbragt pr. bur. 3R4F-referencecigaretter til eksponeringsbehandling blev købt fra University of Kentucky for at generere 3R4F CS-aerosolen (600 μg total partikelformet TPM/L-aerosol) til en måleksponeringskoncentration svarende til 28 μg nikotin/L.CS røg fra 3R4F-cigaretter blev fremstillet ved hjælp af 30 roterende rygemaskiner ifølge Phillips et al.27 . Baseret på Health Canada Intensive Smoking Protocol blev 55 ml puffvolumen, et pust pr. 30 s og 100% blokering af ventilationshuller påført 3R4F-cigaretter for at give tilstrækkelig eksponering. Alle yderligere detaljer om undersøgelsens design er tidligere rapporteret27,28.
Samlet set blev ~ 400 molekylære lipidarter fra de 14 mest rigelige lipidklasser identificeret og kvantificeret (figur 3). Den totale normaliserede lipidkoncentration pr. klasse var let forhøjet for PE-, PEO-, PC-, PCO-, PI- og PG-lipidklasserne, og der blev observeret en vis nedregulering for SM-, LPE- og PA-lipider (figur 3A), mens der ikke kunne ses nogen forskel for TAG'er og PS. Interessant nok er forhøjede niveauer af PCO- og PEO-plasmalogenlipider i CS-gruppen blevet rapporteret i inflammatoriske celler29 . En af de intracellulære funktioner af plasmalogen lipider er antioxidantaktivitet. Under eksponering for reaktivt ilt (ROS) og nitrogenarter (RNS) blev selektiv oxidation af plasmalogener sammenlignet med diacylfosfolipider rapporteret30. Enyletherbindingen i plasmalogens kemiske struktur er følsom over for radikale angreb på oxidativt stress31. De vigtigste produkter af radikale angreb er hydroxylerede eicosatetraensyrer, 2-monoacylglycerolphospholipider, pentadecanol, myresyrer, α-hydroxyaldehyder af forskellig kædelængde, 1-formyl-2-arachidonoyl glycerophospholipid og lysophospholipider.
Disse resultater viser, at blandt de molekylære egenskaber baseret på den samlede molekylformel blev 100-120 forbindelser signifikant påvirket af CS-eksponering (figur 3D). Den detaljerede dekonvolution af MS2-fragmenteringsoplysningerne og normaliseringen af fragmentsignalintensiteterne tillod den omtrentlige definition af den samlede mængde af hver konjugeret fedtsyre (FA) repræsenteret i hver lipidklasse (figur 3E) og sammenligning af disse data mellem eksponerede og kontrolgrupper. Et klart fald i både fuldt mættede FA'er og dem med kun få umættede mætninger, hovedsagelig i forbindelse med lyso-lipider, blev observeret. I modsætning hertil blev flerumættede fedtsyrer (PUFA) i sammensætningen af PC-, PE- og PG-phospholipidklasser forhøjet i CS-gruppen for alle tidspunkter. De ekstreme tilfælde af PC og PG konjugeret med eicosapentanoic (EPA) og docosahexaensyre (DHA) blev udelukkende påvist i 3R4F CS-eksponeringsgruppen (figur 3E, rød farve).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig01.jpg"> Figur 1: Pladelayout til prøvefordeling i Bradford-assayet. Blindprøver og standardprøver anbringes i tre eksemplarer i kolonne 1-3; Ukendte prøver placeres i to eksemplarer i kolonne 4-11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig02.jpg"> Figur 2: Pladelayout af 96-brønds mikrotiterpladen til analyse af haglgeværmassespektrometri. Fordelingen af blanke, standard-, ukendte og QC-prøver til erhvervelse i positiv ioniseringstilstand er kortlagt på venstre side af pladen (kolonne 1-6); Alle prøver til den negative ioniseringstilstand er placeret til højre (kolonne 7-12). Forkortelser: pos = positiv; QC = kvalitetskontrol; neg = negativ; TB = total blank. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig03.jpg"> Figur 3: Shotgun lipidomics analyse af muselunger udsat for cigaretrøg. Apoe-/-mus blev udsat for CS fra 3R4F-referencecigaretten eller frisk luft (humbug). (A) Lipidklassekoncentrationer og antallet af lipidarter pr. klasse. For hver klasse er antallet af kvantificerede lipidarter angivet i parentes. Gennemsnitlige og 95% konfidensintervaller for hver lipidklasse, separat for hver eksponeringstype (aggregeret over tre tidspunkter). (B) Vulkandiagrammer, der viser effektstørrelsen (log2 fold ændring) og signifikans (-log10 FDR-justeret p-værdi) af de kvantificerede lipidarter for 3R4F CS versus sham sammenligning på de tre tidspunkter. Signifikant forhøjede lipider er markeret med gult; signifikant nedsatte lipider er markeret i cyan (FDR-justeret p-værdi < 0,05). (C) Differentiel tæthed af de 25 lipidarter med de største absolutte gennemsnitlige foldændringer. Log2-foldændringer for 3R4F CS versus skin-sammenligningen er farvekodede, og statistisk signifikans er angivet: *: FDR-justeret p-værdi < 0,01; X: FDR-justeret p-værdi < 0,05. (D) Sammenligningsområder. Korrelationskoefficienter for foldændringssammenligningerne er farvekodede, og antallet af delte differentielt rigelige lipider er angivet (samlede tal i margenerne). Cirkeldiagrammer viser procentdelen af delte differentielt rigelige lipider med samme ændringsretning (FC-tegn). Stjerne angiver en signifikant overlapning af de differentielt rigelige lipider. (E) Differentiel forekomst af konjugerede FA'er pr. lipidklasse. Heatmap som i panel C for konjugerede fedtsyrer med signifikante tæthedsforskelle mellem 3R4F og skineksponering i alle tre tidspunkter (FDR-justeret p-værdi < 0,05). Mængden af hver fedtsyre pr. lipidklasse blev estimeret ud fra MS2-intensiteterne af fedtsyrefragmenterne. Forkortelser: CS = cigaretrøg; FDR = falsk opdagelsesrate; FC = fold ændring; FA = fedtsyrer; PC = phosphatidylcholin; PS = phosphatidylserin; TAG = triacylglycerol; SM = sphingomyelin; PEO = plasmalogenphosphatidylethanolamin; PE = phosphatidylethanolamin; PG = phosphatidylglycerol; PI = phosphatidylinositol; DAG = diacylglycerol; SE = sterol/cholesterylestere PCO = plasmalogenphosphatidylcholin; LPC = lysophosphatidylcholin; LPE = lysophosphatidylethanolamin; PA = phosphatidsyre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>BSA-slutkoncentration (mg/ml)</td>
			<td>BSA-opløsning ved 2 mg/ml (μL)</td>
			<td>Ammoniumbicarbonatbuffer (μL)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0.75</td>
			<td>37.5</td>
			<td>62.5</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>25</td>
			<td>75</td>
		</tr><tr><td>0.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>87.5</td>
		</tr><tr><td>0.125</td>
			<td>12.5</td>
			<td>187.5</td>
		</tr><tr><td>0.0625</td>
			<td>50 af 0,125 mg/ml opløsning</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Fortyndingsskema for BSA's interne standard for kalibreringskurven for Bradford-assayet. Forkortelse: BSA = bovin serumalbumin.
Supplerende oplysninger: MFQL-filer, der bruges til LipidXplorer lipididentifikation. Den .zip pakke består af de individuelle krævede MFQL-filer, der hver især er navngivet efter dette mønster: <lipidklasseforkortelse>_<ioniseringstilstand>_MS2.mfql (f.eks. PE_neg_MS2.mfql). Filnavnene til mærket intern standardidentifikation inkluderer D7 (D9) -mærket i <lipidforkortelsen> (f.eks. PED7_neg_MS2.mfql). Disse MFQL filer bruges til at verificere mængden af deuterium i den interne standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/-_Supplementary%20Information%20JoVE%20Review.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues at JoVE.com

Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

Shotgun massespektrometri-baseret lipidomics leverer et følsomt kvantitativt øjebliksbillede af et bredt spektrum af lipidklasser samtidigt i en enkelt måling fra forskellige gnavervæv.

Shotgun lipidomics af gnavervæv

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...

Den præsenterede protokol gør det muligt at kvantificere en bred vifte af lipid i dyrevæv. Det er et nemt værktøj til at studere lipidmekanismer og også til at identificere biomarkør, der indikerer tidlig toksicitet i dyremodeller. Metoden leverer en kvantitativ profil af mere end 400 molekylære lipider i 14 forskellige lipidklasser i en bred vifte af prøvematricer med en 10-minutters trendtid pr. prøve.Til at begynde med fortyndes alikvote 1 supernatant to gange koncentrationen med ammoniumbicarbonatbuffer. Efter fremstilling af standardkurven for bovin serumalbumin hvirvel standardrørene og centrifugeres rørene ved 18.200 g i 15 sekunder ved stuetemperatur. Fra de tidligere fremstillede standardrør overføres 6 mikroliter hver af emnerne, standarderne og prøverne til en 96-brønds fladbundet plade.Derefter tilsættes 250 mikroliter Bradford-reagenset til hver brønd ved hjælp af en flerkanalpipette og blandes. Efter inkubation i 5 minutter måles absorbansen ved en bølgelængde på 595 nanometer ved hjælp af en pladelæser. Forbered 2 ml rør med 100 mikroliter ammoniumbicarbonatopløsning i hvert rør af den samlede blindprøve og interne standardblindprøve, og opbevar alle prøver på is.Forbered kvalitetskontrolprøver, idet der tages hensyn til, at en kvalitetskontrolprøve placeres mellem hvert sæt på 10 prøver. Tilsæt 10 mikroliter poolet humant plasma til 2 ml rør, og spids derefter 10 mikroliter intern standardopløsning i alle interne standardemner, kvalitetskontrol og undersøgelsesprøver. Tilsæt 300 mikroliter minus 20 grader Celsius butanol methanolblanding til hver prøve og ryst ved 450 g i 10 minutter ved stuetemperatur på termomixer.Derefter tilsættes 300 mikroliter heptanethylacetatblanding og rystes ved 450 g i 10 minutter ved stuetemperatur på termomixeren, tilsæt derefter 300 mikroliter 1% asketisk syreblanding og ryst i 5 minutter ved 450 g ved stuetemperatur på termomixeren. Centrifuger ved 2.800 g i 5 minutter ved stuetemperatur og overfør 360 mikroliter af den øvre fase til et nyt 2 ml selvlåsende rør mærket som 2. Efter tilsætning af 320 mikroliter heptanethylacetat til vandfaserøret mærket som 1, rystes ved 450 g i 5 minutter ved stuetemperatur på termomixeren og centrifugeres derefter ved 2.800 g i 5 minutter ved stuetemperatur som tidligere vist.Overfør 320 mikroliter af den øvre fase og kombiner dem med fraktionen fra det foregående trin i rør 2. På samme måde tilsættes 250 mikroliter heptanethylacetat til vandfasen i rør 1 og rystes ved 450 g i 5 minutter ved stuetemperatur på termomixeren. Centrifuger igen ved 2.800 g i 5 minutter ved stuetemperatur, overfør derefter 200 mikroliter af den øvre fase og kombiner den med fraktionerne fra de foregående trin i rør 2.Inddamp til tørhed ved 35 grader Celsius i en vakuumkoncentrator og opløs igen i 300 mikroliter MS-blandingsopløsning. Vortex hvert rør i 5 sekunder for at sikre, at alt er opløst og centrifugeres ved 18.200 g i 5 minutter ved 4 grader Celsius. Overfør en prøve på 50 mikroliter til mikroliterpladen til analyse af positiv ioniseringsmodus og fortynd med 50 mikroliter MS-blandingsopløsning.Fortynd igen med 80 mikroliter MS-blanding og overfør en prøve på 20 mikroliter til MTP-pladen til negativ ioniseringstilstandsanalyse. Pak pladen ind med folie og opbevar ved 4 grader Celsius før analysen. Der kalibreres en MS både i positiv og negativ tilstand i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger 5 dage eller mindre før analysen.Installer nanokilden til direkte infusion på forhånd, og sørg for, at den er korrekt justeret mod MS's overførselskapillær og en 4,1 mikrometer dysechip i chipholderen, og kontroller derefter parametrene for positiv og negativ infusion svarende til et gastryk på 1,25 psi, kildespænding på 1,1 kilovolt, 5 mikroliter prøveinjektionsvolumen, output kontakt lukning Rel1 i 2,5 sekunder, 5 minutters leveringstid, pladekøling ved 4 grader Celsius, opsæt derefter temperaturregulatoren og opret en ny plade. For positiv tilstand skal du kontrollere og indstille software, at MS-metoden er konfigureret med en kapillærtemperatur på 250 grader Celsius og S Lens RF-niveau på 65,0. I Xcalibur-softwaren skal du åbne den positive metode og kontrollere, at MS-erhvervelsen med fuld scanning er indstillet fra nul til 1 minut i området 550 til 1.000 m / z ved 140.000 opløsning med automatiseret forstærkningskontrol på 1 million og maksimal injektionstid på 50 millisekunder.Anvend låsemasse på 680.48022. Kontroller, at den datauafhængige MS / MS-indsamlingsmetode er konfigureret mellem tidsintervallet 1 og 5 minutter ved 17.500 opløsning med en fast første masse på 250 m / z. Kontroller, at den automatiske forstærkningskontrol for MS2 er indstillet til 100.000 og en maksimal injektionstid på 64 millisekunder, en kollisionsenergi på 20 NCE, isolationsvinduet ved 1 m / z, og at en inklusionsmasseliste fra 398 til 1.100 m / z bruges med et massetrin på 1 Dalton.For erhvervelse i negativ tilstand skal du kontrollere tune-softwaren, at MS-metoden er konfigureret med kapillærtemperaturen ved 250 grader Celsius i S-objektivets RF-niveau ved 65,0 i MS-tunefilen. Dernæst skal du i Xcalibur-softwaren kontrollere, at fuldscanningsoptagelsestilstanden er indstillet fra nul til 1 minut ved 140.000 opløsning, der dækker området 400 til 940 m / z, automatiseret forstærkningskontrol på 1 million, maksimal injektionstid på 200 millisekunder og en låsemasse på 526.46262. Kontroller, at MS2-erhvervelsen i DIA-tilstand er konfigureret mellem 1 og 5 minutter af kørslen ved en opløsning på 17.500 med en fast første masse på 150 m / z, automatiseret forstærkningskontrol på 100.000, 64 millisekunder maksimal injektionstid og 35 NCE kollisionsenergi ved hjælp af inklusionsmasselisten fra 400 til 940 med et massetrin på 1 Dalton.Opret analysesekvenskøen i Xcalibur-softwaren i positiv tilstand, og udløs den, opret derefter sekvensen i ChipSoft-softwaren, og start analysen, mens du venter på, at prøveanskaffelsen udløses af et kontaktlukningssignal, der kommer fra den direkte infusionsrobot for hver prøve. Når analysen i positiv tilstand er fuldført, skal du oprette analysesekvenskøen i Xcalibur-softwaren i negativ tilstand og udløse den, derefter oprette sekvensen i ChipSoft-softwaren og starte analysen, mens du venter på, at prøveanskaffelsen udløses af et kontaktlukningssignal, der kommer fra den direkte infusionsrobot for hver prøve. Den samlede normaliserede lipidkoncentration blev identificeret og kvantificeret fra de 14 mest rigelige lipidklasser, som var lidt forhøjet for PE-, PEO-, PC-, PCO-, PI- og PG-lipidklasserne, og der blev observeret en vis nedregulering for SM-, LPE- og PA-lipider.Mens der ikke kunne ses nogen forskel for TAG'er og PS. Disse resultater viser også, at blandt de molekylære egenskaber baseret på den samlede molekylformel blev 100 til 120 forbindelser signifikant påvirket af cigaretrøgeksponering. Dekonvolutionen af MS2-fragmenteringen og normaliseringen af fragmentsignalintensiteterne tillod den omtrentlige definition af den samlede mængde af hver konjugeret fedtsyre repræsenteret i hvert lipidglas og sammenligning af disse data mellem eksponerede og kontrolgrupper. Et fald i fuldt mættede og få umættede fedtsyrer blev observeret, mens de flerumættede fedtsyrer i sammensætningen af PC-, PE- og PG-fosfolipidklasser var forhøjet i cigaretrøggruppen for alle tidspunkter.De ekstreme tilfælde af PC og PG konjugeret med eicosapentaensyre og docosahexaensyre blev udelukkende påvist i 3R4F CS-eksponeringsgruppen. Pipettering af prøven og QC-prøven skal udføres med lavbåndsspidser og for at være nøjagtige, hvilket betyder, at spidserne skal kontrolleres mellem hver prøve. Pietteringen af den interne standardopløsning er kritisk og skal være nøjagtig.Opløsningen af 1 til 1 dichlormethanmetanol skal håndteres med forsigtighed, og der skal anvendes et ikke-blødgøringsmiddel indeholdende spidser for at undgå plastpolymerer i prøverne. Spidserne skal skiftes mellem hver prøve.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

En metode til måling af RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Ændringer i celler og væv

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Forbedret Prøve Multiplexing af væv under anvendelse kombinerede Precursor isotopmærkning og isobar Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS for Indgående Karakterisering og Kvantificering af glutamin og asparagin deamidering i Shotgun Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolering af Intermediate Filament Proteiner fra Multiple Musvæv til Studie Aging-associerede Post-translationelle Modifikationer

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid væv farves med selvlysende konjugeret Oligothiophenes af Hyperspectral Konfokal mikroskopi og fluorescens levetid Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Leaf Spray massespektrometri: En hurtig omgivende ionisering teknik til direkte vurdere metabolitter fra plantevæv

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi til High Throughput påvisning af lav affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robust sammenligning af Protein niveauer på tværs af væv og udvikling ved hjælp af standardiserede kvantitative Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Kvantificering af coenzym A i celler og væv

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Berigelse af pattedyrvæv og Xenopus Oocytter med kolesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...